一种发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌及其在血红素合成中的应用

1.本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌及其在血红素合成中的应用。


背景技术：

2.解淀粉芽胞杆菌是一种食品级的工业微生物，广泛用于食品、药品等领域。但传统的芽胞杆菌发酵食品常具有强烈异味，影响了食品的感官品质和适用性。研究表明芽胞杆菌发酵时产生的令人不适的气味主要是汗臭、尸臭、鱼腥、氨味等。如纳豆在二次发酵过程中会产生强烈的氨气味，1-脱氧野尻霉素生产过程中产生的难闻汗臭气味(参考文献：chenlu hong,yangyang chen,lu li,shouwen chen,xuetuan wei*.identification of a key gene involved in branched-chain short fatty acids formation in natto by transcriptional analysis and enzymatic characterization in bacillus subtilis.journal of agricultural and food chemistry.2017,65,1592-1597.)。此外，芽胞杆菌发酵中腐胺和尸胺是形成尸臭味的主要原因，这些物质本身没有直接的毒性，但影响芽胞杆菌发酵食品的风味和品质，并可与亚硝酸盐相互作用形成致癌物亚硝胺。因此，本发明通过crispr/cas9n技术敲除了解淀粉芽胞杆菌的臭味物质形成相关基因，以此通过阻断氨气、腐胺和短链支链脂肪酸的生成，构建了一株脱臭解淀粉芽胞杆菌，减少了发酵臭味的生成，改善发酵品质。进一步将脱臭菌株应用于血红素生产中，显著提升了血红素的产量。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于通过crispr/cas9n基因敲除技术获得一种发酵脱臭的解淀粉芽胞杆菌工程菌hzc9nδgpsu，该菌株以解淀粉芽胞杆菌hz-12为出发菌株整合cas9n蛋白表达元件，在此基础上敲除了臭味形成相关基因gudb、ptb、spea、urec，减少了氨气、腐胺和短链脂肪酸的生成，显著降低了发酵臭味的生成，极大地提高了发酵品质。在此基础上异源表达血红素关键合成基因dhema，与未脱臭菌株相比，显著提升了血红素的产量。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.一种发酵脱臭的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述工程菌是在解淀粉芽胞杆菌hz-12中通过crispr/cas9n技术敲除gudb、ptb、spea、urec基因，基因gudb、ptb、spea、urec的核苷酸序列如seq id no.1到no.4所示。具体的构建方法包括如下步骤：
6.(1)采用本实验室保存的解淀粉芽胞杆菌hz-12为出发菌，该菌株已在论文“metabolic engineering of bacillus amyloliquefaciens for enhanced production of s-adenosylmethionine by coupling of an engineered s-adenosylmethionine pathway and the tricarboxylic acid cycle”(biotechnology for biofuels.2019,12,211)中公布，分析hz-12基因组dna序列，找出4个hz-12发酵臭味形成相关基因(gudb、ptb、
spea及urec)，其基因序列见seq id no.1到no.4；以gudb基因为例，根据基因序列设计靶标gudb基因的sgrna；根据解淀粉芽胞杆菌hz-12全基因组序列中的gudb基因上下游序列约500bp左右，设计上下游同源臂a和b；将sgrna、终止子tamyl、同源臂a和b连接后形成的融合基因克隆到含p43(rbs free)启动子的穿梭载体中，构建gudb基因的sgrna表达质粒；用同样的方法还构建了ptb、spea及urec基因的sgrna表达质粒；
