高通量多参数免疫细胞接合物筛选测定的制作方法

高通量多参数免疫细胞接合物筛选测定
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年9月27日提交的美国临时专利申请第63/083,969号的优先权权益，该美国专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本技术涉及用于测试免疫细胞接合物分子和潜在免疫细胞接合物分子的高通量测定的方法和系统。在一些实施例中，可从测定中的相同样品分析例如与免疫细胞诸如t细胞对肿瘤细胞的接合相关以及与肿瘤细胞死亡相关的多个参数，并且在一些情况下，可同时进行分析。在一些实施例中，该方法和系统允许用于确定各种参数的动力学。


背景技术：

4.免疫细胞接合物包括可以使免疫细胞接近目标要破坏的细胞的分子，例如，经由与每种类型细胞上的细胞表面分子结合及作为使两种细胞类型结合在一起的桥梁。接合物与免疫细胞和靶细胞的结合可能会产生人工免疫突触。这过程可能独立于正常的主要组织相容性复合体(mhc)依赖机制，免疫细胞经由该机制识别并杀伤其靶细胞。
5.有多种测定可用于评估潜在免疫细胞接合物分子的活性。例如，细胞死亡可在发光测定中经由使用某些核荧光染色或测量的atp活性损失来测量，细胞凋亡可经由使用染色来测量，其信号取决于细胞凋亡因子(例如半胱天冬酶)的存在。还可测量系统中的相关变化，例如各种蛋白质(例如细胞因子)的浓度。然而，这些测定依赖于不同的标志物组和分析方法。


技术实现要素：

6.本公开包括用于测定可作为免疫细胞接合物的分子的方法和系统，例如，用以确定其对于免疫和肿瘤细胞的接合以及肿瘤细胞死亡相关的多个参数的影响。本公开的方法可在小体积材料上进行，可动态地追踪各种参数，可动态地对一个小体积样品(例如来自多孔板的孔)进行不同参数的不同分析，并且可允许平行地运行数百个样品。因此，其允许对各种细胞培养系统或类型中的许多免疫细胞接合物分子进行高通量分析。
7.本公开的示例性方法包括，例如：
8.一种测定潜在免疫细胞接合物的活性的方法，其包括在至少一个潜在免疫细胞接合物存在下，将免疫细胞(例如t细胞或nk细胞或pbmc)与靶细胞(诸如肿瘤或原代细胞)共培养，以及测定以下参数中的至少一个：(i)靶细胞的死亡，例如基于核染色的丧失，(ii)靶细胞的细胞凋亡，例如基于细胞的半胱天冬酶3/7依赖性标志物，(iii)atp浓度的变化(例如，在cell titer测定，其使用发光标志物)；以及(iv)来自共培养物上清液的至少一个分析物的浓度变化，诸如细胞因子、t细胞活化因子或趋化因子。在一些实施例中，细胞可在例如多孔板(例如96或384孔板)上共培养，任选地其中靶细胞(例如肿瘤或原代细胞)用染料染色，例如其中细胞以核荧光蛋白稳定转染，例如，使用慢病毒载体，或使用其他转
染系统。在一些实施例中，先培养靶细胞，然后加入免疫细胞。在一些实施例中，先培养免疫细胞，然后加入靶细胞。在一些实施例中，靶细胞和免疫细胞与至少一个潜在免疫细胞接合物一起孵育一段时间，诸如至少18小时，或至少24小时。在一些实施例中，例如，某些参数可在2小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时或更多小时后测定。在一些实施例中，进行一次以上的一或多个测定(i)至(iv)，例如每2小时、4小时或6小时。在其他情况下，可以连续地监测某些参数，例如使用自动成像设备，例如细胞板成像仪。在一些实施例中，可确定细胞死亡、细胞凋亡活性和/或atp和细胞因子浓度变化的动力学。
9.在一些实施例中，细胞在细胞板或类似结构的孔中共培养，例如，使其可在板成像设备中被监测。在一些情况下，肿瘤细胞以例如1000-50,000个细胞/孔、5000-30,000个细胞/孔(例如5000-20,000个细胞/孔、或8000-15,000个细胞/孔、或8000-12,000个细胞/孔)，或5000个细胞/孔、7000个细胞/孔、8000个细胞/孔、9000个细胞/孔、10,000个细胞/孔、11,000个细胞/孔、12,000个细胞/孔或15,000个细胞/孔铺板。在一些实施例中，细胞以例如5-50μl/孔、10-50μl/孔、20-50μl/孔、20-40μl/孔、20-30μl/孔、30-50μl/孔、30-40μl/孔、25-35μl/孔、10μl/孔、20μl/孔、25μl/孔、30μl/孔、35μl/孔或40μl/孔铺板。例如，在一些实施例中，免疫细胞可以例如1000-50,000个细胞/孔、例如10,000-40,000个细胞/孔、10,000-30,000个细胞/孔、5000-20,000个细胞/孔或8000-15,000个细胞/孔，或8000-12,000个细胞/孔，或5000个细胞/孔，7000个细胞/孔，8000个细胞/孔，9000个细胞/孔，10,000个细胞/孔，11,000个细胞/孔，12,000个细胞/孔或15,000个细胞/孔铺板。在一些实施例中，免疫细胞以例如5-50μl/孔、10-50μl/孔、20-50μl/孔、20-40μl/孔、20-30μl/孔、30-50μl/孔、30-40μl/孔、25-35μl/孔、10μl/孔、20μl/孔、25μl/孔、30μl/孔、35μl/孔或40μl/孔添加。在一些情况下，靶细胞(例如肿瘤或原代细胞)的数量和/或每孔或每个样品的免疫细胞数量可以变化。细胞数量和体积可以变化，例如，取决于细胞的生长速度。
10.在一些情况下，靶细胞为肿瘤细胞。肿瘤细胞可源自肿瘤细胞系。在其他情况下，其可来自供体。肿瘤细胞可来自多种人类或哺乳动物癌症中的任何一种。在某些情况下，靶细胞为原代细胞。在某些情况下，免疫细胞为t细胞(例如泛t细胞、cd8+t细胞、cd4+t细胞)。在其他情况下，免疫细胞为pbmc细胞。在其他情况下，免疫细胞可为t细胞与其他类型细胞(例如b细胞和/或nk细胞)的混合物。在某些情况下，免疫细胞可为nk细胞。
11.在一些实施例中，本发明包括对潜在免疫细胞接合物进行多重分析的方法，以及在一些实施例中，从一板细胞中进行分析，并且在一些实施例中，使用相对少量的材料，并且在一些实施例中，大部分或所有步骤经自动化。例如，在某些情况下，可在短时间内(例如，在数个板中)进行数百次筛选，允许对多个不同参数(例如与肿瘤细胞死亡和细胞凋亡相关的参数以及细胞因子浓度的变化)进行动力学测定。
12.在某些情况下，潜在免疫细胞接合物为一种分子，其与免疫细胞和肿瘤细胞的接合能力未知且待评估。在其他情况下，分子是已知的免疫细胞接合物，并且测定系统用于例如确定该分子是否对特定类型的肿瘤细胞或来自一个或多个特定供体的免疫细胞有反应。
13.在一些实施例中，待测定的潜在免疫细胞接合物包括抗体，例如结合至免疫细胞(例如t细胞)上的靶标和靶细胞(例如肿瘤细胞)上的靶标的多特异性或双特异性抗体。例如，在一些实施例中，抗体为潜在t细胞依赖性双特异物(tdb)，其可结合至t细胞上的靶标
(例如cd3)以及肿瘤细胞上的靶标(例如，表现在肿瘤细胞上的靶标)。在一些实施例中，抗体为潜在共刺激受体双特异性(crb)抗体，其可结合至t细胞上的共刺激靶标(例如cd28或icos)，以及结合至肿瘤细胞上的靶标。在一些实施例中，可测定潜在tdb或潜在crb。在一些实施例中，本文的测定可评估潜在tdb和crb的组合。在一些实施例中，与肿瘤和免疫细胞上的靶标结合的潜在免疫细胞接合物可包含非抗体或可为抗体与其他分子的缀合物。下方提供在免疫细胞及肿瘤细胞上的免疫细胞接合物的靶标的更多例示
