一种PAC1核酸适配体及其应用

一种pac1核酸适配体及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种pac1核酸适配体及其应用。


背景技术：

2.活化细胞磷酸酶1(pac1)，也称为双特异性磷酸酶2(dusp2)，是一种有丝分裂原诱导的苏氨酸/酪氨酸磷酸酶。pac1是dusp家族中唯一特异性表达于t细胞富集的组织的成员，能作为新型免疫检查点来负调节t细胞抗肿瘤反应。pac1的耗竭可以增强效应t细胞活性，并防止小鼠肿瘤的生长。在肿瘤微环境中，高表达的pac1效应细胞转变为耗竭状态，并与患者预后不良呈正相关。作为耗竭t细胞的表观遗传检查点，pac1是癌症免疫疗法中药物开发的潜在候选对象。由于没有pac1的小分子抑制剂或靶向药物，针对pac1的小分子探针的开发对于增强t细胞功能以促进抗肿瘤免疫以及抗病毒治疗具有重要意义。
3.适配体(aptamer)，也被称为化学抗体，是一段单链寡核苷酸，它可折叠成独特的三维构象以结合相应的靶标。适配体具有非免疫原性，分子量小，结构柔韧性强，化学稳定性高，易于合成和修饰等优势。目前，适配体已被广泛用于传感，纯化，诊断，药物递送和靶向治疗。这些寡核苷酸可以用作配体的阻滞剂或激动剂，或用作递送显像剂和精密医学药物的载体。然而，针对pac1的核酸适配体序列还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的弥补现有技术的不足，提供一种亲和力高，高特异性地识别pac1的pac1核酸适配体。
5.本发明提供了一种pac1核酸适配体，所述pac1核酸适配体选自以下任意一种或多种：
6.(a)核酸适配体pa5，所述核酸适配体pa5的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7.(b)核酸适配体pa2，所述核酸适配体pa2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
8.(c)核酸适配体pa4，所述核酸适配体pa4的核苷酸序列如seq id no.3所示；
9.(d)核酸适配体pa12，所述核酸适配体pa12的核苷酸序列如seq id no.4所示；
10.(e)与(a)～(d)任一项核酸适配体的同源性在60％以上的寡核苷酸序列；
11.(f)(a)中所述核酸适配体pa5的截短序列；
12.(g)在(a)～(d)任一项核酸适配体的基础上进行修饰得到的序列。
13.优选的，所述修饰的方式包括荧光修饰或生物素修饰。
14.本发明还提供了上述技术方案所述的pac1核酸适配体在制备检测pac1蛋白的产品中的应用。
15.本发明还提供了上述技术方案所述的pac1核酸适配体在诊断和/或治疗肿瘤的产品中的应用。
16.本发明还提供了上述技术方案所述的pac1核酸适配体在制备抗病毒治疗的产品中的应用。
17.有益效果：
18.本发明利用蛋白selex技术，筛选得到4个分子量小，稳定易修饰，能够高特异性地识别pac1的核酸适配体，具体核苷酸序列如seq id no.1～4所示。经实施例验证4个核酸适配体与pac1具有较高的亲和力，不与其它蛋白发生特异性结合，无免疫原性，便于合成和保存，并且与所述核酸适配体同源性在60％以上的寡核苷酸序列，或者经截短或修饰处理后的核酸适配体仍能高效结合pac1。本发明提供的pac1核酸适配体可作为pac1的小分子靶向探针，为肿瘤靶向诊断与治疗以及抗病毒治疗提供了新思路与新工具，弥补了现有技术的空白，具有重要的临床价值。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
20.图1为流式细胞术监测富集文库与pac1蛋白或空白镍珠结合的富集进程；其中a为随着筛选轮数的增加pac1-beads表面的荧光强度的变化；b为随着筛选轮数的增加ni-beads表面的荧光强度的变化；
21.图2为筛选8轮后文库中的序列同源性比较图；
22.图3为候选适配体pa1～12与pac1-beads结合的流式结果；
23.图4为候选适配体pa2、pa4、pa5和pa12与pac1-beads结合的荧光成像结果；
24.图5为pa2、pa4、pa5和pa12的平衡解离常数(kd值)测定结果图；
25.图6为pa5截短序列与靶蛋白结合情况流式结果；
26.图7为pa5截短序列与pac1阳性细胞结合的共聚焦荧光成像结果；
