因子XI缺乏血浆保护剂及其应用的制作方法

因子xi缺乏血浆保护剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及因子xi缺乏血浆保护剂及其应用。


背景技术：

2.止血的分子机制是由一系列凝血因子被相继激活的过程，从凝血的激活到血浆凝块的形成都是依赖于外源凝血途径与内源凝血途径(其中包括凝血的共同途径)。
3.凝血因子
ⅺ
(f
ⅺ
)是一种丝氨酸蛋白酶原，曾称为血浆凝血活酶前质(plasma thromboplastin antecedent，pta)，是内源凝血途径中与接触相有关的一种血浆凝血因子。因子
ⅺ
是维持内源性途径所必需的，而且在凝血级联反应放大过程中发挥关键作用。在凝血过程中，因子xi的缺乏(遗传因素导致或者后天因素导致)将影响整个凝血系统的平衡。凝血因子xi的先天性缺陷与典型的血友病a和其他出血性疾病相关，例如圣诞节病、pta缺乏症、哈格曼性状和低凝血酶原血症等。获得性凝血障碍可能涉及多种凝血因子的缺乏。它们通常与创伤、肝病、维生素k缺乏或抗凝治疗有关。对于这些疾病的监测，需要准确诊断凝血因子xi与其他凝血因子的活性及其他造成疾病的因素。
4.对于凝血因子xi的检测，目前市场上主要有两类产品，一类是对凝血因子蛋白含量的检测，主要有火箭电泳法、放射免疫分析法和酶联免疫法等，另一类是对凝血因子的活性进行检测，主要为凝固法，其原理是基于检测待测标本对乏因子血浆所致的凝固时间(aptt)延长的纠正能力。凝固法由于操作简便，结果准确，能真实反映出在凝血过程中实际发挥作用的凝血因子的活性等优点而被广泛应用。
5.在血浆凝固过程中，任意一种凝血因子的缺乏都将影响整个凝血反应，因此，凝血因子的状态将直接影响因子xi缺乏血浆的稳定性。为了保障因子xi缺乏血浆的稳定性，通常情况下，将其制成冻干品或将冰冻血浆储存在超低温的环境中，但血浆在冻干及储存等过程中，极易造成凝血因子活性降低，因此，保证血浆中各凝血因子的活性是血浆稳定的前提条件。
6.近年来，由于全自动凝血分析仪的大力推广与使用，使得因子xi活性测定实现了自动化，这不仅降低了因子xi测定的操作门槛，同时还大大提高了检测结果的准确性。因此，因子xi测定相关试剂的需求量越来越大。目前市场上已经有多个厂家生产出了用于因子xi测定相关的试剂盒，但这些试剂盒均为国外产品，价格昂贵，采购周期长，在运输储存过程中试剂盒易受外界环境等因素的影响，导致凝血因子失活，从而导致试剂盒稳定性降低。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供因子xi缺乏血浆保护剂及其应用，本发明提供的因子xi缺乏血浆保护剂能够有效的保护因子xi缺乏血浆在冻干前后的活性，其制备方法简单、价格低廉且稳定性强。
8.本发明提供了保护剂，包括缓冲液、冻干保护剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐，其
中，
9.所述缓冲液包括hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种；
10.所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐-40和海藻糖中的至少一种；
11.所述表面活性剂包括泊洛沙姆188和胆酸钠中的至少一种；
12.所述防腐剂包括nan3、硫柳汞和环丙沙星中的至少一种；
13.所述无机盐包括氯化钠和氯化钾中的至少一种。
14.相比较其他组分的选择，本发明提供的所述保护剂中各组分相互配合，共同为制备冻干血浆提供了更加稳定的冻干体系，能够最大程度的保护血浆中各凝血因子及纤维蛋白酶原的活性，有效地稳定血浆，从而获得更准确的技术效果。
15.在一些具体实施例中，所述缓冲液为hepes缓冲液，所述保护剂为甘氨酸、右旋糖酐-40和海藻糖，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，所述防腐剂为环丙沙星，所述无机盐为氯化钠。相比较其他试剂，上述各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合冻干血浆的制备，同时兼顾血浆中各凝血因子及纤维蛋白酶原的活性及稳定性，从而获得更准确的技术效果。
16.优选的，所述保护剂由水、123.6～357.5g/l hepes缓冲液、10～50g/l海藻糖、10～100g/l甘氨酸、10～50g/l右旋糖酐-40、1～5g/l泊洛沙姆188、1～5g/l环丙沙星和0.1～1g/l氯化钠组成，所述保护剂的ph值为7.8。
17.采用上述组分及浓度范围的保护剂制备的冻干血浆与市售产品进行对比实验，对正常范围定值质控血浆与病理范围定值质控血浆进行重复性检测，结果表明本发明提供的血浆所测定的正常范围定值质控血浆与病理范围定值质控血浆的变异系数(cv)均小于市售产品，重复性更好，从而获得更准确的技术效果。
18.进一步优选的，所述保护剂由水、240g/l hepes缓冲液、20g/l海藻糖、50g/l甘氨酸、20g/l右旋糖酐-40、2g/l泊洛沙姆188、2.5g/l环丙沙星和0.2g/l氯化钠组成，所述保护剂的ph值为7.8。