14.在一些实施例中，本文的方法可用于确定分子是否作为免疫细胞接合物；因此，测试的分子可能是潜在免疫细胞接合物。在一些实施例中，可用已知的免疫细胞接合物进行本文的方法，但可进行这些方法以确定该已知的免疫细胞接合物的效力，或确定其在特定免疫细胞或肿瘤细胞存在下如何起作用，或确定其动力学，或确定其效力，或这些因子中的多于一个。在一些情况下，可进行本文的方法以确定免疫细胞接合物如何与不同类型的免疫细胞或来自不同个别供体的免疫细胞相互作用。在一些情况下，本文的方法可用于比较不同的潜在免疫细胞接合物或免疫细胞接合物的组合。
15.本公开还涉及用于执行上述方法的系统。在一些实施例中，系统包括以下中的一者或多者：自动化细胞铺板装置、声控液体分配器，例如，用于向孔中加入免疫细胞和/或潜在免疫细胞接合物、用于监测细胞上的荧光标记的细胞板成像装置以及用于确定孔中细胞因子浓度的阵列或珠粒。
16.前述一般描述及以下详细描述都仅为示例性及说明性的，且不限制权利要求。并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图图解说明某些实施例，且与本说明一起可用于阐释本文所阐述的某些原理。
附图说明
17.图1示出本文所进行的测定的示例性高通量、多参数、自动化系统的示例性工作流程。
18.图2示出用于铺板细胞的细胞密度的示例性优化。
19.图3a-3e示出加入免疫细胞和t细胞依赖性双特异性抗体(tdb)后，肿瘤细胞的荧光随时间的变化，反映肿瘤细胞的杀伤和细胞凋亡。图3a示出加入免疫细胞和tdb后，在1或3天后核荧光强度(nuclight
tm
)的量。图3b示出为3d球体(白色)和经cytolight
tm
染色的免疫细胞(深灰色)的共培养肿瘤细胞，在有tbd(上排)或没有tbd(下排)的情况下孵育一段时间(由左图至右图)。图3c示出微孔384孔板中的一个86,400亚孔中的单细胞杀伤活性，显示单个肿瘤细胞染色和半胱天冬酶3/7荧光标记点。图3d示出在存在免疫细胞和免疫细胞接合物的情况下，肿瘤细胞中核荧光染料和半胱天冬酶3/7依赖性荧光染料的强度变化作为靶细胞计数(图3d)及作为靶细胞杀伤百分比(经标准化)(图3e)。
20.图4a-4f所提供的数据显示与肿瘤细胞的接合和杀伤相关的其他参数，例如终点杀伤和细胞因子浓度的变化。图4a示出在具有2个不同tdb(nlr 4d5和nlr 2c4)的4个不同细胞系(bt474、ncih292、cov413b和cov362)中，基于代谢(atp)读数的肿瘤细胞杀伤。图4b、4c和4d分别显示，与非肿瘤靶标对照tdb(下曲线)相比，取自孔的上清液中il-6、ifng和il-2浓度的变化(上曲线)。图4e和4f示出经60nm tdb处理的具4种不同tbd的2种分析物(il-6和il-2)随时间推移的mfi信号。
21.图5示出自384孔中分离的免疫细胞经流式细胞术所确定的cd8+cd69+t细胞百分比。
22.图6a-6b示出与tdb和crb孵育后细胞群的差异。图6a示出在tdb的高(黑圈)剂量和低(空心圈)剂量下，在单独tdb或tdb与crb的组合的共培养细胞上清液中，颗粒酶b、il-10、mip1b、ifnγ、il-2、tnfα的浓度差异。图6b左图示出在没有tdb和有tdb的情况下孵育1天和3天后，cd8+和共刺激受体+(costim+)t细胞百分比的差异，而右图显示在有或没有tdb 1天和3天后，cd8+cd25+t细胞(teff)的百分比。
23.图7a-7f示出亲和力和动力学数据。图7a示出结合至her2的不同tdb是以近端(p)或远端(d)方式并以高(hi)或低(lo)亲和力结合至cd3的示意图。图7b提供tdb的各个抗her2或抗cd3臂的相对亲和力。图7c提供2个tdb的动力学曲线，显示经更高亲和力的tdb处理，损失更多细胞。图7d示出将2个tdb的动力学曲线转换到剂量反应曲线。图7e示出对2个tdb杀伤50％肿瘤细胞所需时间的计算，表示其具有不同的杀伤率。图7f示出由7e中的％细胞溶解曲线所产生的剂量反应曲线。
24.图8a-8g示出与细胞杀伤活性相关的数据。图8a示出crb与固定量的tdb共给药的滴定。较深的曲线代表crb对tdb的较高相对浓度。图8b示出不同处理浓度的kt50率的计算。图8c示出来自各个曲线所计算的drc。图8d示出将crb滴定成3个固定浓度的tdb的靶细胞杀伤百分比(经标准化)。图8e示出将tdb滴定成4个固定crb浓度的靶细胞杀伤百分比(经标准化)。图8f示出，如实例中所述，在nuclight
tm
red测定中的最大百分比肿瘤细胞杀伤活性与在半胱天冬酶3/7测定中的最大百分比活性之间的相关性。图8g示出在nuclight
tm
red测定中的最大百分比活性与在cell titer测定中的最大百分比活性之间的相关性。
25.图9a-9d示出加入tdb 6小时、24小时和72小时后，来自孔的上清液中某些分析物浓度的变化(图9a
–
ifnγ；图9b
–
颗粒酶b；图9c
–
il2；和图9d
–
il6)。每个图中的单独曲线代表具有不同tdb克隆的数据。
26.图10示出基于多个数据读数将各种crb克隆和对照进行排序的热图，例如细胞杀伤的kt50和各种细胞因子浓度的变化。在与cd8+t细胞孵育72小时后分析细胞因子。
27.图11a-11d示出在与靶细胞以及有或没有tdb情况下孵育1或3天后，来自四个供体的免疫细胞中的t细胞亚群随时间增加。图11a cd8+t细胞；图11b t效应细胞(teff)；图11c记忆t细胞(tcm)；和图11d效应细胞对记忆细胞的比率(teff/tcm)。
28.图12a-12e提供来自图11的两个供体(供体1和3)的进一步数据。图12a示出在加入和未加入tdb的情况下，供体1和3在cd8+t细胞增生的差异。图12b和图12c示出两种供体的细胞杀伤率随crb浓度增加的比较，并且图12d和图12e示出对应于图12b和c中数据的剂量反应曲线。
29.图13a-13f示出多个读数的相关性。图13a是在靶细胞和cd8+t细胞或pbmc存在下，比较两种不同crb分子的ec50。图13b示出在靶细胞和cd8+t细胞存在下，几个不同crb克隆的kt50相对于最大活性％。图13c示出与cd8+t细胞的各种crb克隆的颗粒酶b相对于最大活性％。图13d是在crb和cd8+t细胞或pbmc存在下，比较her2dtdb和her2p tdb(见图7)的ec50。图13e示出在几个crb克隆存在下，cd8+t细胞相较于泛t细胞的最大活性％之间的比较。图13f是在几个crb克隆存在下，比较ifnγ相较于cd8+t细胞的最大活性％。
30.图14a-14c示出各种tdb克隆基于其随时间推移的杀伤和细胞因子的特征的t分布
随机邻近嵌入(t-sne)机器学习算法聚类分析(图14a 6小时、图14b 24小时和图14c 72小时)以鉴别独特tdb。
具体实施方式
31.定义
32.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数术语包括多个指代物。