7.(2)将p43启动子、cas9n蛋白基因、终止子tamyl融合表达元件整合至解淀粉芽胞杆菌hz-12基因组上，获得工程菌株hzc9n；将构建的gudb基因的sgrna表达质粒电转化到工程菌株hzc9n感受态细胞中，转化细胞涂布在四环素抗性平板上，在37℃培养箱中生长16-20小时，挑取平板中的转化子进行pcr验证；选取验证正确的转化子接种到无抗的lb液体培养基中，在37℃恒温摇床中培养12h，稀释涂布至无抗的lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中，待平板上长出菌落后，用灭菌牙签挑取单菌落分别点在无抗的lb平板和抗性的lb平板上，经过培养后，在lb平板上正常生长但在抗性平板上完全不长的的菌落即为质粒消除的基因缺失工程菌株hzc9nδgudb；
8.(3)用上述同样的方法在工程菌株hzc9nδgudb的基础上，依次叠加敲除基因ptb、spea及ure，最终获得四基因缺失的发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu。
9.为了验证工程菌株hzc9nδgpsu的脱臭能力，以豆粕发酵为例，分别接种一定比例的对照菌株hzc9n和脱臭菌株hzc9nδgpsu于豆粕固体培养基中(豆粕:水＝1:1)。静态发酵48小时检测分析不同菌株发酵物中发现，臭味形成相关基因敲除后氨气的产量降低了88％，腐胺产量降低了70％，短链支链脂肪酸的总相对含量也降低了62％，且通过嗅觉鉴定对比，脱臭菌株发酵异味基本消除。综上结果说明，基因敲除构建的脱臭菌株hzc9nδgpsu有效降低了发酵异味的产生。
10.通过在发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu中异源强化表达血红素关键合成基因dhema，具体的构建方法包括如下步骤：将基因dhema克隆到穿梭表达载体(含启动子p43，终止子tamyl)中，构建表达质粒；然后将表达质粒通过电转的方式分别导入解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu感受态细胞和对照菌株hzc9n感受态细胞中，分别将转化子涂布于抗性平板，采用菌落pcr筛选阳性转化子。将验证正确的转化子分别命名为hzc9nδgpsu/phy-dhema、hzc9n/phy-dhema。
11.为了检测菌株hzc9nδgpsu/phy-dhema生产血红素的能力，挑取菌落hzc9nδgpsu/phy-dhema、对照菌株hzc9n/phy-dhema分别接种于lb培养基中进行种子培养，按照一定的接种量接种到血红素发酵培养基中(葡萄糖20g/l，(nh4)2hpo
4 4g/l，酵母粉5g/l，feso
4 0.8g/l，kh2po
4 6.67g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，柠檬酸0.8g/l，l-谷氨酸水合物5g/l，ph6.5)，在37℃的恒温摇床振荡培养72h，取样检测血红素的产量。检测结果表明脱臭菌株hzc9nδgpsu/phy-dhema的血红素产量高达51.29mg/l，较对照菌株hzc9n/phy-dhema提高了1.42倍。这说明菌株敲除gudb、ptb、spea、urec基因不仅改善了发酵的品质，更有效提高了菌株生产血红素的能力。
12.与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
13.(1)在解淀粉芽胞杆菌hz-12中成功进行异味物质形成相关基因(gudb、ptb、spea、urec)的敲除，由此获得发酵脱臭的解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu，该菌株在豆粕固体发酵中异味物质(氨气、腐胺、短链脂肪酸)生成量显著降低。
14.(2)在发酵脱臭的解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu中异源表达血红素关键合成基因dhema，血红素产量高达51.29mg/l，比未脱臭宿主菌hzc9n/phy-dhema的血红素产量提高了1.42倍。
附图说明
15.图1为叠加敲除四个基因(gudb、peb、spea、urec)的脱臭工程菌株hzc9nδgpsu的菌落pcr验证胶图。
16.图2为解淀粉芽胞杆菌hzc9n、hzc9nδgpsu豆粕固体发酵产氨气能力比较图。
17.图3为解淀粉芽胞杆菌hzc9n、hzc9nδgpsu豆粕固体发酵中腐胺产量比较图。
18.图4为解淀粉芽胞杆菌hzc9n、hzc9nδgpsu豆粕固体发酵短链脂肪酸相对含量对比图。
19.图5为解淀粉芽胞杆菌hzc9n/phy-dhema、hzc9nδgpsu/phy-dhema发酵产血红素能力对比图。