19.实验表明，在此浓度下，所述保护剂配合制备的冻干血浆效果最佳，实验重复性最好。
20.本发明还提供了所述的保护剂在制备凝血因子缺乏血浆或包含凝血因子缺乏血浆的试剂盒中的应用。
21.优选的，所述凝血因子缺乏血浆包括因子xi缺乏血浆。
22.进一步优选的，所述因子xi缺乏血浆为人乏xi缺乏血浆，具体是人阴性血浆除去凝血因子xi，使其含量≤1％。
23.本发明提供了因子xi缺乏血浆或包含因子xi缺乏血浆的试剂盒，包括人乏xi因子血浆和所述的保护剂。
24.优选的，所述保护剂与所述人乏xi因子血浆的体积比为(1～3):(7～9)。
25.进一步优选的，所述保护剂与所述人乏xi因子血浆的体积比为2:8。
26.本发明还提供了所述的因子xi缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。
27.本发明提供了凝血因子活性检测试剂盒在检测人血浆中因子xi活性的方法，具体
步骤如下：
28.①
、用稀释液按1:5比例稀释血浆样本(恢复至室温15℃～25℃)，用移液管吸到试管中，37℃下预温，同时将cacl2在37℃下预温；
29.②
、因子xi测定试剂与稀释后的血浆样本以体积比1:1的方式混合，于37℃混合并孵育0.5～2分钟；
30.③
、加入aptt试剂与稀释后的血浆样本以体积比按1:1的方式混合，于37℃混合并孵育0.5～2分钟；
31.④
、加入cacl2试剂与稀释后的血浆样本以体积比按1:1的方式混合，于37℃下作用2分钟后，读取上述样品于405nm波长下的吸光度值；
32.⑤
、根据已知的标准曲线计算得到血浆样本中因子xi的活性。
33.本发明提供了包括缓冲液、冻干保护剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐的保护剂，包括人乏xi因子血浆和保护剂的因子xi缺乏血浆以及因子xi缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明提供的保护剂能够有效保障人乏xi因子血浆中蛋白的稳定性及活性，进一步提高包含人乏xi因子血浆的产品性能。本发明的保护剂中采用海藻糖、甘氨酸与右旋糖酐-40共同用作冻干保护剂，能有效保护血浆中血浆蛋白在冻干过程中的稳定性及冻干品复溶后的稳定性；采用泊洛沙姆188作为表面活性剂，可进一步保护血浆中蛋白质免受冻干过程所造成的失活。本发明提供的因子xi缺乏血浆适用于市场上常见的大多数全自动凝血分析仪。
附图说明
34.图1基质血浆中凝血因子ii活性变化；
35.图2示基质血浆中凝血因子v活性变化；
36.图3示基质血浆中凝血因子vii活性变化；
37.图4示基质血浆中凝血因子viii活性变化；
38.图5示基质血浆中凝血因子ix活性变化；
39.图6示基质血浆中凝血因子x活性变化；
40.图7示基质血浆中凝血因子xii活性变化；
41.图8示基质血浆中凝血因子fib含量变化；
42.图9示本发明试剂盒与siemens试剂盒在cs2400上检测结果相关性分析；
43.图10示本发明试剂盒与stago试剂盒在sta-r evolution上检测结果相关性分析；
44.图11示本发明试剂盒与il试剂盒在acl top 750上检测结果相关性分析。
具体实施方式
45.本发明提供了因子xi缺乏血浆保护剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
46.本发明提供了保护剂，包括缓冲液、冻干保护剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐，其
中，
47.缓冲液选自hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种；
48.保护剂选自蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐-40和海藻糖中的至少一种；
49.表面活性剂选自泊洛沙姆188和胆酸钠中的至少一种；
50.防腐剂选自nan3、硫柳汞和环丙沙星中的至少一种；
51.无机盐选自氯化钠和氯化钾中的至少一种。
52.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
53.实施例1本发明试剂盒因子xi缺乏血浆的制备
54.本发明提供了一种利用人乏xi因子血浆制备因子xi测定试剂盒的配方，为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
55.本发明试剂盒在研发过程中所使用的人乏xi因子血浆的生产厂家为德国biomex gmbh，将保护剂的ph值调为7.8后加至人乏xi因子血浆中充分混匀。本发明试剂盒所述保护剂配方如表1，其与血浆的体积比为2∶8。
56.表1.保护剂配方表(实验组)
[0057][0058]
表2保护剂配方表(对照组)
[0059][0060]
实施例2本发明试剂盒保护剂与血浆比例研究
[0061]
试剂盒中保护剂与血浆的比例主要设置3个梯度，即1:9、2:8与3:7，以探究保护剂与血浆的比例对试剂盒测值准确度的影响。取市售产品及各实验组冻干产品对西门子标准人类血浆(靶值：91％)进行准确度检测，汇总检测结果并计算检测结果与标准人类血浆靶值的相对偏差。结果见表3，所有实验组所测定标准人类血浆的活性值与靶值的相对偏差均