33.在本技术中，除非另有说明，否则所用的“或”是指“和/或”。在多项从属权利要求的背景中，所用的“或”仅以替代形式重新提及多于一个前述独立或从属权利要求。同样，除非另有具体说明，否则诸如“要素”或“组分”等术语涵盖包含一个单元的要素和组分以以及包含多于一个子单元的要素和组分两种情况。
34.如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括于所引述范围及(在适当时)其分数部分(诸如整数的十分之一和百分之一)内的任何整数值。
35.单位、前缀和符号以其国际单位制(syst
è
me international de unite，si)认可的形式来表示。数值范围包括定义该范围的数字。本文所提供的标题并不限制本公开的各个方面，这些方面可参照整体说明书来获得。因此，下文即将定义的术语参照说明书全文来更全面地定义。
36.应理解，除非另有说明，否则根据本公开所用的下列术语具有下列含义：
37.用于培养细胞的“板”或“细胞板”是指允许培养细胞和观察细胞上的标志物(例如荧光染料)的任何类型的结构。通常，细胞板含有一个或多个“孔”，有时多达96个或384个孔，这些孔是板上可使试剂保持特定浓度的区域，因而其不会与其他孔的内容物混合。为此目的，孔可为任何合适的结构。
[0038]“免疫细胞接合物”是指能够增强免疫细胞与靶细胞(例如肿瘤细胞或原代细胞)相互作用的分子，从而免疫细胞可引起靶细胞的细胞死亡或细胞凋亡。在某些情况下，免疫细胞接合物与免疫细胞上的靶分子结合，也与靶细胞上的靶分子结合。免疫细胞接合物可单独作用，或可经由一个或多个共刺激分子(例如某些细胞表面受体)发挥作用。在某些情况下，免疫细胞接合物是蛋白质，例如抗体。在一些情况下，其为双特异性分子，例如双特异性抗体，例如识别免疫细胞表面上的靶分子和靶细胞(例如肿瘤细胞)表面上的另一种靶分子的双特异性抗体。如本文所用，“靶分子”是指免疫细胞接合物旨在结合的细胞表面上的蛋白质或其他分子，例如细胞表面受体。
[0039]“潜在免疫细胞接合物”包含免疫细胞接合物以及在本文的测定中被测试以确定其是否为免疫细胞接合物的分子。
[0040]
本文中的术语“抗体”以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出预期抗原结合活性即可。本文中的抗体还包括，例如，包含全长抗体的抗原结合部分的抗原结合片段，例如一组重链和轻链互补依赖区(cdr)和周围的框架区，或重链和轻链可变区。示例性抗原结合片段包括fab’、f(ab’)2、fv、scfv和相关片段。
[0041]
如本文所用，“双特异性”免疫细胞接合物(例如双特异性抗体)能够结合至至少两个不同抗原或靶分子。双特异性抗体可具有任何合适的结构形式。已知双特异性抗体形式的实例包括例如双体抗体、crossmab、triomab、dvd-igg、2合1-igg、邻-fab igg、igg-scfv、scfv2-fc、dart、dart-fc、双纳米抗体、tbti、scfv-fc、tandab、邻fab-igg、dnl-fab3等。(参见，例如，r.e.kontermann&u.brinkmann,bispecific antibodies,drug disc.today,20(7):838-847(2015)。)例如，与t细胞上的至少一种靶分子结合并且也可以作为免疫细胞接合物或作为增强免疫细胞接合的双特异性抗体，包括例如tdb和crb。
[0042]“t细胞依赖性双特异性”抗体(tdb)是免疫细胞接合物，其可经由与每种类型细胞的细胞表面靶标结合，以造成免疫细胞和肿瘤细胞的相互作用。在一些情况下，经由将两种细胞类型结合在一起，tdb可活化t细胞，例如，在没有共刺激并且独立于主要组织相容性复合体(mhc)的情况下，从而绕过正常的两步骤t细胞活化机制。
[0043]“共刺激受体双特异性”抗体(crb)可与免疫细胞(如t细胞)上的共刺激靶标结合(例如cd28或icos)，也可与肿瘤细胞表面的靶分子结合。在一些实施例中，crb可增强和扩展tdb功能。在一些实施例中，可以单独或一起测定潜在tdb和crb。
[0044]
如本文所用，术语“细胞”以最广泛的意义使用并且包括真核细胞、植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、鸟类细胞、鱼细胞等、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等)、从组织(如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)分离的细胞、免疫细胞(如t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等)、胚胎(例如受精卵)、卵母细胞、卵子、精细胞、杂交瘤、经培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、经感染细胞、经转染和/或转化细胞、报道细胞等。哺乳动物细胞可来自例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。如本文所用，“免疫细胞”包括例如成熟和未成熟形式的t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞和单核细胞。如本文所用，“肿瘤细胞”包括例如从个体的肿瘤生检所获得的细胞，以及来自经培养的癌细胞系的细胞，并且可来自任何类型的癌症。如本文所用，“靶细胞”是指可被免疫细胞靶向破坏的细胞，例如经由细胞凋亡或其他方式。在某些情况下，靶细胞可在被免疫细胞结合或识别时或之后被杀伤或诱导细胞凋亡。在一些实施例中，靶细胞可为肿瘤细胞，可为原代细胞，和/或可源自永生化细胞系的细胞。
[0045]
当在本文中铺板细胞时，除非另有说明，细胞被“均匀地”铺板。细胞的“均匀”铺板代表细胞铺板而使在细胞板的每个孔中发现基本上相同数量的细胞和相同体积，具有最小团块以容易地比较不同的孔。
[0046]
在一些实施例中，例如细胞、原代细胞、肿瘤细胞或免疫细胞的样品可从个体或受试者(即供体)获得。在一些实施例中，供体为人类。然而，在一些实施例中，供体也可为另一哺乳动物，诸如家养或家畜物种(例如狗、猫、兔、马、猪、牛、山羊、绵羊等)、或实验室动物(诸如小鼠或大鼠)。
[0047]
在一些实施例中，肿瘤细胞可源自特定“癌症”或疑似“癌症”。本文中的癌症可包括例如实体瘤，其包括源自身体组织细胞的肿瘤。在一些实施例中，癌症可为例如乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、食道癌、胆道肿瘤、脑癌(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌(包括肾细胞癌)、肝癌(肝肿瘤)、肾上腺癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、唾液腺癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、淋巴癌、卵巢癌、胰脏癌、膀胱癌、皮肤癌(例如黑素瘤)或尿道癌。
[0048]
示例性方法
[0049]
