一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法

1.本发明涉及蓝藻水华治理技术领域，具体涉及一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法。


背景技术：

2.随着我国养殖业的迅猛发展，密集型的养殖和周围环境污染导致物质循环调控功能较弱的养殖池塘水体富营养化呈现加剧态势，并进一步致使一些浮游的、有害藻类(如：微囊藻、长孢藻、假鱼腥藻、颤藻等)大量滋生引发水华。这些现象的频繁发生，严重恶化养殖生态，导致水体溶解氧降低，致使鱼、虾、贝等水产品缺氧而大量死亡，造成一定经济损失。同时，一些蓝藻会产生并释放藻毒素(如：微囊藻毒素，肝毒素等)，不仅对鱼虾贝类产生毒性效应，而且通过食物链富集于体内，进而威胁人类饮食健康。因此，控制养殖水体中的有害藻类对养殖产业的绿色健康发展至关重要。
3.控制蓝藻水华的方法包括物理方法、化学方法和生物方法。与自然水体相比，养殖池塘有害藻类的控制更需考虑对其他水生生物的影响，相较于应用范围较小的物理除藻和具有“二次污染”风险的化学控藻方法，应多采用生物调控进行抑藻。近年来，基于种间竞争的原理，通过定向培育有益藻类以抑制有害藻的的生长，从而改变养殖水体藻类群落结构的技术在水产养殖中得到了较为广泛的应用。所培育的有益藻类既可以作为水产动物的饵料，也可以在养殖水体中通过光合放氧，间接发挥调节生态系统稳定性的功能。然而，影响种间竞争结果的因素众多，浮游藻类自身生物特性，如生长速率、对营养盐的不同利用策略、产毒特性、产化感物质特性等均可影响种间竞争的结果。此外，温度、营养盐形态及浓度等也会造成浮游植物群落的定向演替结果发生改变。因此，利用种间竞争进行养殖水体中有害蓝藻的控制，需依赖于了解养殖水体中关键环境指标和藻株自身生物特性对种间竞争影响的基础上，进一步筛选出性状优良的有益藻株。另外，对于高位的蓝藻生物量，直接采用投加绿藻的方法不足以对蓝藻产生较明显的效果。因此，集成蓝藻杀藻剂应急处置和投放快速生长绿藻竞争性抑制蓝藻成为控制养殖池塘蓝藻水华的技术方向之一。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，基于种群竞争的生态学原理，通过定向培育有益藻类以抑制有害藻生长，从而改变藻类群落结构；采用化学法和生物法联合抑藻，并针对不同情形下的蓝藻水华，开展一系列针对不同生物量水华的串联技术参数的研究，具有高效性、选择性和生态风险性小等特点。
5.为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
6.本发明的技术构思为：从生长抑制性竞争和营养性竞争两个层面开展潜在藻株的筛选和评价，并结合不同水华一年内不同季节微囊藻的组成和生物量的较大差异，开展了一系列针对野外水体不同生物量水华的串联技术参数的研究，以获取此种串联集成技术最
适宜使用且有效的水华情形，并在野外原位开展了验证工作。
7.一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，包括以下步骤：
8.步骤1、潜在藻株的筛选：从生长抑制性竞争和营养性竞争两个层面对原位藻株及室内保藏藻株进行筛选；
9.步骤2、筛选藻株的评价：结合养殖池塘实际需求，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定，获取具潜力的藻株，进一步评价筛选藻株与微囊藻的竞争能力；
10.步骤3、集成蓝藻杀藻剂应急处置和投放绿藻，形成竞争性抑制养殖池塘蓝藻水华。
11.可选地，所述步骤1中，对于营养性竞争效应的筛选基于快速生长的绿藻进行，将藻株在250ml体系中培养5天后至对数期，转接至24孔板中培养，以进行生长速率的测定；
12.实验体系为2ml，每株藻设置4个平行，初始od680为0.2；所有藻株均使用bg11培养基进行培养，培养条件为温度25
±
1℃，光强40μmol/m2/s，光暗比12h：12h；
