与燕麦裸粒性状基因N1共分离的KASP分子标记及其应用

与燕麦裸粒性状基因n1共分离的kasp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种与燕麦裸粒性状基因n1共分离的kasp分子标记及其应用。


背景技术：

2.燕麦(avena l.)大约在3000年前的小亚细亚地区作为杂草生长时被驯化，如今其做为一种高营养价值的禾本科粮饲兼用作物而广泛分布于北纬20
°
～40
°
的狭长地带。我国主要种植大粒裸燕麦，超过95％的栽培燕麦品种为裸燕麦；而世界燕麦主要种植地美洲、澳洲和欧洲等国家，其栽培燕麦绝大部分为皮燕麦。近年来，随着燕麦研究的深入以及食品工业的发展，裸燕麦越来越受到重视，首先，裸燕麦相比皮燕麦加工工艺简单；另外，裸燕麦有更高的蛋白和粗脂肪含量，且氨基酸组成更加平衡，粗脂肪中含有更多对人类健康有利的不饱和脂肪酸，因此燕麦的皮裸性状与栽培燕麦直接相关。
3.燕麦产量曾一度仅次于小麦、水稻、玉米、大麦和高粱位居世界第六位。然而，我国燕麦单产量常年居禾谷类作物末位。皮裸燕麦种间遗传多样性丰富，在产量和抗性方面皮燕麦具有更高的育种优势，在加工和品质方面，裸燕麦则更有潜力，因此，利用皮裸燕麦种间杂交进行裸燕麦品种选育的潜力极大。目前，我国利用国内外优秀种质资源组配了多个皮燕麦和裸燕麦杂交组合，也已育成性状稳定的裸燕麦新品种。然而，因调控燕麦皮裸性状的机制比较复杂，皮裸燕麦杂交后代常出现皮裸混合性状，对后代纯合裸燕麦品种选育造成困扰；此外，受限于燕麦基因组学的发展，利用与燕麦裸粒基因紧密连锁的分子标记进行裸燕麦品种的改良工作至今仍未实现。
4.基于以上需求，发明一种与燕麦裸粒性高度相关的分子标记以解决现有燕麦皮裸杂交育种技术中所存在的难题，在分子遗传学技术领域中具有重大意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术的上述不足，本发明提供一种与燕麦裸粒性状基因n1共分离的kasp分子标记及其应用，该kasp分子标记连锁程度高，可在燕麦选育中对杂交后代进行有目的地选择，实现快速且精准地筛选皮裸燕麦杂交后代中的纯合裸粒植株。
6.本发明提供以下技术方案：
7.一种与燕麦裸粒性基因n1共分离的kasp分子标记，该kasp分子标记为kasp-4d-52，其为snp分子标记，多态性为c/g，该kasp-4d-52分子标记与燕麦裸粒性基因n1共分离于4d染色体上。
8.一种用于扩增上述kasp分子标记的kasp引物组，该kasp引物组包括上游引物f1，上游引物f2和下游引物r，具体如下：
9.上游引物f1：
[0010]5‘‑
gaaggtgaccaagttcatgctggtaactctgcagatttgcgc-3’[0011]
(seq id no：7)；
[0012]
上游引物f2：
[0013]5‘‑
gaaggtcggagtcaacggattggtaactctgcagatttgcgg-3’(seq id no：8)；
[0014]
下游引物r：
[0015]5‘‑
gagataaacgactgaaatgacttgaca-3’(seq id no：9)。
[0016]
其中，上述上游引物f1和上游引物f2在5’端分别添加了荧光修饰基团fam和hex。
[0017]
一种检测燕麦皮裸粒性状的试剂盒，包含上述kasp引物组。
[0018]
上述kasp分子标记或kasp引物组或试剂盒在筛选裸粒性状的燕麦品种或品系中的应用。
[0019]
采用上述kasp引物组筛选裸粒性状燕麦的方法，包括以下步骤：以待测燕麦样本基因组dna为模板，采用所述kasp引物组进行荧光定量pcr扩增，对扩增结果进行基因型分型：
[0020]
若未检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c而检测到kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料不含有的燕麦裸粒性基因n1；
[0021]
若同时检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c和kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料含有杂合的燕麦裸粒性基因n1；
[0022]
若检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c而未检测到kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料含有纯合燕麦裸粒性基因n1。
[0023]
进一步地，荧光定量pcr扩增的反应体系为：4.5～5.5μl kasp master mix、1.3～1.4μl混合引物和1ul模板dna，ddh2o补齐至10μl。
[0024]
进一步地，荧光定量pcr扩增的反应体系优选为：5μl kasp master mix、1.4μl混合引物和1ul模板dna，ddh2o补齐至10μl。