小于市售试剂盒。实验结果显示保护剂与血浆的比例对血浆测值准确性的影响不大，但其比例为2:8时，其测值与靶值的相对偏差最小，综上本发明试剂盒保护剂与血浆的比例为(1～3):(7～9)，优选2:8。
[0062]
表3准确度检测结果
[0063][0064]
注：相对偏差＝(测试值-校准品靶值)/校准品靶值
×
100％
[0065]
实施例3本发明试剂盒组分稳定性研究
[0066]
对基质血浆进行凝血因子检测(ii、v、vii、viii、ix、x、xii)与fib含量检测，按照实施例1配制血浆后，对其进行稳定性检测。分别对因子xi缺乏血浆在冻干前和冻干后进行凝血因子及fib检测，每次检测重复三次取平均值，对所检测数据进行统计学分析(t检验)，结果见表4～11。结果显示，对照组血浆中的各凝血因子活性及fib含量均有不同程度的下降，而本发明试剂盒(实验组)在冻干前后血浆中各凝血因子活性及fib含量无明显变化，说明本发明试剂盒(实验组)组分能有效保护血浆中凝血因子免受冻干过程的影响；本发明试剂盒(实验组)冻干品复溶后，在连续5天的测试中，各凝血因子的活性无明显变化，说明本发明试剂盒保护剂组分的组合能有效稳定血浆复溶后各凝血因子及fib的酶活。实验组与对照组1～8对比显示，海藻糖、甘氨酸与右旋糖酐-40其中任一组分缺失或替换，其冻干保护效果均有不同程度的下降，说明海藻糖、甘氨酸与右旋糖酐-40共同用作保护剂，能有效保护血浆中血浆蛋白在冻干过程中的稳定性及冻干品复溶后的稳定性。实验组与对照组9对比显示，泊洛沙姆188的加入，可进一步保护血浆中蛋白质免受冻干过程所造成的失活。
[0067]
表4.凝血因子ii活性测定结果
[0068][0069]
表5.凝血因子v活性测定结果
[0070][0071]
表6.凝血因子vii活性测定结果
[0072][0073]
表7.凝血因子viii活性测定结果
[0074][0075][0076]
表8.凝血因子ix活性测定结果
[0077][0078]
表9.凝血因子x活性测定结果
[0079][0080][0081]
表10.凝血因子xii活性测定结果
[0082][0083]
表11.fib含量测定结果
[0084][0085]
实施例4本发明试剂盒保护剂主要组分浓度研究试剂盒中保护剂的主要组分分别设置3个浓度，采用正交方法设置组别(如表12)，以探究保护剂各组分浓度对试剂盒重复性的影响。取市售产品及各实验组冻干产品对正常范围定值质控血浆(control plasma n)与病理范围定值质控血浆(control plasma p)进行重复性检测。汇总检测结果计算其变异系数(cv)。结果见表12，所有实验组所测定的正常范围定值质控血浆与病理范围定值质控血浆的变异系数(cv)均小于市售试剂盒(5.18％，8.42％)。同时，实验组5的实验结果优于其他实验组。综上，试剂盒保护剂组分中海藻糖浓度为10-50g/l，甘氨酸浓度为10-100g/l，右旋糖酐-40浓度为10-50g/l，泊洛沙姆188浓度为1-5g/l时试剂盒检测结果的重复性良好，且当海藻糖浓度为20g/l，甘氨酸浓度为50g/l，右旋糖酐-40浓度为20g/l，泊洛沙姆188浓度为2g/l时为本发明试剂盒的最优选。
[0086]
表12.重复性检测结果
[0087][0088]
实施例5本发明试剂盒在市场上主流的凝血分析仪上的适用情况
[0089]
(1)本发明试剂盒在cs2400上的适用情况
[0090]
从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取血液样本共57份。血液按9:1的比例与0.109mol/l枸橼酸钠抗凝液混匀后，2500r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例1所得本发明试剂盒和siemens因子xi活性测定试剂盒(凝固法)分别在cs2400上对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数γ＝0.9955，线性回归方程为y＝-0.1139+1.0231x，见图9。
[0091]
根据美国临床实验室标准化组织(clsi)文件的要求(γ＞0.975)，本发明试剂盒和法国stago公司进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。
[0092]
(2)本发明试剂盒在sta-r evolution上的适用情况
[0093]
从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取血液样本共50份。血液按9:1的比例与0.109mol/l枸橼酸钠抗凝液混匀后，2500r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例1所得本发明试剂盒和stago公司xi因子(fxi)测定试剂盒(凝固法)分别在sta-r evolution上对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数γ＝0.9936，线性回归方程为y＝0.2994+0.9818x，见图10。