具体实施方式
20.以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。
21.实施例1解淀粉芽孢杆菌hzc9nδgpsu的构建
22.1.sgrna表达载体的构建
23.根据本实验测得的解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciens)hz-12全基因组序列中的gudb、ptb、spea、urec基因分别设计sgrna，其序列如seq id no.5-8所示。
24.根据gudb基因上下游序列，设计了gudb基因的两个同源臂的引物gudb-af/ar和gudb-bf/br，以解淀粉芽胞杆菌hz-12的基因组dna作为模板分别扩增上下游同源臂(a，b)。用同样的方法依次获得基因ptb、spea、urec的上下游同源臂，扩增基因同源臂用到的所有引物如表1所示。
25.表1扩增基因同源臂的引物
26.[0027][0028]
以tamyl-f/r为引物(seq id no.9和10)，以地衣芽胞杆菌wx-02基因组为模板扩增终止子tamyl。
[0029]
将pcr产物纯化回收后，通过soe-pcr连接sgrna(gudb)、终止子tamyl和上下游同源臂(a+b)。将连接片段进行xba i和hind iii双酶切处理，产物回收纯化后，得到的soe-pcr酶切片段与经同样xba i和hind iii双酶切处理过的含p43(rbs free)启动子的穿梭型质粒phy300plk/prf进行酶连，将构建的表达质粒phy-sgrna(gudb)通过钙转化的方式转化到escherichia coli dh5α感受态细胞中，将所有转化子涂布在带有四环抗性的平板后置于37℃恒温箱培养12h，挑取平板上的单菌落划线新的四环平板后置于37℃恒温箱培养8h，然后设计质粒通用引物进行菌落pcr验证。将pcr产物进行电泳验证后，挑取条带正确的阳性转化子进行培养，抽提质粒并送公司测序，将测序结果在ncbi上进行比对。同时，通过快切酶xba i和hind iii将结果正确的phy-sgrna(gudb)游离表达质粒再次进行双酶切鉴定，进一步确认插入序列的正确性。用同样的方法构建表达质粒phy-sgrna(ptb)、phy-sgrna(spea)、phy-sgrna(urec)。2.整合cas9n蛋白菌株的构建
[0030]
依据实验室保存cas9n表达质粒设计引物，将cas9n表达框(含启动子p43、终止子tamyl)分为两段(pcas9nt-1/pcas9nt-2，基因序列见seq id no.11和no.12)整合至b.amyloliquefaciens hz-12的xkdg整合位点。首先根据xkdg序列上下游设计同源臂(xa/xb，基因序列见seq id no.13和no.14)，将同源臂xa、pcas9nt-1、同源臂xb按顺序通过soe-pcr连接，产物回收纯化后，用限制性内切酶xba i和bamh i双酶切soe-pcr片段然后再次纯化回收。同时用同样双酶切处理温敏型敲除质粒t2(2)-ori。将酶切过后的片段和质粒用t4连接酶进行酶连，在25℃条件下保持2h，酶连完成后将连接产物钙转化至e.coli dh5α感受态细胞。采用t2-f/r引物对转化单菌落进行菌落pcr验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和dna测序验证，验证正确即成功构建第一部分整合质粒t2::pcas9nt-1。采用上述同样的方法成功构建第二部分整合质粒t2::pcas9nt-2。
[0031]
将t2::pcas9nt-1质粒电转入野生型解淀粉芽胞杆菌hz-12感受态细胞中，然后涂
布于含卡那霉素(kan)抗性的平板上，37℃恒温培养箱放置16-20h。设计质粒通用验证引物t2-f/r和整合片段验证引物cy-f/r，将两对引物交叉分别进行转化菌落的pcr验证，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测。挑取条带正确的转化子进行单交换和双交换筛选从而得到目的整合工程菌，命名为解淀粉芽胞杆菌hzc9n-1。以转化hzc9n-1为出发菌株，在此基础进行第二部分的整合。采取上述同样的实验方法进行t2::pcas9nt-2质粒的转化验证，最终得到的cas9n表达元件完全整合菌株，命名为解淀粉芽胞杆菌hzc9n，该菌株整合p43启动子、cas9n蛋白、tamyl终止子。该步骤在解淀粉芽胞杆菌hz-12中引入了异源cas9n蛋白，为crispr系统的构建奠定了基础。