本文的示例性方法包括，例如，测定潜在免疫细胞接合物的活性的方法，其包括：(a)在至少一个潜在免疫细胞接合物存在下，将靶细胞与免疫细胞共培养，以及(b)测定以下参数中的至少一个：(i)靶细胞的死亡，(ii)靶细胞的细胞凋亡，(iii)atp浓度的变化，以及(iv)来自共培养细胞的上清液中至少一种分析物的浓度变化。在某些情况下，经选择用于分析的每个参数在相同的共培养细胞样品中进行测定。
[0050]
在一些实施例中，本文的测定可遵循如图1所示的工作流程，其中将靶细胞(例如肿瘤细胞)添加到细胞板的孔中，然后加入免疫细胞和潜在免疫细胞接合物。在其他情况下，加入的顺序可不同，例如，免疫细胞可在肿瘤细胞之前加入，或者在加入细胞之前，潜在免疫细胞接合物可已包含在板的孔中，或者可相对同时地加入成分等。
[0051]
在一些实施例中，工作流程包括将靶细胞铺板到板上(例如96孔板或384孔板)，在一些情况下使用自动化细胞培养装置将靶细胞铺板到板上。在一些实施例中，细胞可以相对均匀的体积和/或浓度每孔铺板。例如，在一些实施例中，以例如1000-50,000个细胞/孔、或5000-30,000个细胞/孔、或5000-20,000个细胞/孔、1000-20,000个细胞/孔、1000-10,000个细胞/孔、1000-5000个细胞/孔，5000-10,000个细胞/孔、或8000-15,000个细胞/孔、或8000-12,000个细胞/孔、或1000个细胞/孔、或2000个细胞/孔、或5000个细胞/孔、7000个细胞/孔、8000个细胞/孔、9000个细胞/孔、10,000个细胞/孔、11,000个细胞/孔、12,000个细胞/孔或15,000个细胞/孔将细胞铺板。在一些实施例中，以例如5-50μl/孔、10-50μl/孔、20-50μl/孔、20-40μl/孔、20-30μl/孔、20-25μl/孔、25-30μl/孔、30-50μl/孔、30-40μl/孔、25-35μl/孔、10μl/孔、15μl/孔、20μl/孔、25μl/孔、30μl/孔、35μl/孔或40μl/孔将细胞铺板。在一些实施例中，可使用自动细胞计数器和/或液体处理系统，将细胞加入到细胞板，例如以确保细胞在板的每个孔中以相对均匀分布。在一些实施例中，经铺板的细胞可在自动化细胞培养装置(例如select
tm
(sartorius))中孵育。
[0052]
将靶细胞铺板后，可将免疫细胞和/或潜在免疫细胞接合物分子(例如，以特定浓度)加入到细胞板的孔中。例如，在一些实施例中，潜在免疫细胞接合物分子和/或免疫细胞可以特定的细胞数量和浓度(例如以增加或减少的浓度)加入到板中。例如，在一些实施例中，以例如1000至50,000个细胞/孔、或5000-50,000个细胞/孔、或10,000-40,000个细胞/孔、10,000-30,000个细胞/孔、或5000-20,000个细胞/孔、或1000-20,000个细胞/孔、1000-10,000个细胞/孔、1000-5000个细胞/孔、5000-10,000个细胞/孔、或8000-15,000个细胞/孔、或8000-12,000个细胞/孔、或1000个细胞/孔、或2000个细胞/孔、或5000个细胞/孔、7000个细胞/孔、8000个细胞/孔、9000个细胞/孔、10,000个细胞/孔、11,000个细胞/孔、12,000个细胞/孔、或15,000个细胞/孔将免疫细胞加入。在一些实施例中，以例如5-50μl/孔、10-50μl/孔、20-50μl/孔、20-40μl/孔、20-30μl/孔、20-25μl/孔、25-30μl/孔、30-50μl/孔、30-40μl/孔、25-35μl/孔、10μl/孔、15μl/孔、20μl/孔、25μl/孔、30μl/孔、35μl/孔或40μl/孔将免疫细胞加入。在某些情况下，其可以几种不同量加入到不同孔中，例如，以比较不同免疫细胞对肿瘤细胞比例的影响或针对肿瘤细胞滴定免疫细胞。类似地，可在特定孔中以特定浓度加入潜在免疫细胞接合物分子，例如，以确定使免疫细胞接合肿瘤细胞并造成肿瘤细胞杀伤的分子的有效浓度。例如，在一些实施例中，可以1nm至10μm的浓度将潜在免疫细胞接合物分子加入，例如，使用2.5纳升-10μl体积，例如5nl-1μl、1nl-100nl、10nl-1μl或
100nl-10μl。在一些实施例中，可以1nm至1μm(例如1nm-100nm、10nm-1μm、100nm-10μm、1nm-10nm、10nm-100nm、100nm-1μm或1μm-10μm)将潜在免疫细胞接合物加入。
[0053]
在替代实施例中，免疫细胞可在第一步中铺板，然后可将靶细胞加入到板上的免疫细胞中。
[0054]
例如，可使用声体积分配或等效方法，将另外的细胞和/或潜在免疫细胞接合物分子以低体积加入。echo声分配器(beckman coulter)为允许声控体积分配的示例性装置。在一些实施例中，可以在加入细胞之前或之后，将潜在免疫细胞接合物加入到细胞板中。在某些情况下，根据所用设备的要求，可在加入所有细胞之前加入潜在免疫细胞接合物。在某些情况下，这可能归因于设备限制。例如，声控体积分配器可需要以限制每个孔中可能存在的材料体积的方式操作板。因此，在这种情况下，可以在每个孔注入所有细胞以进行共培养之前，将免疫细胞接合物加入。
[0055]
将潜在免疫细胞接合物添加到免疫细胞和肿瘤细胞群之后，可将板在不同温度下孵育不同程度的时间，以测定与免疫细胞和肿瘤细胞的接合、免疫细胞活化和/或肿瘤细胞杀伤相关的一个或多个参数。可测定的示例性参数包括靶细胞死亡、靶细胞细胞凋亡以及与免疫细胞活化和/或靶细胞杀伤相关的细胞因子浓度的变化。在一些情况下，本文的方法也可与流式细胞术分析结合，以确定样品孔中免疫细胞群的变化。在一些实施例中，每个孔可支持多于一种类型的测定，例如细胞死亡和/或细胞凋亡测定，以及一种或多种细胞因子浓度的变化的测定。
[0056]
在一些实施例中，可以获得参数(例如与细胞死亡或细胞凋亡相关的参数)的单一测量，以获得该参数的终点测量。在一些实施例中，可在多于一个时间点进行测定，以确定例如细胞死亡、细胞凋亡和细胞因子浓度的动力学。在一些情况下，可对结果进行定量。因此，在一些实施例中，可确定例如细胞杀伤动力学(例如，kt50)的参数。在一些情况下，可在多种浓度的潜在免疫细胞接合物和/或免疫细胞下确定测定，例如以获得接合物或免疫细胞的ec50。
[0057]
可测定的参数包括靶细胞的死亡，例如，经由用核荧光蛋白或染料转导或标记靶细胞，并在加入或未加入潜在免疫细胞接合物下，暴露至免疫细胞时记录染料标志物强度的变化(例如荧光染料的荧光变化)。在一些实施例中，经由转导(例如用慢病毒或另一转导方法)将染料引入细胞。在一些实施例中，可使用核荧光蛋白，例如nuclight
tm
red或green(例如引入的nuclight
tm
慢病毒或快速红色或绿色荧光蛋白，sartorius)。(参见，例如，图3a-e、7a-7f和8a-8c。)例如，转导的核染料可包括荧光核蛋白。在一些实施例中，相较于一般细胞染色，用转导染料系统标志物靶细胞更优选，因为与一般细胞膜或细胞质染色相比，由此种系统所产生的核荧光蛋白从靶细胞流向免疫细胞的可能性较低。在一些实施例中，可经由随时间读取来自标志物的信号来监测细胞死亡，从而允许确定细胞死亡的速度和细胞死亡的程度，例如被杀伤细胞的百分比。例如，参数还可包括达到10％、25％、50％、75％或90％或100％细胞死亡的时间。在一些实施例中，软件或类似程序可用于识别具有特定荧光强度的靶细胞数量。在一些情况下，可以优化分割参数以最佳地识别细胞数量随时间的变化。