13.接种后每隔24h使用酶标仪进行od680的测定，并计算每株绿藻的最大比生长速率，比生长速率(μ)计算公式为：
14.μ＝(lnw
2-lnw1)/(t
2-t1)
15.式中，w1表示t1时的od680，w2表示t2时的od680，t1和t2分别为0和其他时间点。
16.可选地，所述步骤1中，为筛选出对微囊藻生长产生抑制效应的绿藻，对库藏绿藻和原位分离的绿藻进行培养，设置滤液处理组与对照组进行实验；
17.其中，滤液为藻液经孔径1.2μm的gf/c滤膜抽滤后所得，并进行营养盐的补加，以确保与对照组营养盐水平一致，对照组为普通bg11培养基；实验在24孔板中进行，体积为2ml，每个组设置4个平行；
18.所有实验组均分别接入处于对数期的微囊藻，初始接种密度为1
×
106cells/ml；所有组别设置4个平行，培养条件为温度25
±
1℃，光强35μmol/m2/s，光暗比12h：12h；
19.接种后每隔24h使用酶标仪对微囊藻的od680进行测定；细胞的生长抑制率通过如下公式计算：
20.ir＝(n
0-ns)/n0×
100％
21.式中，n0和ns分别为对照组和处理组的比生长速率。
22.可选地，所述步骤2中，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定，依据bg11培养基nano3的n水平，使用nh4cl进行n源替代并设置不同浓度；
23.通过补加nacl以保持不同处理培养基的渗透压相同，所有组别设置4平行，计算96hμ值；对光合放氧速率的测定通过clark氧电极进行，光合放氧速率＝实验测得放氧速率/叶绿素含量，叶绿素含量使用80％丙酮进行抽提。
24.进一步地，使用筛选的藻株与微囊藻进行共培养竞争实验，初始接种密度各为1
×
106cells/ml，绿藻与微囊藻细胞数比例为1：1；以微囊藻和绿藻的单种培养作为对照，初始接种密度均为2
×
106cells/ml；所有组别均设置4个平行，依据藻细胞大小和荧光的差异，利用流式细胞仪以藻蓝蛋白荧光标记微囊藻，叶绿素荧光标记绿藻，进行分群并计数。
25.可选地，开展针对野外水体不同生物量水华的串联技术参数的研究，在早晨采集池塘水面漂浮的藻样品，同时采集原水；对采集的原水进行抽滤，获取不含藻的原水；
26.对所采集样品进行稀释，以获取初始生物量不同的实验用藻，实验体系为1l，置于
烧杯中进行，进行应急化学杀藻剂添加，实验温度为室温，光强为30-40μmol/m2/s，光暗比12h:12h；
27.基于生物量的下降以及化学杀藻剂的残留量未检测到，此时，转入6孔板中，加入不同浓度的绿藻，持续多天，结束时，取样进行显微镜检，确定藻类群落结构组成。
28.进一步地，在初始生物量较低的情况下，加入合适浓度的季铵盐后，再补加浓度较高的绿藻的效果较好，所述串联技术更适用于生物量较低的蓝藻水华。
29.本发明中，即在蓝藻生物量处于高位时，投入合适剂量的化学杀藻剂，从而快速降低水体中蓝藻生物量，此后投入合适数量的绿藻，从而促使养殖水体中的浮游植物群落向以绿藻为优势的方向进行定向演替。
30.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术优势：
31.本发明考虑养殖池塘关键环境指标，并从藻株自身生物特性对种间竞争的影响的基础上，从野外原位筛选出性状优良的有益藻株。此外，相较于物理法和化学法，本发明采用化学法和生物法联合抑藻，并针对不同情形下的蓝藻水华，开展一系列针对不同生物量水华的串联技术参数的研究，具有高效性、选择性和生态风险性小等特点。
32.本发明所筛选的绿藻包括分离自野外原位池塘的藻株，与实验室所保藏藻株相比，对微囊藻的生长具有较强抑制性，且更适应野外环境。
33.本发明根据蓝藻水华的不同情形，开展了一系列针对野外水体不同生物量(低/中/高)的串联技术参数研究，具有较强的针对性。
附图说明
34.图1为本发明蓝藻杀藻剂应急处置串联投放快速生长绿藻竞争性抑制养殖池塘蓝藻水华集成技术路线示意图；
35.图2为藻株筛选和评价技术构建路线示意图；