[0025]
进一步地，混合引物由1.1～1.3ng/ml上游引物f1、1.1～1.3ng/ml上游引物f2、2.9～3.1ng/ml下游引物r和4.5～4.6ng/ml ddh2o组成；优选为1.2ng/ml上游引物f1、1.2ng/ml上游引物f2、3.0ng/ml下游引物r和4.6ng/ml ddh2o。
[0026]
进一步地，荧光定量pcr扩增的反应程序为：93～95℃预变性14～16min；93～95℃变性18～22s，60～62℃退火55～65s，共10个循环，每一个循环降低0.65～0.7℃；93～95℃变性18～22s，50～60℃退火55～65s，共28个循环。
[0027]
进一步地，荧光定量pcr扩增的反应程序优选为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环，每一个循环降低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火60s，共28个循环。
[0028]
综上所述，本发明的有益效果为：
[0029]
本发明提供的kasp分子标记与燕麦裸粒性基因n1共分离于4d染色体上，多态性为c/g，其与燕麦裸性基因n1紧密连锁，可用来对燕麦裸粒这一性状进行定位，从而在燕麦品种选育中对杂交后代进行有目的地选择，实现快速筛选皮裸燕麦杂交后代中的纯合裸粒植株；使用该分子标记进行筛选，具有快速精准，且不受环境影响的优点，能作为加速裸燕麦品种改良的有效手段，有助于提高育种工作效率。
附图说明
[0030]
图1为燕麦裸粒基因n1在4d染色体上的定位图。
[0031]
图2为“三分三
×
ogle”的f2群体中分子标记kasp-4d-52检测的荧光读值结果图；其中，正方形代表皮粒型(父本型)，圆形代表裸粒型(母本型)，三角形为杂合株系，菱形为空白对照。
[0032]
图3为检测皮裸燕麦性状流程图。
[0033]
图4为“d16
×
zy001332”的f3株系中分子标记kasp-4d-52检测的荧光读值结果图；其中，正方形代表皮粒型(父本型)，圆形代表裸粒型(母本型)，三角形为杂合株系，菱形为空白对照。
具体实施例
[0034]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0035]
本发明先利用714份来自世界范围的皮裸燕麦自然种质材料进行gbs(简化基因组测序)，并通过gwas(全基因组关联分析)将调控燕麦裸粒性的基因n1进行了初步定位。后开发分子标记在含裸粒性基因n1的裸燕麦材料“三分三”和皮燕麦亲本“ogle”杂交构建的f2大群体中筛选重组单株，后各对10份皮裸燕麦核心种质不同发育时期的穗部进行rna-seq测序，随后利用所获得的转录组数据挖掘snp标记，筛选在两组中具有一致性的差异snp位点作为候选snp，继而加密标记利用染色体步移法对裸粒性基因n1进行精细定位，结合参考基因组，确定多态性标记染色体上的物理位置，利用jasongen的aqp基因分型系统对亲本及f2遗传群体中裸粒性状植株和皮粒性状植株进行分型检测，筛选连锁紧密，分型结果较好的kasp标记。具体过程如下：
[0036]
实施例1
[0037]
本实施例提供了获取燕麦裸粒性候选位点及其分子标记的方法，包括以下步骤：
[0038]
(1)以含燕麦裸粒性基因n1的品种“三分三”为母本，皮燕麦品种“ogle”为父本杂交获得杂交种f1，f1自交产生f2；
[0039]
(2)亲本及f2皮裸表型鉴定：亲本与f2群体于2020-2021年度种植于成都市温江区，行长2m，行距0.3m，每行15粒种子，常规田间管理，生长期间没有发生严重病虫害和倒伏，燕麦成熟后，f2收获主穗，人工脱粒调查表型，裸燕麦记为“a”，皮燕麦记为“b”，皮裸混合燕麦记为“h”，判定结果记为燕麦裸粒性基因n1的表型标记数据；
[0040]
(3)rna-seq测序：
[0041]
a.dna提取：利用ctab法提取步骤(2)中亲本及f2群体基因组dna；
[0042]
b.从来自世界范围内的714份燕麦自然群体材料中各选取有代表性的皮裸燕麦材料各10份，取孕穗、抽穗期、开花期、灌浆期、乳熟期和蜡熟期的燕麦小穗进行rna-seq测序，对下机数据进行分析获得皮裸燕麦间及在不同发育时期的单核苷酸变异位点信息；
[0043]
c.根据测序数据选取裸粒型燕麦4d染色体n1基因候选区间内皮裸两组燕麦之间存在共有差异的snp位点，根据kasp分子标记设计相应位点引物，并利用燕麦生物信息学数据库“oatbiodb,www.waooat.cn”进行引物特异性检测，后在标记前端加上能被“fam”和“hex”荧光识别的特定序列标签，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成；
[0044]
d.利用bio-rad实时荧光定量pcr仪进行基因分型，以步骤c获得的kasp分子标记引物对亲本及f2群体dna进行扩增，进行基因型鉴定，获得分子标记数据，具体过程如下：
