一种壳聚糖季铵盐的制备方法

1.本发明属于壳聚糖抗菌剂的制备及应用领域，特别是涉及一种壳聚糖季铵盐的制备方法及其在抑菌、抑制细菌生物被膜方面的应用。


背景技术：

2.生物被膜是细菌在生长繁殖的过程中为适应自然环境而粘附在物表的一种自我保护方式，是细菌在自然界中存在的主要形式。生物被膜形成后不仅可以适应外界环境的变化，还可以像盾牌一样阻止药物的进攻，躲避药物的作用，产生耐药性。目前，常见的抗菌剂中有机小分子抗菌剂虽然具有杀菌迅速的特点，但是易产生耐药性。
3.壳聚糖具有广谱抗菌性，但是单纯的壳聚糖其抗菌性能并不显著，且溶解性受到限制，改性壳聚糖的抗菌性能研究已经取得较为显著的进展。通过对壳聚糖的季铵化改性，不仅可以提高壳聚糖的溶解性，还能提高壳聚糖的抗菌性能。
4.鉴于此，本案发明人对上述问题进行深入研究，遂有本案产生。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种操作简便，原料来源方便，易溶于水，兼具抗菌和抑制生物被膜形成及生物被膜清除功能的壳聚糖季铵盐的制备方法。
6.为了达到上述目的，本发明采用这样的技术方案：
7.一种壳聚糖季铵盐的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤1，制作含羧基的小分子季铵盐；
9.步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中，得到质量百分浓度为1％-5％的壳聚糖溶液；
10.步骤3，将上述的小分子季铵盐溶解在水或者水/乙醇的混合溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，至完全溶解得到小分子季铵盐溶液；
11.步骤4，将小分子季铵盐溶液加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为20-50℃，反应时间为12-48h；
12.步骤5，反应结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的小分子季铵盐，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
13.作为本发明的优选方式，步骤1是将a物质溶解在有机溶剂中，a物质的质量百分浓度为0.5-20％，加入b物质，在50-140℃，反应4-48h，反应结束后，经过抽滤、洗涤以及干燥得到小分子季铵盐，
14.其中，a物质为对氯甲基苯甲酸、对溴甲基苯甲酸、氯乙酸、氯丙酸或溴乙酸；b物质为n,n-二甲基十二烷基胺、三甲胺、n,n-二甲基丁胺、n,n-二甲基辛胺、n,n-二甲基十四胺、n-甲基吗啉、n-甲基哌啶或吡啶；
15.作为本发明的优选方式，所述有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮、石油醚和乙
腈中一种或多种。
16.作为本发明的优选方式，所述a物质为对氯甲基苯甲酸，所述b物质为n,n-二甲基十二烷基胺，两者的摩尔比为1:1-2。
17.作为本发明的优选方式，步骤2中，所述醋酸水溶液的质量百分浓度为1％～5％。
18.作为本发明的优选方式，所述小分子季铵盐的量为壳聚糖摩尔量的1-3倍。
19.作为本发明的优选方式，步骤3中，小分子季铵盐的质量百分浓度为1％-10％。
20.作为本发明的优选方式，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1。
21.作为本发明的优选方式，步骤3中，小分子季铵盐和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1-3。
22.作为本发明的另一种优选方式，步骤1中含羧基的小分子季铵盐为异烟酸季铵盐。
23.采用本发明技术方案，首先合成端羧基小分子，而后在edc和nhs的作用下，将小分子接枝到壳聚糖分子链上，超滤浓缩即可得到壳聚糖季铵盐。采用本发明的制备方法合成的壳聚糖季铵盐抗菌剂的水溶性好，抑、抗菌活性高，能抑制生物被膜形成，对成熟的细菌生物被膜具有一定的清除效果。
附图说明
24.图1为实施例1中n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的1hnmr。
25.图2为实施例1中n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的
13
cnmr。
26.图3为实施例1中壳聚糖季铵盐的1h nmr。
27.图4为实施例2中n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的1h nmr。
28.图5为实施例2中n-(4羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的
13
c nmr。
29.图6为实施例2中壳聚糖季铵盐的1h nmr。
30.图7为实施例3中n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺的1h nmr。
31.图8为实施例3中n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺的
13
c nmr。
32.图9为实施例3中壳聚糖季铵盐的1h nmr。
33.图10为实施例4中异烟酸季铵盐的1h nmr。
34.图11为实施例4中异烟酸季铵盐的
13
c nmr。
35.图12为实施例4中壳聚糖季铵盐的1h nmr。
36.图13为实施例5中异烟酸季铵盐的1h nmr。
37.图14为实施例5中异烟酸季铵盐的
13
c nmr。
38.图15为实施例5中壳聚糖季铵盐的1h nmr。
具体实施方式
39.参照图1至图15，为了进一步解释本发明的技术方案，下面结合实施例进行详细阐述。
40.实施例1
41.步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入2.2kg n,n-二甲基十二烷基胺，升高温度至85℃，回流搅拌8h，反应过程中
有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺。
42.步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％；其中壳聚糖可直接从市面上购买。