36.图3为16株绿藻的最大比生长速率示意图；
37.图4为34株绿藻滤液和破碎液对微囊藻的生长效应热图，a、b分别代表微囊藻fachb-3550、微囊藻fachb-905；
38.图5为野外分离藻株对微囊藻fachb-3550的生长抑制示意图，(a)gq-1；(b)gq-2；(c)gq-3；(d)gq-4；(e)gq-5；
39.图6为3株绿藻和2株微囊藻在不同氨氮浓度下的生长速率示意图；
40.图7为6株绿藻光合放氧速率示意图；
41.图8为栅藻fachb-1229分别与(a)低毒微囊藻fachb-3550和(b)高毒微囊藻fachb-905共培养条件下细胞所占百分比变化图；
42.图9为三株小球藻分别与低毒微囊藻fachb-3550和高毒微囊藻fachb-905共培养时细胞占比变化(a、b、c为小球藻fachb-1554、fachb-1552、fachb-1580与低毒微囊藻fachb-3550共培养结果，d、e、f为小球藻fachb-1554、fachb-1552、fachb-1580与高毒微囊藻fachb-905共培养结果)；
43.图10为杀藻剂应急处置串联投放绿藻集成技术的关键参数探究正交实验流程和设置图；
44.图11为养殖基地航拍和现场示意图；
45.图12为对照组(a)和季铵盐串联绿藻处理组(b)叶绿素和藻蓝蛋白变化示意图；
46.图13为对照组(a)和季铵盐串联绿藻处理组(b)浮游植物群落结构变化示意图；
47.图14为对照组(a)和季铵盐串联绿藻处理组(b)蓝藻群落结构变化示意图；
48.图15为对照组和季铵盐串联绿藻处理组水体中微囊藻毒素变化(a)和(b)鱼肉肌肉和肝脏中毒素变化示意图。
具体实施方式
49.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
50.实施例1：
51.如图1所示，一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其步骤是：
52.1.潜在藻株的筛选：
53.本发明从国家水生生物种质资源库选取了53株生长状况良好的绿藻，并从野外养殖池塘原位分离到5株绿藻(链带藻)，从营养性竞争效应和生长抑制效应两个维度开展具潜力藻株的筛选实验，研究方案及路线如图2所示。
54.对于营养性竞争效应的筛选主要基于快速生长的绿藻进行，所使用藻株(主要包括小球藻和栅藻)如表1所示。将藻株在250ml体系中培养5天后至对数期，转接至24孔板中培养，以进行生长速率的测定。实验体系为2ml，每株藻设置4个平行，初始od
680
为0.2。所有藻株均使用bg11培养基进行培养，培养条件为温度25
±
1℃，光强40μmol/m2/s，光暗比12h：12h。接种后每隔24h使用酶标仪(molecular devices，美国)进行od
680
的测定，并计算每株绿藻的最大比生长速率，比生长速率(μ)计算公式为μ＝(lnw
2-lnw1)/(t
2-t1)，w1表示t1时的od680，w2表示t2时的od680，t1和t2分别为0和其他时间点。最大比生长速率(μ
max
)为各时段比生长速率中的最大值。筛选的结果显示，三株小球藻(fachb-1580、fachb-1554和fachb-1552)的最大比生长速率(μ
max
)较高(p《0.05，图3)，分别为0.44
±
0.07/d、0.38
±
0.05/d和0.37
±
0.08/d。另在所测试栅藻中，栅藻fachb-1229的μ
max
最高，可达0.30
±
0.03/d，均显著高于微囊藻的μ
max
(0.13
±
0.03/d)。
55.表1为用于筛选快速生长的16株绿藻信息
[0056][0057]
为筛选出对微囊藻生长产生抑制效应的绿藻，对34株库藏绿藻(表2)和5株原位分
离的绿藻进行30d的培养，设置滤液处理组与对照组进行实验。其中，滤液为藻液经孔径1.2μm的gf/c滤膜(whatman，英国)抽滤后所得，并进行营养盐的补加，以确保与对照组营养盐水平一致，对照组为普通bg11培养基。实验在24孔板(corning，美国)中进行，体积为2ml，每个组设置4个平行。所有实验组均分别接入处于对数期的微囊藻，初始接种密度为1