[0058]
除了或作为在测定中追踪细胞死亡的替代方案，也可追踪靶细胞的细胞凋亡，例如，经由使用不同颜色的染料。例如，在一些实施例中，半胱天冬酶3/7染料系统(例如半胱
天冬酶3/7绿色或红色染料)可用于追踪细胞凋亡活性。(参见，例如，来自sartorius的半胱天冬酶3/7绿色或红色荧光染料试剂；并参见图3c-3e。)例如，半胱天冬酶3/7染料可用于检测由半胱天冬酶3/7介导的细胞凋亡，因为可穿透细胞膜的染料分子只有在被半胱天冬酶3/7裂解后才会被活化并发出荧光信号。然后染料能够嵌入细胞中的dna中。因此，半胱天冬酶3/7介导的细胞凋亡使荧光增加，在本文的测定中可以随时间测量该增加的荧光。因此，在一些实施例中，细胞凋亡，如同细胞死亡，可经由动力学确定，例如确定与细胞凋亡过程相关的kt50或其他值。在一些实施例中，可经由随时间读取来自标志物的信号，以监测细胞凋亡，从而允许确定其速度和程度。例如，参数还可包括达到最大细胞凋亡信号的10％、25％、50％、75％或90％100％的时间。在一些实施例中，可使用两种不同的荧光信号和染料，在相同的孔中测量细胞凋亡和细胞死亡，并比较其速度和程度。
[0059]
在一些实施例中，可经由在为此目的而设计的图像分析仪(例如活细胞成像仪(sartorius))中孵育细胞板，以进行来自此标志物的测量。
[0060]
在一些实施例中，在特定时间点，从孔中取出上清液样品以分析从细胞分泌的分子(例如免疫细胞活化标志物、细胞因子或趋化因子)浓度的变化。例如，在靶细胞和免疫细胞与存在或不存在潜在免疫细胞接合物的孵育期间、之前或之后，小体积(例如1-10微升、2-10微升、2-8微升、4-8微升、2微升、4微升、5微升、6微升、7微升、8微升或10微升)可从上清液中移除至少一次。也可定期收集上清液样品，用于分泌因子浓度变化的动力学分析。在一些情况下，针对这些分析，可移除不超过样品或孔原始体积的50％的总上清液体积。例如，移除过多的上清液也可能移除保持细胞正常生长所需的生长培养基成分。因此，换句话说，如果共培养细胞和额外成分(例如潜在免疫细胞接合物)和任何相关培养基等的体积在最初加入成分后加起来达到特定体积，在某些情况下，对于这些分析，可移除不超过原始体积总量的50％。在某些情况下，针对这些分析，移除不超过40％、或不超过30％或不超过20％。在一些实施例中，在细胞孵育期间去除上清液至少两次或至少三次。且在一些此种情况下，在所有合并上清液的收集期间，移除不超过原始体积的50％、不超过40％、不超过30％或不超过20％。
[0061]
在一些实施例中，可以(例如，使用多路复用珠粒或阵列)测定在上清液样品中发现的一个或多个分析物(例如细胞因子或其他t细胞活化相关因子(颗粒酶b)或趋化因子)的浓度。例如，可采用对分泌蛋白(例如细胞因子、t细胞活化因子和趋化因子)的多重测定，其在某些情况下，使用具有不同颜色标记的珠粒来检测每个特定分泌蛋白与特异性识别该蛋白的珠粒的结合。例如，阵列或珠粒或杆(rod)可含有结合至几种不同细胞因子的分子，具有独特的颜色标记的每个珠粒或阵列或杆合并结合标记允许对分析物进行定量，从而允许在多重方式下追踪细胞因子与经标记的结合剂的结合。在一些实施例中，细胞因子分析可使用luminex flexmap成像系统进行。在一些实施例中，可测定的细胞因子和其他分析物包括例如穿孔素、颗粒酶b、干扰素γ(ifnγ)、il-10、il-2、il-6、il-8、mip1a、mip1b、tnf-α(tnfα)。(参见，例如，图4b-4f和9a-9d。)在一些实施例中，可测定的其他分析物包括例如人类生长激素(hgh)、n-甲硫氨酰基人类生长激素和牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素(例如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和促黄体激素(lh))、表皮生长因子(egf)、肝生长因子、纤维母细胞生长
因子(fgf)、催乳素、胎盘催乳素、苗勒(mullerian)抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(tpo)、神经生长因子(例如ngf-α)、血小板生长因子、转化生长因子(tgf)(例如tgf-α和tgf-β)、胰岛素样生长因子-i和-ii、红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素β(ifnb)、集落刺激因子(csfs)(例如巨噬细胞-csf(mcsf)、粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)、和粒细胞-csf(g-csf))、白细胞介素(il)(包括il-10、il-2、il-6、il-8，以及il-1、il-1α、il-1β、il-3、il-4、il-5、il-7、il-9、il-11、il-12(p70)、il-12(p40)、il-13、il-15、il-17/17a、il-17c、il-17d、il-17f、il-18、il-20、il-21、il-22、il-23(p19)、il-27、il-35、tnf-β、gfap、mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp9、mmp10、mmp12、tnf-r1、tnf-r2、vegf-a、淋巴毒素β、ccl1、ccl2(mcp-1)、ccl3(mip-1α)、ccl4(mip-1β)、ccl5(rantes)、ccl6、ccl7(mcp-3)和ccl8(mcp-2))；以及其他多肽。
[0062]
在一些实施例中，在(例如，动力学)测定多个参数的情况下，也可比较动力学，例如，以获得潜在免疫细胞接合物对系统的影响的更完整的情况。
[0063]
在一些实施例中，在测定特定潜在免疫细胞接合物的浓度范围时，可获得ec 50或ic 50测量值，以测定潜在免疫细胞接合物的剂量反应关系和被测量的效果。例如，细胞因子浓度的特定变化或细胞死亡的斜率或曲线下面积(auc)可由潜在免疫细胞接合物的几种浓度中的每一种获得，从中可计算潜在免疫细胞接合物的ec50或ic50。在一些实施例中，此可允许比较不同潜在免疫细胞接合物的效力，或比较单个接合物对于不同肿瘤细胞样品的效力。
[0064]
动力学曲线还可转换成剂量反应曲线，以确定每个分子效力或细胞因子特征的ec50。例如，杀伤50％的细胞所需的速度可与杀伤的等级速度进行比较。可确定杀伤的最大活性，以显示可以被杀伤的细胞的最大百分比。最小和最大活性的差异可用于确认最大活性。细胞杀伤相关参数(例如atp活性)的终点量可与例如在评估的最后时间点或中间时间点的细胞凋亡％或杀伤进行比较。在一些情况下，可从384孔或96孔板中取出免疫细胞并使用流式细胞术进行表征。
[0065]