43.步骤3、称取3.87kg n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kg n-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季铵盐溶液，溶液中n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的质量百分浓度为7.7％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
44.步骤4、将小分子季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比可为1:1。
45.步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的n-(4-羧基苄基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺和羧基活化剂(edc和nhs)，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
46.实施例2
47.步骤1、称取0.95kg对氯乙酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入2.3kg n,n-二甲基十二烷基胺，升高温度至85℃，回流搅拌8h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺。
48.步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在50kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为3.2％。
49.步骤3、称取3.70kg n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺溶解在100kg水中，加入2.30kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2.3kg n-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季铵盐溶液，溶液中n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺的质量百分浓度为3.7％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
50.步骤4、将小分子季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后30℃反应24h，本实施例中，n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1.2:1。
51.步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的n-(羧甲基)-n,n-二甲基十二烷基氯化胺和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
52.实施例3
53.步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入1.0kg n-甲基哌啶，升高温度至85℃，回流搅拌10h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺。
54.步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％。
55.步骤3、称取2.70kg n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kg n-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季铵盐溶液，溶液中n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺的质量百分浓度为7.7％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
56.步骤4、将小分子季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1:1。
57.步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的n-(4-羧基苄基)-n-甲基哌啶氯化胺和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
58.实施例4
59.步骤1、称取1.79kg异烟酸叔丁酯加入到反应釜中，搅拌状态下加入2.25kg氯代十二烷，升高温度至130℃，回流搅拌36h，反应结束后用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得异烟酸叔丁酯季铵盐；异烟酸叔丁酯季铵盐溶解在甲酸中，室温搅拌24h，旋蒸除去甲酸，乙酸乙酯洗涤，干燥得异烟酸季铵盐。
60.步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在50kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为3.2％。
61.步骤3、称取3.84kg异烟酸季铵盐溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kg n-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子季铵盐溶液，溶液中异烟酸季铵盐的质量百分浓度为3.84％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
62.步骤4、将小分子季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，异烟酸季铵盐与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1:1。
63.步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的异烟酸季铵盐和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