×
106cells/ml。所有组别设置4个平行，培养条件为温度25
±
1℃，光强35μmol/m2/s，光暗比12h：12h。接种后同样每隔24h使用酶标仪对微囊藻的od
680
进行测定。比生长速率(μ)计算同上，其中w1表示t1时的od
680
，w2表示t2时的od
680
，t1和t2分别为0h和96h。细胞的生长抑制率(inhibition rate，ir)通过如下公式计算：ir＝(n
0-ns)/n0×
100％。其中：n0和ns分别为对照组和处理组的比生长速率。结果表明(见图4)，所有已测试绿藻中，栅藻fachb-1229、fachb-1235、fachb-1974和角星鼓藻fachb-523、fachb-1084的滤液和细胞破碎液可对两株微囊藻的生长产生不同程度的抑制。其中，栅藻fachb-1229的细胞滤液和细胞破碎液对高毒微囊藻fachb-905的生长抑制率分别为48.39％和36.83％，而对低毒微囊藻fachb-3550的生长抑制率分别为53.95％和48.85％。野外分离藻株的结果同样发现，5株链带藻的滤液均可对微囊藻产生不同程度的抑制。抑制率分别为19.34％(gq-1)、17.89％(gq-2)、9.15％(gq-3)、15.46％(gq-4)和57.96％(gq-5)(见图5)。
[0058]
表2用于筛选对微囊藻生长具抑制效应的34株绿藻信息
[0059][0060]
2.筛选藻株的评价：
[0061]
在养殖水体或其他污染严重的水体中，氨氮通常含量较高。因此氨氮耐受性是野外环境中利用藻类控制有害水华蓝藻的重要特性。人工水体例如养殖池塘对溶氧的需求度较高，在控制水华的同时需要考虑水体溶氧。综上，基于实际应用的需求，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定。首先，依据bg11培养基nano3的n水平，使用nh4cl进行n源替代并设置不同浓度，分别为0、94.43、188.86、472.15、944.30和1888.60mg/l。另通过补
加nacl以保持不同处理培养基的渗透压相同。所有组别设置4平行，计算96hμ值。对光合放氧速率的测定通过clark氧电极(hansatech，英国)进行，光合放氧速率[μmol o2/(mg chl.a
·
h)]＝实验测得放氧速率/叶绿素含量。叶绿素含量使用80％丙酮进行抽提。结果发现，栅藻fachb-1229对高浓度氨氮的耐受性最强，而此时微囊藻生长完全被抑制(图6)。此外，该藻株的光合放氧速率(229.91
±
10.49μmol o2/mg chla/h)也高于其他绿藻(图7)，在无损耗状态下，投加10mg生物量(叶绿素a)的fachb-1229藻液1h后可释放73.57g的氧气。因此，本发明所筛选的栅藻fachb-1229，具备对微囊藻的化感作用及对高氨氮耐受的特性，使其可以在抑藻的同时，还能降低养殖水体中氨氮含量，同时可释放大量氧气以供鱼类使用。
[0062]
进一步地，使用该发明所筛选的藻株与微囊藻进行共培养竞争实验。共培养实验组分别为：(a)栅藻fachb-1229vs低毒微囊藻fachb-3550；(b)栅藻fachb-1229vs高毒微囊藻fachb-905；(c)小球藻fachb-1554vs低毒微囊藻fachb-3550；(d)小球藻fachb-1552vs低毒微囊藻fachb-3550；(e)小球藻fachb-1580vs低毒微囊藻fachb-3550；(f)小球藻fachb-1554vs高毒微囊藻fachb-905；(g)小球藻fachb-1552vs高毒微囊藻fachb-905；(h)小球藻fachb-1580vs高毒微囊藻fachb-905。初始接种密度各为1
×
106cells/ml，绿藻与微囊藻细胞数比例为1：1。以微囊藻和绿藻的单种培养作为对照，初始接种密度均为2
×