在一些实施例中，一个或多个孔中的细胞可进一步经由流式细胞术表征。在一些实施例中，可经由流式细胞术评估免疫细胞，以表征细胞类型和/或评估特定的细胞活化标志物。可评估t细胞的t细胞标志物的量的变化，例如cd3、cd4、cd8、cd69、hla-dr和/或cd25。(参见例如图5。)可经由流式细胞术评估的其他标志物包括例如cd11b、cd19、cd56/ncam-1、cd94、cd122/il2受体β、cd127/il7受体α、cd152、fcγriii、cd16、kir家族受体、nkg2a、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80、ifnγ、tnf、eomes、cxcr3、il2、il4、il10、il12、il18、stat1、stat4、stat5、foxp3、ccr4，因此，例如，流式细胞术可允许确定潜在免疫细胞接合物如何影响t细胞活化。例如，免疫细胞(例如pbmc)可用于评估cd3+、cd4+和cd8+细胞的百分比或上面列出的其他标志物。
[0066]
在一些实施例中，还可在本文的系统中进行与靶细胞杀伤相关的进一步测定。在一些实施例中，还可进行cell titer(ctg)atp测定(promega)。因atp代表活性细胞代谢，故此类测定经由确定孔中存在的atp量来确定孔中细胞的存活程度。(参见图4a。)与本文的方法和系统相容的其他示例性测定包括用于追踪特定基因表达的荧光素酶报告测定、酶联免疫斑点(elispot
tm
)测定(例如来自mabtech,inc.，cincinnati，oh)以评估在特定孔中释放细胞因子的细胞量，以及例如作为细胞细胞毒性的进一步测定的乳酸脱氢酶
(ldh)释放测定。
[0067]
在一些实施例中，例如，如图1所示的上述工作流程可在1-15天(例如1-10天、1-5天或1-3天)的期间内执行。例如，在一些实施例中，取决于共培养细胞的生长速度和/或潜在免疫细胞接合物的效力，将细胞与潜在免疫细胞接合物一起孵育1-15天(例如1-10天、1-5天或1-3天，或在1、2或3天)。因此，例如，一些实施例允许肿瘤细胞、免疫细胞和潜在免疫细胞接合物的高达数百种不同组合，任选地在各种条件下或在其他分子存在下，在短时间(例如1-15、1-10、1-5或1-3天)内进行测定，并使用不同比例的细胞和免疫细胞接合物试剂，或使用来自不同供体的不同浓度的细胞样品。
[0068]
可在本文的测定中评估的潜在免疫细胞接合物包括例如t细胞依赖性双特异性抗体和共刺激受体双特异性抗体(tdb和crb)。在一些实施例中，潜在免疫细胞接合物(例如tdb)可结合至t细胞上所表达的分子靶标(例如cd3)。替代地或另外地，潜在免疫细胞接合物可与另一种免疫细胞表面标志物(例如cd56/ncam-1、cd94、cd122/il2受体β、cd127/il7受体α、fcγriii、kir家族受体、nkg2a、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46或nkp80)结合，以及例如与肿瘤细胞上所表达的分子靶标结合。取决于要靶向的细胞类型，肿瘤细胞靶标的实例包括例如her2、cd20、psca、cd19、flt3、cd33、egfr、mcsp、cea、epcam、steap1、fcrh5、dll3、ly6g6d、lye、napi3b、muc、cd22、未成熟层粘连蛋白受体、tag-72、hpv e6、e7、bing-4、钙活化的氯离子通道2、ccnb1、9d7、epha3、间皮素、sap-1、存活素、bage、cage、sage或xage的家族成员、ny-eso-1/lage-1、prame、ssx-2、melan-a/mart-1、gp100/pmel17、酪氨酸酶、trp-1/-2、p.多肽、mc1r、β-连环蛋白、brca1、brca2、cdk4、cml66、纤连蛋白、mart-2等。代替t细胞的一些实施例中，双特异性分子(例如抗体)可被设计为将其他免疫细胞(例如nk细胞)连接到肿瘤细胞，然后连接到靶细胞上的靶分子。
[0069]
crb可结合至免疫细胞靶标(例如cd28、cd27、ox40、4-1bb(cd137)、cd30、tim1、tim2、tim3、gitr、ctla4、btla、lfa-1、pd1、nkg2d、b&-1,2、light或icos)以及肿瘤靶标。
[0070]
可被免疫细胞靶向破坏的任何类型的细胞可为本文测定中的靶细胞。在一些情况下，靶细胞为原代细胞。在一些情况下，其为肿瘤细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞可为经培养的细胞，例如经培养的人类肿瘤细胞。在一些实施例中，靶细胞可用核细胞转导试剂预处理，例如经由慢病毒转形在使其在细胞核中表达荧光蛋白。在一些实施例中，靶细胞可直接来自患者，例如来自活检的肿瘤细胞或疑似肿瘤细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞可为实体瘤细胞。在其他实施例中，肿瘤细胞可为非实体瘤细胞，例如淋巴瘤或白血病细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞可来自乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、食道癌、胆道肿瘤、脑癌(包括胶质母细胞瘤)、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌(包括肾细胞癌)、肝癌(肝肿瘤)、肾上腺癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、唾液腺癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、淋巴癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌(例如黑素瘤)或尿道癌。
[0071]
在一些实施例中，免疫细胞为t细胞，例如cd4+t细胞或cd8+t细胞或泛t细胞。在其他实施例中，免疫细胞为pbmc。在其他实施例中，免疫细胞为nk细胞。在一些情况下，测定中所使用的免疫细胞可包括细胞混合物，例如t细胞、b细胞和/或nk细胞的混合物。在一些实施例中，免疫细胞源自特定供体。例如，本文的测定可用于在不同免疫细胞接合物存在下，比较来自不同供体的免疫细胞与肿瘤细胞接合。因此，在一些实施例中，本文的测定可用于
针对从个体供体所获得的免疫细胞和/或肿瘤细胞，以筛选潜在免疫细胞接合物。在其他情况下，本文的测定可用于使用取自两个或多个供体的免疫细胞和/或靶细胞，以测试共培养细胞上的潜在免疫细胞接合物，例如，比较接合物对几种不同共培养细胞群的活性。
[0072]
在一些实施例中，本文的测定可包括针对多于一个类型的靶细胞测试潜在免疫细胞接合物。在一些实施例中，可针对来自多于一个供体或多于一个类型(例如cd8+t细胞对泛t细胞等)的免疫细胞，测试潜在免疫细胞接合物。在一些实施例中，可在免疫细胞和靶细胞的不同比例下，测试潜在免疫细胞接合物。例如，在一些此类情况下，可针对另一个细胞类型滴定一种细胞类型。在一些实施例中，可针对靶细胞和免疫细胞的固定量和比例，并且进一步针对靶细胞和免疫细胞的一组特定组合和比例，以滴定潜在免疫细胞接合物。例如，使用多孔板和自动化程序加上小体积试剂可允许在一个或多个细胞板中平行地运行多个不同的测试(例如上述的测试)。在一些实施例中，取决于测定中的细胞生长速度和靶细胞杀伤，也可在较短的时间间隔(例如从1-15天、1-10天、1-5天、1-3天或1-2天)内收集此类数据。