[0045]
以“三分三
×
ogle”杂交组配的f2群体的1280份燕麦样本基因组dna为模板，采用步骤c中所得kasp分子标记引物对dna模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如表1所示：
[0046]
表1pcr扩增体系
[0047][0048]
上述引物混合液中上游引物f1和上游引物f2和下游引物r按照10ng/ul的浓度，分别加入60ul，60ul和150ul并添加ddh2o 230ul进行混合后制成，pcr反应程序如表2所示：
[0049]
表2pcr反应程序
[0050][0051]
获得pcr产物，pcr产物检测使用bio-rad icycler thermal cycler w/iq5optical module for rtpcr(bio-rad iq5实时荧光定量pcr仪)在37℃进行荧光收集，利用生物信息学软件bioradcfxmanager对pcr产物进行分型，将检测到与裸燕麦亲本分型结果相同的植株基因型记为“a”，为裸粒型植株株系，与皮燕麦亲本一致的基因型记为“b”，为皮燕麦植株株系，杂合株系基因型记为“h”；
[0052]
e.裸粒型基因n1紧密连锁的分子标记的筛选和获得：首先在裸粒型基因n1候选区间内按一定基因组物理距离开发多组具有多态性的特异性kasp分子标记，如表3所示；后利用多组多态性标记分别对“三分三
×
ogle”组配的f2分离群体进行基因分型，各组分子标记均和裸粒型基因n1共分离且存在不同程度的连锁，最终根据分子标记对群体材料基因型检测结果同表型的一致率高低做为与裸粒型基因n1紧密连锁的分子标记开发原则；
[0053]
经过多次分型、比对和筛选，从6组分子标记中筛选得到分子标记kasp-4d-52与燕麦裸粒性基因n1共分离且在皮裸遗传群体中的基因分型结果同表型一致率最高，分型结果如图1和图2所示。
[0054]
表3 6组kasp分子标记引物
[0055][0056][0057]
实施例2
[0058]
对不同燕麦株系进行分子标记检测，鉴定分子标记kasp-4d-52引物检测燕麦皮裸型的准确性，具体包括以下步骤，具体流程如图3所示：
[0059]
(1)利用含裸粒性基因n1的裸燕麦“d16”为母本，皮燕麦品种“zy001332”为父本构建f3群体，在后代中随机选择96个株系，每个株系选取5株混合提取dna；
[0060]
(2)对获得的96个株系进行检测，具体方法为：
[0061]
在苗期用ctab法提取96个株系的dna，以其作为模板，以实施例1中所得kasp-4d-52分子标记引物对96个株系的dna进行荧光定量pcr扩增，kasp-4d-52分子标记引物为：
[0062]
上游引物f1：(“gaaggtgaccaagttcatgct”为fam标签序列)5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctggtaactctgcagatttgcgc-3’(seq id no：7)；
[0063]
上游引物f2：(“gaaggtcggagtcaacggatt”为hex标签序列)5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattggtaactctgcagatttgcgg-3’(seq id no：8)；
[0064]
通用下游引物r：5
’‑
gagataaacgactgaaatgacttgaca-3’(seq id no：9)；
[0065]
上述pcr扩增体系为：5μl master mix、混合引物1.4μl和1ul模板dna，ddh2o加至总量为10μl，同时需添加至少3个独立的以超纯水代替dna模板的空白对照，上述混合引物是由上游引物f1、上游引物f2h和通用下游引物r按照10ng/μl的浓度，分别加入120μl，120μl和300μl并添加ddh2o 460μl进行混合后制备而成的；pcr反应程序为：94℃预变性15in；94℃变性20s，61℃退火60s(每一个循环降低0.6℃)，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，共28个循环。
[0066]
荧光定量pcr扩增读值结果如图4所示，将检测到的与裸燕麦亲本“d16”分型结果相同的植株基因型记“a”，为裸粒型植株株系；与皮燕麦亲本“zy001332”一致的基因型记为“b”，为皮粒型植株株系；分型结果与裸燕麦亲本“d16”和皮燕麦亲本“zy001332”都不一致的为杂合株系，基因型记为“h”，空白对照记为“0”，单株基因型与田间表型如表4所示。
[0067]
表4d16
×
zy001332f3代部分株系分型结果统计
[0068]
[0069]
[0070][0071]
实验例
[0072]
利用实施例1所得kasp-4d-52分子标记引物以“三分三
×
ogle”和“三分三