106cells/ml。所有组别均设置4个平行，依据藻细胞大小和荧光的差异，利用流式细胞仪(beckman，美国)以藻蓝蛋白荧光标记微囊藻，叶绿素荧光标记绿藻，进行分群并计数。结果发现，具抑制效应的栅藻fachb-1229与低毒微囊藻fachb-3550共培养第6天时，fachb-1229所占比例从初始的33.52％上升至51.03％；而当与高毒微囊藻fachb-905共培养时，栅藻所占比例无明显浮动(图8a-b)。同样的，3株生长速率最快的小球藻分别与微囊藻共培养的结果也发现，在共培养第4天时，处理组三株小球藻在与低毒微囊藻的竞争中，所占比例出现不同程度的升高(图9)，尤其在小球藻fachb-1552与低毒微囊藻fachb-3550共培养中，fachb-1552所占比例从初始的53.37％上升至99.14％。
[0063]
3.串联技术参数的探究：
[0064]
野外水体中蓝藻的生长与水华的形成可以分为休眠、复苏、生物量增加、上浮及聚集等四个阶段。而蓝藻水华的暴发过程又可分为初期、中期和消退期，初期通常为早春及初夏阶段，此过程中生物量一般为20-40μg/l。此后，随着更适宜的高温及其他环境条件，夏季生物量达到最高，为100-300μg/l。而到了秋冬季节，随着气温的降低，水华进入消亡期，生物量也逐渐降低。对鱼塘的研究也发现，一年内不同季节微囊藻的组成和生物量也存在较大差异，具体表现为5-6月生物量较低，7-10月较高，11月再次降低。因此，为了得到适用于野外养殖鱼塘最经济有效的串联集成技术，对不同情形下的蓝藻水华控制的研究至关重要。
[0065]
基于此，开展一系列针对野外水体不同生物量水华的串联技术参数的研究。此部分实验主要使用官桥基地的藻样进行。在早晨10:00采集官桥池塘水面漂浮的藻样品，同时采集原水。镜检的结果显示优势种为群体微囊藻，群体尺寸约为100μm左右。经测定，所采集的样品生物量chl a为1437.21μg/l。对采集的原水使用孔径为0.45μm的滤膜进行抽滤，获取不含藻的原水。然后，对所采集样品进行稀释，以获取初始生物量分别为40，100，300，500μg/l的实验用藻。实验体系为1l，置于烧杯中进行，进行应急季胺盐杀藻剂苄基二甲基十四烷基氯化铵(c14bac，sigma-aldrich,美国)的添加，杀藻剂浓度设置见图10，初始生物量为
40和100μg/l时，所用浓度为0.4，0.8和2.5mg/l，初始生物量为300和500μg/l，所用浓度为0.8，2.5和5mg/l。实验温度为室温，光强为30-40μmol/m2/s，光暗比12h:12h。基于生物量的下降以及c14bac的残留量，第2天时，生物量快速下降，c14bac未检测到。此时，转入6孔板中，加入不同浓度的绿藻，浓度设置为103，104，105cell/ml(图10)。实验持续20天，在实验结束时，取样进行显微镜检，确定藻类群落结构组成。
[0066]
结果如表3所示，“+”表示在实验结束时，浮游植物群落结构以绿藻为主；
“‑”
表示群落结构仍有大量蓝藻，或控藻效果不佳。在初始生物量较低的情况下，加入合适浓度的季铵盐(0.8mg/l和2.5mg/l)快速抑制有害蓝藻活性，从而为绿藻增殖并成为优势类群提供条件，然后再补加浓度较高的绿藻(103cell/ml)可获得较好的效果，故此串联技术更适用于生物量较低的蓝藻水华(chl a《100μg/l)。再次，在所添加的三株绿藻中，fachb-1229的潜力最高，在多个组合中该藻株在20天后可占据优势。此外，初始生物量较高的情况下，加入药品浓度过高会导致后添加的绿藻在短时间内无法存活，但在后期随着药品的降解，会出现不同类型的绿藻如四尾栅藻、微芒藻等，但与所添加的绿藻截然不同。
[0067]
表3不同参数组合的控藻效果
[0068][0069][0070]“+”表示在实验结束时，浮游植物群落结构以绿藻为主；
“‑”
表示群落结构仍有大量蓝藻，或控藻效果不佳。
[0071]
实施例2：
[0072]
串联技术的实际应用：
[0073]