64.实施例5
65.步骤1、称取1.5kg异烟酸溶解于30kg n,n-二甲基甲酰胺中，，搅拌状态下加入9.0kg 1,3-丙磺酸内酯，升高温度至60℃，回流搅拌24h，反应结束后抽滤，滤饼用n,n-二甲基甲酰胺洗涤多次，乙酸乙酯洗涤，干燥得异烟酸季铵盐。
66.步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在50kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为3.2％。
67.步骤3、称取2.45kg异烟酸季铵盐溶解在50kg水中，加入2.30kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2.3kg n-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到异烟酸季铵盐溶液，溶液中异烟酸季铵盐的质量百分浓度为2.45％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1。
68.步骤4、将异烟酸季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后25℃反应24h，本实施例中，异烟酸季铵盐与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1.2:1。
69.步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的异烟酸季铵盐和羧基活化剂，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
70.二、抗菌性能测试
71.采用平板计数法对实施例中壳聚糖季铵盐的抗菌性能进行检测，通过公式1计算抑菌率，制备的壳聚糖季铵盐具有良好的抑菌活性，其抗菌活性均优于壳聚糖。
[0072][0073]
表1不同浓度的壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
[0074]
组别2.5mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml壳聚糖原料61.69％46.39％23.58％实施例1100％100％100％实施例2100％100％100％实施例3100％100％100％实施例4100％100％100％实施例5100％100％100％
[0075]
表2不同浓度的壳聚糖季铵盐对大肠杆菌的抑菌效果
[0076]
组别2.5mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml壳聚糖原料45.37％21.33％10.39％实施例1100％100％100％实施例2100％98.18％93.66％实施例398.14％96.98％76.80％实施例4100％98.62％96.03％实施例5100％98.18％93.66％
[0077]
通过比浊法测定实施例中壳聚糖季铵盐的最低抑菌浓度(mic)和最低生物被膜抑制浓度(mbc)，结合平板计数法测定实施例中壳聚糖季铵盐的最低杀菌浓度(mbc)和最低生物被膜杀灭浓度(mbbc)。
[0078]
在96孔板中加入稀释好的菌液100μl和100μl经倍半稀释后的壳聚糖溶液，再分别做一个只加壳聚糖季铵盐溶液不加菌液的对照组和只加菌液不加壳聚糖季铵盐溶液的对照组，每个浓度的壳聚糖季铵盐做3组平行，于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖季铵盐最低浓度作为mic，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μl进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低浓度记为mbc。
[0079]
在96孔板中加入稀释好的菌液置于37℃培养箱中培养36-48h，使菌液在孔板上形成生物被膜，然后弃去浮游菌，用无菌生理盐水或pbs漂洗，干燥固定，向96孔板中加入稀释好的壳聚糖季铵盐样品溶液100μl和100μl培养基，以无菌水作为对照组，置于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖季铵盐最低浓度作为mbic，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μl进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低壳聚糖季铵盐浓度记为mbbc，通过最低抑菌浓度和最低杀菌浓度数据可以表明改性后的壳聚糖的抗浮游菌活性和抗被膜菌活性均有提升。
[0080]
表3金黄色葡萄球菌bf形成前后耐药性的变化
[0081][0082]
表4大肠杆菌bf形成前后耐药性的变化
[0083][0084][0085]
结晶紫染色的方法可以快速简便的测量药物对生物被膜的干预作用。通过不同药物作用下od值的大小，可以反应壳聚糖季铵盐对生物被膜形成的抑制强弱。
[0086]
在96孔板中加入稀释好的菌液100μl和100μl稀释至一定浓度的壳聚糖季铵盐溶液(4mic、2mic、mic)，以水为对照组，壳聚糖季铵盐的终浓度为2mic、mic和1/2mic。每个浓度的药物做3组平行，于37℃恒温箱中培养36-48h，然后弃去浮游菌及壳聚糖季铵盐溶液，用无菌生理盐水漂洗，干燥固定，加入0.1％的结晶紫溶液染色15min，弃去结晶紫溶液并用无菌生理盐水漂洗3次，无菌风干燥。加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪在595nm处测定吸光度，通过式2计算生物被膜形成抑制率。
[0087][0088]
表5壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌生物被膜形成抑制效果
[0089]
组别1/2micmic2mic壳聚糖原料30.78％56.03％74.53％实施例176.96％82.34％92.90％实施例266.89％81.37％92.79％实施例350.18％91.61％93.67％实施例470.30％80.81％92.55％实施例559.67％83.52％91.91％
[0090]
表6壳聚糖季铵盐对大肠杆菌生物被膜形成抑制效果
[0091]