×
waoat2132”杂交组配的f2和f3群体的燕麦样本基因组dna为模板进行基因分型，基因分型结果如表5和表6所示。
[0073]
表5三分三
×
ogle f2代部分单株分型结果统计
[0074]
[0075][0076]
表6三分三
×
waoat2132 f2代部分单株分型结果统计
[0077]
[0078]
[0079][0080]
由表4、表5和表6基因分型结果可知，利用该kasp-4d-52分子标记引物以“d16
×
zy001332”、“三分三
×
ogle”和“三分三
×
waoat2132”杂交组配的f2和f3群体的1470份燕麦样本基因组dna为模板进行基因分型，结果显示表型与基因型一致率高达98.8％，本发明提供的kasp分子标记对皮裸燕麦进行基因分型的效果优异。
[0081]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种与燕麦裸粒性基因n1共分离的kasp分子标记，其特征在于，该kasp分子标记为kasp-4d-52，其为snp分子标记，多态性为c/g，该kasp-4d-52分子标记与燕麦裸粒性基因n1共分离于4d染色体上。2.一种用于扩增权利要求1所述的kasp分子标记的kasp引物组，其特征在于，该kasp引物组包括上游引物f1，上游引物f2和下游引物r，具体如下：上游引物f1：5
‘‑
gaaggtgaccaagttcatgctggtaactctgcagatttgcgc-3’；上游引物f2：5
‘‑
gaaggtcggagtcaacggattggtaactctgcagatttgcgg-3’；下游引物r：5
‘‑
gagataaacgactgaaatgacttgaca-3’。3.一种检测燕麦皮裸粒性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的kasp引物组。4.权利要求1所述的kasp分子标记或权利要求2所述的kasp引物组或权利要求3所述的试剂盒在筛选裸粒性状的燕麦品种或品系中的应用。5.采用权利要求2所述的kasp引物组筛选裸粒性状燕麦的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测燕麦样本基因组dna为模板，采用所述kasp引物组进行荧光定量pcr扩增，对扩增结果进行基因型分型：若未检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c而检测到kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料不含有的燕麦裸粒性基因n1；若同时检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c和kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料含有杂合的燕麦裸粒性基因n1；若检测到kasp-4d-52-f1分子标记引物对应的碱基c而未检测到kasp-4d-52-f2分子标记引物对应的碱基g，则待测燕麦材料含有纯合燕麦裸粒性基因n1。6.根据权利要求5所述的筛选裸粒性状燕麦的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：4.5～5.5μl kasp master mix、1.3～1.4μl混合引物和1ul模板dna，ddh2o补齐至10μl。7.根据权利要求5所述的筛选裸粒性状燕麦的方法，其特征在于，所述混合引物由1.1～1.3ng/ml上游引物f1、1.1～1.3ng/ml上游引物f2、2.9～3.1ng/ml下游引物r组成。8.根据权利要求5所述的筛选裸粒性状燕麦的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：93～95℃预变性14～16min；93～95℃变性18～22s，60～62℃退火55～65s，共10个循环，每一个循环降低0.65～0.7℃；93～95℃变性18～22s，50～60℃退火55～65s，共28个循环。

技术总结
本发明公开了一种与燕麦裸粒性基因N1共分离的KASP分子标记及其应用，属于分子遗传学技术领域。该KASP分子标记的多态性为C/G，该KASP分子标记与燕麦裸粒性基因N1共分离于4D染色体上；本发明公开的KASP分子标记与燕麦裸性基因N1紧密连锁，可在燕麦品种选育中对杂交后代进行有目的地选择，实现快速筛选皮裸燕麦杂交后代中的纯合裸粒植株；使用该分子标记进行筛选，具有快速精准，且不受环境影响的优点，能作为加速裸燕麦品种改良的有效手段。能作为加速裸燕麦品种改良的有效手段。能作为加速裸燕麦品种改良的有效手段。


技术研发人员：彭远英 颜红海 董小龙 任长忠 周萍萍 彭云 郭来春 张心怡 陈涛 牟秋雨
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/12