为了验证季铵盐串联饵料藻类的控藻集成技术在养殖水体中的可用性，并评价季铵盐串联饵料藻类的控藻集成技术对养殖鱼类的安全性及鱼类营养指标的影响，从而建立季铵盐串联饵料藻类的控藻集成技术在养殖水体中的示范。发明人与江苏淮安天参农牧水产有限公司进行合作，在其养殖示范基地开展了为期34天的野外实验。
[0074]
此实验在位于江苏省淮安市涟水县西蒋村的养殖示范基地中开展。经过多轮前期现场采样及调研，选取了面积为1000m2，水深为1.5m的养殖池塘2个，分别为x2和x10(图11，航拍图中黄色五角星标注)。池塘的水体表层有微囊藻聚集，而且营养盐本底值较为相近。其中x2池塘采用季铵盐串联饵料藻类的控藻集成技术，所使用季铵盐为碳十八烷基季铵盐(c18qacs，sigma-aldrich,美国)，x10池塘不做任何处理，作为对照。所有塘口均为混养模式(500尾白鲢、500尾花链及1000尾黄金鲫)。
[0075]
结果表明，与对照组相比，加入2.5mg/l的季铵盐后的第1天，藻蓝蛋白含量从1.02
±
0.14mg/l迅速降低至0.60
±
0.02mg/l，同时chl a也出现轻微的降低，表明加入的季铵盐显著抑制了养殖池塘中浮游植物的生物量，尤其是蓝藻的生物量。随着第3天、第5天和第8天三次间歇性小球藻的添加，发明人发现chl a迅速上升，最高可达514.60
±
5.42μg/l。而此时藻蓝白蛋含量再次下降，phycocyanin/chl a低至1.57(图12)。同时，浮游植物群落结构的变化结果也显示，与对照组相比，季铵盐串联绿藻处理组中蓝藻门生物量在第3天和第5天有所下降，同时，绿藻门的生物量出现上升。虽然在第8天时有所回升，但第12天和第22天时，蓝藻门生物量所占比又有所下降(图13)。进一步地，蓝藻门中不同种类的蓝藻生物量汇总分析的结果表明，在季铵盐串联绿藻处理组中，微囊藻占据绝对优势，其次为平裂藻，在加入季铵盐后，平裂藻生物量下降。随着第4天、第5天和第8天中小球藻的持续添加，微囊藻生物量逐渐降低，并在第12天时降至最低点。此外，在第22天和第34天时，长孢藻、细鞘丝藻和平裂藻的生物量有所上升，从而促使微囊藻的生物量处于较低的状态(图14)。
[0076]
同样，发明人评估了集成控藻技术的安全性。首先，水体中毒素和残留药品的结果表明，季胺盐杀藻剂c18qacs在添加后第3天后即无法检出(表4)。水体中微囊藻毒素虽在第2天时显著升高，但又迅速降低(图15a)。鱼类肌肉和肝脏中微囊藻毒素的含量均较初始有明显下降(图15b)。
[0077]
表4水体中季胺盐c18qacs残留含量
[0078][0079]
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解得到的变换或者替换，都应该涵盖在本发明的包含范围之内。

技术特征：
1.一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、潜在藻株的筛选：从营养性竞争效应和生长抑制性效应两个层面对原位藻株及室内保藏藻株进行筛选；步骤2、筛选藻株的评价：结合养殖池塘实际需求，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定，获取具潜力的藻株，进一步评价筛选藻株与微囊藻的竞争能力；步骤3、集成蓝藻杀藻剂应急处置和投放绿藻，形成竞争性抑制养殖池塘蓝藻水华。2.根据权利要求1所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，所述步骤1中，对于营养性竞争效应的筛选基于快速生长的绿藻进行，将藻株在250ml体系中培养5天后至对数期，转接至24孔板中培养，以进行生长速率的测定；实验体系为2ml，每株藻设置4个平行，初始od680为0.2；所有藻株均使用bg11培养基进行培养，培养条件为温度25
±
1℃，光强40μmol/m2/s，光暗比12h：12h；接种后每隔24h使用酶标仪进行od680的测定，并计算每株绿藻的最大比生长速率，比生长速率(μ)计算公式为：μ＝(lnw
2-lnw1)/(t