[0073]
示例性系统
[0074]
本公开还包括用于执行本文的方法的系统。在一些实施例中，例如，系统可能够以自动化方式串联地执行本文的两个或更多个测定。在一些实施例中，系统可能够分配用于共培养免疫细胞和靶细胞的试剂，并将潜在免疫细胞接合物和/或其他试剂添加到共培养物中。在一些实施例中，系统可能够分配试剂、孵育和监测共培养的细胞，并分析本文的参数(例如来自一个或多个细胞染色的荧光变化，和/或上清液中蛋白质标志物(例如细胞因子)的浓度变化)。在一些实施例中，系统可部分地或完全地自动化。
[0075]
在一些实施例中，本文的系统可包括，例如：细胞培养板(例如96-384孔多孔板)、至少一个用于将细胞和/或试剂添加到细胞板的液体处理分配器、用于培养和监测细胞板孔中的荧光水平的至少一个成像装置、和/或用于自细胞板孔中移除上清液以分析上清液中的分析物(例如免疫细胞标志物、细胞因子及趋化因子)的装置。
[0076]
在一些实施例中，本文的系统还包括用于执行本文的参数的终点和/或动力学分析的数据分析软件。
[0077]
实例
[0078]
图1示出本文所进行的测定的示例性高通量、多参数、自动化系统的示例性工作流程。任选地使用自动化细胞培养装置(例如来自sartorius的select
tm
)，并手动地或自动地铺板，例如将自动化液体分配器(例如certus、tecan或agilent(bravo))使用到96或384孔板上，以维持荧光红色或绿色nuclight
tm
肿瘤细胞。任选地使用声学分配器(echo，beckman coulter)，将潜在免疫细胞接合物与免疫细胞一起添加到板中。绿色或红色核荧光蛋白(例如nuclight
tm
、绿色荧光蛋白(gfp)、mcherry、turbogfp)或染料(例如半胱天冬酶3/7染料，sartorius)在成像设备(例如sartorius)中随时间被追踪。任选地，细胞质或膜染料(例如，cytolight
tm
)可用于染色并区分免疫细胞与肿瘤细胞，以改良仅对肿瘤细胞杀伤的定量，并排除来自垂死免疫细胞的死亡信号，以获得靶细胞死亡和细胞凋亡的动力学。任选地收集来自孔的上清液，以用于分析分泌的分析物(例如细胞因子)，例如，使用磁珠(可从luminex获得)及使用flexmap读数器(luminex)同时测定来自上清液样品的
各种分析物的浓度。使用例如(tibco)和/或genedata(basel,ch)软件包分析数据。
[0079]
为运行图1的方法，将用于铺板细胞的细胞密度进行优化，如图2所示。为确保荧光细胞均匀的细胞铺板，首先选择合适的荧光核蛋白标志物，经由慢病毒转导引入，并且选择当细胞死亡而失去其信号时为不稳定的荧光核蛋白标志物，然后将方案进行优化(即确保足够用于荧光蛋白整合的慢病毒转导)。然后将细胞计数并且以一式两份铺板到多个孔中(如图2所示，c19和c20；d19和d20、e19和e20等各一式两份)。如图2所示，样品c、d、e、f、g和h的细胞数量不同，c比d多2倍，d比e多2倍等等。每4小时进行一次成像，并使用红色物体计数对细胞进行定量。如本文所述的测定可用于选择用于测定的最佳细胞密度，并且可为例如，细胞随时间增殖但细胞的生长曲线在计划测定期间未达到其最大值的密度期间。
[0080]
存在t细胞依赖性双特异性抗体(tdb)的情况下，将肿瘤细胞和免疫细胞共培养。图3显示将免疫细胞和t细胞依赖性双特异性抗体(tdb)添加到肿瘤细胞后，肿瘤细胞的荧光随时间的变化，反映肿瘤细胞的杀伤和细胞凋亡。图3a显示加入免疫细胞和tdb后，在1或3天后核荧光强度(nuclight
tm
red)的水平。如图3b所示，共培养的肿瘤细胞被染成绿色并呈现为3d球体，而经cytolight
tm
染色的免疫细胞被染成红色。将肿瘤和免疫细胞在具有tbd(上排)或不具有tbd(下排)情况下共培养并孵育一段时间(由左图至右图)。可看出，具有tbd(上排)使肿瘤细胞死亡而随时间丧失绿色染色，相比之下，缺乏tbd(下排)的染色不会随时间显著变化。除了丧失肿瘤细胞外，还捕获并量化红色免疫细胞向肿瘤球体的迁移和渗透。图3c显示微孔384孔板的86,400个亚孔中的单细胞杀伤活性，显示单肿瘤细胞(红色染色)和半胱天冬酶3/7绿色荧光标记(绿点)。图3d显示在免疫细胞和免疫细胞接合物存在下，肿瘤细胞中核红色荧光染料和半胱天冬酶3/7依赖性绿色荧光染料的强度变化。肿瘤细胞死亡导致红色核荧光丧失，而细胞凋亡的增加导致半胱天冬酶3/7依赖性绿色荧光染色强度增加。以1:1的比例的一个肿瘤细胞系和一个供体免疫细胞用tdb的剂量滴定处理共培养物。图3e显示使用不同处理浓度的动力学曲线所生成的剂量反应曲线(drc)。
[0081]
在测定中还评估与肿瘤细胞的接合和杀伤相关的各种其他参数(例如终点杀伤及细胞因子浓度的变化)。图4a显示在2种不同tdb(nlr 4d5和nlr 2c4)存在下，在4种不同肿瘤细胞系(bt474、ncih292、cov413b和cov362)基于代谢(atp)读数的肿瘤细胞杀伤。图4b、4c和4d分别显示，与非肿瘤靶标对照tdb(下曲线)相比，取自孔的上清液中il-6、ifnγ和il-2浓度的变化(上曲线)。图4e和4f示出经60nm tdb处理的具4个免疫细胞供体的2种分析物(il-6和il-2)随时间的mfi信号。测定在luminex的8重系统中进行，且数据随时间绘制。
[0082]
图5显示自384孔中分离的免疫细胞经由流式细胞术所确定的cd8+cd69+t细胞百分比，在图像收集结束时在4个细胞系进行以tdb或珠粒刺激滴定。以识别免疫细胞表面上的cd8和cd69标志物的荧光抗体染色免疫细胞。t细胞活化标志物的上调与更高表达的肿瘤靶标表现细胞系相一致。
[0083]
还评估在tdb的高(黑圈)剂量和低(空心圈)剂量下，在单独tdb或tdb与crb(共刺激受体双特异性抗体)的组合的共培养细胞上清液中，颗粒酶b、il-10、mip1b、ifnγ、il-2、tnfα的浓度。(参见图6a。)图6b左图示出在没有tdb和有tdb的情况下孵育1天和3天后，cd8+和共刺激受体+(costim+)t细胞百分比的差异，而右图显示在有或没有tdb 1天和3天后，cd8+cd25+t细胞(teff)的百分比。
[0084]
图7a示出结合至her2的不同tdb是以近端(p)或远端(d)方式并以高(hi)或低(lo)亲和力结合至cd3的示意图。图7b提供tdb的各个抗her2或抗cd3臂的相对亲和力。图7c提供2个tdb的动力学曲线，显示经更高亲和力的tdb处理，损失更多细胞。图7d示出将2个tdb的动力学曲线转换到剂量反应曲线。图7e示出对2个tdb杀伤50％肿瘤细胞所需时间的计算，表示其具有不同的杀伤率。图7f示出由7e中的％细胞溶解曲线所产生的剂量反应曲线。
[0085]
图8a示出crb与固定量的tdb共给药的滴定。较深的曲线代表crb对tdb的较高相对浓度。图8b示出不同处理浓度的kt50率的计算。图8c示出来自各个曲线所计算的drc。图8d示出将crb滴定成3个固定浓度的tdb的靶细胞杀伤百分比(经标准化)。图8e示出将tdb滴定成4个固定crb浓度的靶细胞杀伤百分比(经标准化)。图8f显示，在nuclight
tm