[0094]
根据美国临床实验室标准化组织(clsi)文件的要求(γ＞0.975)，本发明试剂盒和发过stago公司进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。
[0095]
(3)本发明试剂盒在acl top 750上的适用情况
[0096]
从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取血液样本共85份。血液按9:1的比例与0.109mol/l枸橼酸钠抗凝液混匀后，2500r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例1所得本发明试剂盒和il公司factor xi deficient piasma试剂盒分别在acl top 750上对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数γ＝0.9921，线性回归方程为y＝-0.9793+1.0233x，见图11。
[0097]
根据美国临床实验室标准化组织(clsi)文件的要求(γ＞0.975)，本发明试剂盒和美国il公司进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。
[0098]
综上，该发明试剂盒可适用于市场上常见的大多数全自动凝血分析仪。
[0099]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.保护剂，其特征在于，包括缓冲液、冻干保护剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐，其中，所述缓冲液包括hepes缓冲液、tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种；所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐-40和海藻糖中的至少一种；所述表面活性剂包括泊洛沙姆188和胆酸钠中的至少一种；所述防腐剂包括nan3、硫柳汞和环丙沙星中的至少一种；所述无机盐包括氯化钠和氯化钾中的至少一种。2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述缓冲液为hepes缓冲液，所述保护剂为甘氨酸、右旋糖酐-40和海藻糖，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，所述防腐剂为环丙沙星，所述无机盐为氯化钠。3.根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂由水、123.6～357.5g/l hepes缓冲液、10～50g/l海藻糖、10～100g/l甘氨酸、10～50g/l右旋糖酐-40、1～5g/l泊洛沙姆188、1～5g/l环丙沙星和0.1～1g/l氯化钠组成，所述保护剂的ph值为7.8。4.根据权利要求3所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂由水、240g/lhepes缓冲液、20g/l海藻糖、50g/l甘氨酸、20g/l右旋糖酐-40、2g/l泊洛沙姆188、2.5g/l环丙沙星和0.2g/l氯化钠组成，所述保护剂的ph值为7.8。5.权利要求1～4任一项所述的保护剂在制备凝血因子缺乏血浆或包含凝血因子缺乏血浆的试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述凝血因子缺乏血浆包括因子xi缺乏血浆。7.因子xi缺乏血浆或包含因子xi缺乏血浆的试剂盒，其特征在于，包括人乏xi因子血浆和权利要求1～4任一项所述的保护剂。8.根据权利要求7所述的因子xi缺乏血浆，其特征在于，所述保护剂与所述人乏xi因子血浆的体积比为(1～3):(7～9)。9.根据权利要求8所述的因子xi缺乏血浆，其特征在于，所述保护剂与所述人乏xi因子血浆的体积比为2:8。10.权利要求7～9任一项所述的因子xi缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及因子XI缺乏血浆保护剂及其应用。本发明提供了包括缓冲液、冻干保护剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐的保护剂，包括人乏XI因子血浆和保护剂的因子XI缺乏血浆以及因子XI缺乏血浆在制备凝血因子活性检测试剂或试剂盒中的应用。本发明提供的保护剂能够有效保障人乏XI因子血浆中蛋白的稳定性及活性，保护血浆中蛋白质免受冻干过程所造成的失活，进一步提高包含人乏XI因子血浆的产品性能。本发明提供的因子XI缺乏血浆适用于市场上常见的大多数全自动凝血分析仪。分析仪。


技术研发人员：谢永华 韩先乐
受保护的技术使用者：上海太阳生物技术有限公司
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/7/12