组别1/2micmic2mic壳聚糖原料28.43％43.89％60.55％实施例176.43％86.94％89.76％实施例255.55％86.59％89.99％实施例376.47％85.25％90.55％实施例456.84％73.25％80.86％实施例552.23％70.46％76.16％
[0092]
在96孔板中加入稀释好的菌液200μl，然后置于37℃恒温培养箱中培养36-48h，弃去菌液，无菌生理盐水漂洗，干燥固定，然后加入壳聚糖季铵盐溶液200μl，无菌水作为对照组，37℃培养箱中恒温1h，弃去壳聚糖溶液，无菌生理盐水漂洗，结晶紫染色，干燥，加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪测定595nm处的吸光度，通过公式3计算生物被膜的清除率。
[0093][0094]
表7壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌生物被膜清除效果
[0095]
组别2.5mg/ml5.0mg/ml壳聚糖原料41.47％67.47％实施例192.93％93.98％实施例293.07％94.28％实施例385.68％92.88％实施例492.57％93.91％实施例573.30％78.25％
[0096]
表8壳聚糖季铵盐对大肠杆菌生物被膜的清除效果
[0097]
[0098][0099]
上述结果表明，通过该方法制备的壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有效果，还能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物被膜形成，对成熟的生物被膜有一定的清除作用，且作用效果均优于未改性的壳聚糖原料。
[0100]
本发明的产品形式并非限于本案实施例，任何人对其进行类似思路的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

技术特征：
1.一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，制作含羧基的小分子季铵盐；步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中，得到质量百分浓度为1％-5％的壳聚糖溶液；步骤3，将上述的小分子季铵盐溶解在水或者水/乙醇的混合溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，至完全溶解得到小分子季铵盐溶液；步骤4，将小分子季铵盐溶液加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为20-50℃，反应时间为12-48h；步骤5，反应结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的小分子季铵盐，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。2.如权利要求1所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，步骤1是将a物质溶解在有机溶剂中，a物质的质量百分浓度为0.5-20％，加入b物质，在50-140℃，反应4-48h，反应结束后，经过抽滤、洗涤以及干燥得到小分子季铵盐，其中，a物质为对氯甲基苯甲酸、对溴甲基苯甲酸、氯乙酸、氯丙酸或溴乙酸；b物质为n,n-二甲基十二烷基胺、三甲胺、n,n-二甲基丁胺、n,n-二甲基辛胺、n,n-二甲基十四胺、n-甲基吗啉、n-甲基哌啶或吡啶。3.如权利要求1所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮、石油醚和乙腈中一种或多种。4.如权利要求3所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，所述a物质为对氯甲基苯甲酸，所述b物质为n,n-二甲基十二烷基胺，两者的摩尔比为1:1-2。5.如权利要求4所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述醋酸水溶液的质量百分浓度为1％～5％。6.如权利要求4所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，所述小分子季铵盐的量为壳聚糖摩尔量的1-3倍。7.如权利要求6所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，步骤3中，小分子季铵盐的质量百分浓度为1％-10％。8.如权利要求7所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1。9.如权利要求8所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，步骤3中，小分子季铵盐和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1-3。10.如权利要求1所述的一种壳聚糖季铵盐的制备方法，其特征在于，步骤1中含羧基的小分子季铵盐为异烟酸季铵盐。

技术总结
本发明涉及一种壳聚糖季铵盐的制备方法，包括如下步骤：步骤1，制作含羧基的小分子季铵盐；步骤2，将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中，得到质量百分浓度为1％-5％的壳聚糖溶液；步骤3，将上述的小分子季铵盐溶加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺得到小分子季铵盐溶液；步骤4，将小分子季铵盐溶液加入到壳聚糖溶液中进行反应；步骤5，反应结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤除去未参与反应的小分子季铵盐，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。采用本发明的制备方法合成的壳聚糖季铵盐抗菌剂的水溶性好，抑、抗菌活性高，能抑制生物被膜形成，对成熟的细菌生物被膜具有一定的清除效果。一定的清除效果。一定的清除效果。


技术研发人员：李明春 王林 辛梅华 张涛 陈琦
受保护的技术使用者：华侨大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/12