[0032]
3.基因缺失菌株的构建
[0033]
将表达质粒phy-sgrna(gudb)电转至解淀粉芽胞杆菌hzc9n感受态细胞中，全部细胞涂布于带有四环素抗性的平板，37℃恒温培养箱中培养16
ꢀ‑
24h得到对应的转化子，挑取一定数量的转化子于对应平板划线培养8h左右进行菌落pcr验证，挑取验证正确的单菌落接种于5ml带四环素抗性的lb液体培养基中，在37℃恒温摇床(180r/min)中培养12h，然后稀释涂布到无抗的lb培养皿上，置于37℃的恒温箱中培养。待菌落长出后，挑取单菌落分别在无抗的lb平板和四环抗性的lb平板上对应点种，那些在lb平板上生长但在四环素平板上不长的菌落即为质粒消除的目的工程菌hzc9nδgudb。采取同样的方法依次进行基因ptb、spea、urec的叠加敲除，最终得到完全敲除菌株hzc9nδgpsu。用各基因验证引物进行验证，如图1所示，四组对照菌株和工程菌株对应pcr的条带差值(泳道1和2、3和4、5和6、7和8)刚好为删除四个基因片段(gudb、ptb、spea、urec)的相应大小，这说明四基因缺失菌株构建成功。将验证正确的菌落挑取于5ml带四环素抗性的液体lb培养基中，在37℃恒温摇床(180r/min)中培养12h，取800μl菌液进行菌株保藏，然后将菌株甘油管置于-80℃超低温冰箱保存。
[0034]
实施例2脱臭解淀粉芽孢杆菌hzc9nδgpsu用于豆粕固体发酵
[0035]
分别挑取解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu和hzc9n的单菌落接种于5ml的lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床(180r/min)振荡培养过夜，再将菌液以4％的接种量分别转接到50ml的lb液体培养基中。待菌株生长到od
600
为3.0-4.0左右时，以10％的接种量接种到20g的豆粕固体发酵培养基中(豆粕:h2o＝1:1)，在37℃恒温培养箱静态培养48h。取固体发酵样用气相色谱质谱法检测短链脂肪酸的比例。将剩下的固体发酵样加两倍蒸馏水在180r/min的条件下振荡提取后取液体样检测氨气、腐胺的含量。其中氨气的生成采用靛酚蓝法进行检测，腐胺含量选择高效液相色谱法检测。
[0036]
氨气的生成如图2所示，与对照菌株相比，解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu的氨气生成显著降低，约为对照菌株的12％。如3所示，解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu的腐胺产量为30.76μg/g，降低为对照菌株的30％。从图4可以看出，在进行关键基因敲除后，脱臭菌株产异丁酸和异戊酸的能力都显著下降，总体短链支链脂肪酸(bcfas)的相对含量降低为对照菌株的38％。综上，脱臭菌株在豆粕固体发酵中氨气、腐胺、短链支链脂肪酸的含量均显著下降，这说明基因敲除有效地改善了芽胞杆菌发酵产臭味的问题。
[0037]
实施例3菌株hzc9nδgpsu/phy-dhema的构建
[0038]
根据ncbi中注释的地衣芽胞杆菌谷氨酰-trna还原酶序列设计引物，以实验室保存的地衣芽胞杆菌dj-6为模板，以
[0039]
dhema-f:5
’‑
gctctaga atgcatatacttgtcgtgggat-3’[0040]
dhema-r:5
’‑
cgggatcc tcactcgctcgcgatagaa-3’[0041]
为引物扩增得到dhema基因，其核苷酸序列如seq id no.15所示。将扩增出来的片段纯化回收后用限制性内切酶bamh i和xba i双酶切，同样用bamh i和xba i双酶切处理穿梭型质粒phy300plk/pt17。分别将酶切片段进行纯化回收。然后按比例条件，到达时间后将酶连产物转化到e.coli dh5α感受细胞中。涂布于带有四环抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后划线培养于相同抗性的平板上培养8h左右，使用质粒通用引物进行菌落pcr验证。经电泳验证后挑选验证正确的阳性克隆子培养，抽提质粒并经公司测序，在ncbi上比对结果，同时对正确游离表达质粒进行双酶切鉴定确认插入序列正确无误，即成功构建游离表达质粒phy-dhema。
[0042]