red测定中的最大百分比肿瘤细胞杀伤活性相较于在半胱天冬酶3/7测定中的最大百分比活性之间的相关性(图8f；其中填满的深色符号显示使用cd8+t细胞的结果，而未填满的浅色符号显示使用泛t细胞的结果)。图8g显示在nuclight
tm
red测定中的最大百分比活性相较于在cell titer测定中的最大百分比活性之间的相关性(图8g；其中深色符号和浅色符号显示不同测试的tdb数据)。
[0086]
还评估诸如ifnγ、il2和il6等因子的浓度。图9显示加入tdb 6小时、24小时和72小时后，来自孔的上清液中某些分析物浓度的变化(图9a
–
ifnγ；图9b
–
颗粒酶b；图9c
–
il2；和图9d
–
il6)。每个图中的单独曲线代表具有不同tdb克隆的数据。
[0087]
图10示出基于多个数据读数将各种crb克隆和对照进行排序的热图，例如细胞杀伤的kt50和各种细胞因子浓度的变化。在与cd8+t细胞孵育72小时后分析细胞因子。
[0088]
使用来自四个不同供体(1、2、3和4)的免疫细胞评估t细胞亚群。图11显示在与靶细胞以及在有或没有tdb情况下孵育1或3天后，来自四个供体的免疫细胞中的t细胞亚群随时间增加。图11a cd8+t细胞；图11b t效应细胞(teff)；图11c记忆t细胞(tcm)；和图11d效应细胞对记忆细胞的比率(teff/tcm)。
[0089]
如图12a所示，在加入和未加入tdb的情况下，供体1和3在cd8+t细胞增生具有差异。图12b和图12c显示两种供体的细胞杀伤率随crb浓度增加的比较(1和3)，且图12d和图12e显示对应于图12b和c中数据的剂量反应曲线。
[0090]
图13显示多个读数的相关性。具体地，图13a是在靶细胞和cd8+t细胞(填满，黑圈)或pbmc(空心，未填满圈)存在下，比较两种不同crb分子的ec50。图13b示出在靶细胞和cd8+t细胞存在下，几个不同crb克隆的kt50相对于最大活性％。图13c示出与cd8+t细胞的各种crb克隆的颗粒酶b相对于最大活性％。图13d是在crb和cd8+t细胞(填满，黑圈)或pbmc(空心，未填满圈)存在下，比较her2d tdb和her2p tdb(见图7)的ec50。图13e示出在几个crb克隆存在下，cd8+t细胞相较于泛t细胞的最大活性％之间的比较。图13f是在几个crb克隆存在下，比较ifnγ相较于cd8+t细胞的最大活性％。
[0091]
图14a-c显示各种tdb克隆基于其随时间的杀伤和细胞因子的特征的t分布随机邻近嵌入(t-sne)机器学习算法聚类分析(图14a 6小时、图14b 24小时和图14c 72小时)以鉴别独特tdb。

技术特征：
1.一种测定潜在免疫细胞接合物的活性的方法，其包括：(a)将靶细胞与免疫细胞在至少一种潜在免疫细胞接合物存在下共培养，以及(b)测定以下参数中的至少一者，任选地其中每个参数在相同的共培养细胞样品内测定：(i)靶细胞的死亡，(ii)靶细胞的细胞凋亡，(iii)atp浓度的变化，以及(iv)来自共培养细胞的上清液中至少一种分析物的浓度的变化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养包括将所述靶细胞添加到多孔细胞板的孔，并且将免疫细胞和至少一种潜在免疫细胞接合物添加到所述孔中的所述靶细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞板包含96至384个孔。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为肿瘤细胞或原代细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为t细胞(诸如cd8+t细胞、cd4+t细胞、cd3+t细胞或泛t细胞)、pbmc细胞或nk细胞。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞源自多于一个供体。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述靶细胞经编码荧光核蛋白的载体转导，所述荧光核蛋白在细胞被杀死或经历细胞凋亡时提供较低信号，并且其中靶细胞的死亡通过荧光核蛋白信号的损失而测量。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中靶细胞的细胞凋亡通过来自半胱天冬酶3/7依赖性荧光标记的信号的增加而测量。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中atp浓度的降低通过发光标记而测量。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在将所述潜在免疫细胞接合物添加到所述共培养细胞后，至少一次去除来自共培养物的上清液，并且其中测量至少一种细胞因子、趋化因子或t细胞活性标志物，诸如颗粒酶b、干扰素γ(ifng)、il-10、il-2、il-6、il-8、mip1a、mip1b或tnf-α(tnfa)的浓度。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中确定参数(i)至(iv)中的至少一者的动力学。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中确定达到20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％靶细胞死亡的时间。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中去除所述共培养物的一部分以进行流式细胞术分析，从而确定至少一种免疫细胞标志物，诸如cd3、cd8或cd4的存在情况。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述潜在免疫细胞接合物为双特异性分子。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述潜在免疫细胞接合物为抗体，诸如双特异性抗体。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体为t细胞依赖性双特异性抗体(tdb)。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将共刺激受体双特异性抗体(crb)添加到所述共培养细胞。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中确定参数(i)至(iv)中的至少两者，其中从相同的共培养物样品或从细胞板的相同孔来确定所述参数。

技术总结
本公开提供用于测试免疫细胞接合物分子和潜在免疫细胞接合物分子的高通量测定的方法和系统。在一些实施方案中，可从所述测定中的相同样品分析例如与免疫细胞诸如T细胞对肿瘤细胞的接合相关以及与肿瘤细胞死亡相关的多个参数，并且在一些情况下，可同时进行分析。在一些实施方案中，所述方法和系统允许确定各种参数的动力学。种参数的动力学。种参数的动力学。


技术研发人员：K
受保护的技术使用者：基因泰克公司
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2023/7/12