2-t1)式中，w1表示t1时的od680，w2表示t2时的od680，t1和t2分别为0和其他时间点。3.根据权利要求1所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，所述步骤1中，为筛选出对微囊藻生长产生抑制效应的绿藻，对库藏绿藻和原位分离的绿藻进行培养，设置滤液处理组与对照组进行实验；其中，滤液为藻液经孔径1.2μm的gf/c滤膜抽滤后所得，并进行营养盐的补加，以确保与对照组营养盐水平一致，对照组为普通bg11培养基；实验在24孔板中进行，体积为2ml，每个组设置4个平行；所有实验组均分别接入处于对数期的微囊藻，初始接种密度为1
×
106cells/ml；所有组别设置4个平行，培养条件为温度25
±
1℃，光强35μmol/m2/s，光暗比12h：12h；接种后每隔24h使用酶标仪对微囊藻的od680进行测定；细胞的生长抑制率通过如下公式计算：ir＝(n
0-n
s
)/n0×
100％式中，n0和ns分别为对照组和处理组的比生长速率。4.根据权利要求1所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，所述步骤2中，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定，依据bg11培养基nano3的n水平，使用nh4cl进行n源替代并设置不同浓度；通过补加nacl以保持不同处理培养基的渗透压相同，所有组别设置4平行，计算96hμ值；对光合放氧速率的测定通过clark氧电极进行，光合放氧速率＝实验测得放氧速率/叶绿素含量，叶绿素含量使用80％丙酮进行抽提。5.根据权利要求4所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，使用筛选的藻株与微囊藻进行共培养竞争实验，初始接种密度各为1
×
106cells/ml，绿藻与微囊藻细胞数比例为1：1；以微囊藻和绿藻的单种培养作为对照，初始接种密度均为2
×
106cells/ml；所有组别均设置4个平行，依据藻细胞大小和荧光的差异，利用流式细胞仪以藻蓝蛋白荧光标记微囊藻，叶绿素荧光标记绿藻，进行分群并计数。6.根据权利要求1所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在
于，开展针对野外水体不同生物量水华的串联技术参数的研究，在早晨采集池塘水面漂浮的藻样品，同时采集原水；对采集的原水进行抽滤，获取不含藻的原水；对所采集样品进行稀释，以获取初始生物量不同的实验用藻，实验体系为1l，置于烧杯中进行，进行应急化学杀藻剂添加，实验温度为室温，光强为30-40μmol/m2/s，光暗比12h:12h；基于生物量的下降以及化学杀藻剂的残留量未检测到，此时，转入6孔板中，加入不同浓度的绿藻，持续多天，结束时，取样进行显微镜检，确定藻类群落结构组成。7.根据权利要求6所述的应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，其特征在于，所述的在初始生物量较低的情况下，加入合适浓度的季铵盐后，再补加浓度较高的绿藻的效果较好，所述串联技术更适用于生物量较低的蓝藻水华。

技术总结
本发明公开了一种应用快速生长的绿藻竞争性抑制蓝藻水华的方法，包括以下步骤：步骤1、潜在藻株的筛选：从营养性竞争效应和生长抑制性效应两个层面对原位藻株及室内保藏藻株进行筛选；步骤2、筛选藻株的评价：结合养殖池塘实际需求，对所筛选藻株的氨氮耐受性和放氧能力进行了测定，获取具潜力的藻株，进一步评价筛选藻株与微囊藻的竞争能力；步骤3、集成蓝藻杀藻剂应急处置和投放绿藻，形成竞争性抑制养殖池塘蓝藻水华。本发明采用化学法和生物法联合抑藻，并针对不同情形下的蓝藻水华，开展一系列针对不同生物量水华的串联技术参数的研究，具有高效性、选择性和生态风险性小等特点。点。点。


技术研发人员：白芳 宋婵媛 贾云璐 宋立荣
受保护的技术使用者：中国科学院水生生物研究所
技术研发日：2023.02.23
技术公布日：2023/7/12