将游离表达载体phy-dhema通过电转化的方式分别转化到解淀粉芽孢杆菌hzc9nδgpsu和对照菌株hzc9n的感受态细胞中，将全部转化子涂布于四环素抗性平板。置于37℃恒温培养箱8-12小时，挑取单菌落进行划线培养pcr验证。将验证正确的菌落接种于5ml带四环素抗性的液体培养基中。37℃恒温摇床(180r/min)培养过夜后，取800μl菌液到甘油管中并置于-80℃超低温冰箱保存。利用基因工程改造获得的工程菌命名为hzc9nδgpsu/phy-dhema，对照菌株命名为hzc9n/phy-dhema。
[0043]
实施例4脱臭解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu在血红素生产中的应用
[0044]
分别挑取解淀粉芽胞杆菌hzc9nδgpsu/phy-dhema和对照菌hzc9n/phy-dhema单菌落接种于5ml带四环素抗性的lb培养基中，在37℃恒温摇床(180r/min)培养过夜。将菌液分别以4％的接种量二次转接到50ml的lb培养基中。当菌液od
600
到达3.0-4.0时，将菌液以3％的接种量分别接种到25ml的血红素高产培养基中(葡萄糖20g/l，(nh4)2hpo
4 4g/l，酵母粉5g/l，feso
4 0.8g/l，kh2po
4 6.67g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，柠檬酸0.8g/l，l-谷氨酸水合物5g/l，ph 6.5)，置于37℃恒温摇床(180r/min)振荡培养60h。采取样品后利用荧光法检测发酵液中血红素浓度，包括检测菌体胞内、胞外以及全部的血红素含量。
[0045]
血红素产量如图5所示，菌株hzc9nδgpsu/phy-dhema的血红素产量高达51.29mg/l，较对照组显著提高了1.42倍。因此，同样在脱臭解淀粉芽孢杆菌hzc9nδgpsu和对照菌hzc9n中异源强化表达基因dhema，解淀粉芽孢杆菌hz-12敲除4个臭味形成相关基因gudb、ptb、spea、urec后，生产血红素的能力大大提升，脱臭菌株hzc9nδgpsu在血红素的微生物发酵生产应用中有着极高的价值。

技术特征：
1.发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是以解淀粉芽胞杆菌hz-12为出发菌株，敲除异味物质形成相关基因gudb、ptb、spea及urec。2.根据权利要求1所述的发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，基因gudb的核苷酸序列如seq id no.1所示，基因ptb的核苷酸序列如seq id no.2所示，基因spea的核苷酸序列如seq id no.3所示，基因urec的核苷酸序列如seq id no.4所示。3.权利要求1所述的发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌在减少豆粕发酵中氨气、腐胺、短链支链脂肪酸生成中的应用。4.权利要求1所述的发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌在血红素合成中的应用，其特征在于，在所述的发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌中异源表达基因dhema，所述基因dhema的核苷酸序列如seq id no.5所示。5.一株高产血红素的解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是以解淀粉芽胞杆菌hz-12为出发菌株，敲除异味物质形成相关基因gudb、ptb、spea及urec，并异源表达基因dhema；基因gudb的核苷酸序列如seq id no.1所示，基因ptb的核苷酸序列如seq id no.2所示，基因spea的核苷酸序列如seq id no.3所示，基因urec的核苷酸序列如seq id no.4所示，基因dhema的核苷酸序列如seq id no.15所示。

技术总结
本发明公开了一种发酵脱臭解淀粉芽胞杆菌工程菌及其在血红素合成中的应用，该工程菌以解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌株，在出发菌株中通过CRISPR/Cas9n基因敲除技术叠加敲除基因gudB、ptb、speA、ureC得到发酵脱臭的解淀粉芽胞杆菌HZC9n


技术研发人员：魏雪团 姜聪 马爱民
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/7/12