27.图8为pa5从复杂体系中检测pac1的结果。
具体实施方式
28.本发明提供了一种pac1核酸适配体，所述pac1核酸适配体选自以下任意一种或多种：
29.(a)核酸适配体pa5，所述核酸适配体pa5的核苷酸序列如seq id no.1所示；
30.(b)核酸适配体pa2，所述核酸适配体pa2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
31.(c)核酸适配体pa4，所述核酸适配体pa4的核苷酸序列如seq id no.3所示；
32.(d)核酸适配体pa12，所述核酸适配体pa12的核苷酸序列如seq id no.4所示；
33.(e)与(a)～(d)任一项核酸适配体的同源性在60％以上的寡核苷酸序列；
34.(f)(a)中所述核酸适配体pa5的截短序列；
35.(g)在(a)～(d)任一项核酸适配体的基础上进行修饰得到的序列。
36.在本发明中，所述pac1核酸适配体优选选自核酸适配体pa2、核酸适配体pa4、核酸适配体pa5和核酸适配体pa12中的任意一种，或者与所述核酸适配体pa2、pa4、pa5或pa12任一项的同源性在60％以上的寡核苷酸序列，或者所述核酸适配体pa5的截短序列，或者在所述核酸适配体pa2、pa4、pa5或pa12任一项的基础上进行修饰得到的序列。
37.本发明所述核酸适配体pa5、pa2、pa4和pa12的核苷酸序列具体如下：
38.核酸适配体pa5(seq id no.1)：5
’‑
atccagagtgacgcagcaccta cattcaccgtctcac
ttctcccctctcgttcccctctggacacggtggctta gt-3’；
39.核酸适配体pa2(seq id no.2)：5
’‑
atccagagtgacgcagcacccc acccgcacgtcatttccacccttctctacttctctctggacacggtggctta gt-3’；
40.核酸适配体pa4(seq id no.3)：5
’‑
atccagagtgacgcagcacctt acatcccgcatacagcccgctcacaccctcccttagtggacacggtggctt agt-3’；
41.核酸适配体pa12(seq id no.4)：5
’‑
atccagagtgacgcagcagtg ctcgtgcccccgtacccttgctctagacctctccctctggacacggtggct tagt-3’。
42.在本发明中，与所述核酸适配体pa2、pa4、pa5和pa12中的任意一种的同源性在60％以上的寡核苷酸序列优选如seq id no.13～seq id no.19所示，具体序列信息见表2。
43.在本发明中，所述核酸适配体pa5的截短序列优选包括pa5a、pa5b、pa5c或pa5d中的任意一种；所述pa5a、pa5b、pa5c和pa5d的核苷酸序列具体如下：
44.pa5a(seq id no.5)：5
’‑
atccagagtgacgcagcacctacattcacc gtctcacttctcccctctcgttcccctc-3’45.pa5b(seq id no.6)：5
’‑
cctacattcaccgtctcacttctcccctctc gttcccctctggacacggtggcttagt-3’46.pa5c(seq id no.7)：5
’‑
cctacattcaccgtctcacttctcccctctc gttcccctc-3’47.pa5d(seq id no.8)：5
’‑
ttcaccgtctcacttctcccctctcgtt-3’。
48.在本发明中，所述修饰的方式包括荧光修饰或生物素修饰，所述荧光修饰优选包括fam修饰。
49.本发明利用蛋白selex技术，经过8轮筛选，得到4条分子量小，稳定易修饰核苷酸序列，任意一条核苷酸序列，或者与任一条核苷酸序列的同源性在60％以上的寡核苷酸序列；或者任一条核苷酸序列的截短序列；或者任一条核酸适配体的基础上进行修饰得到的序列均能够高特异性地识别pac1，并且亲和力高，不与其它蛋白发生特异性结合，无免疫原性，便于合成和保存，可以作为pac1的小分子靶向探针。
50.将于本发明提供的pac1核酸适配体、分子探针和试剂盒的作用，上述pac1核酸适配体或分子探针或试剂盒在制备检测pac1蛋白的产品、诊断和/或治疗肿瘤的产品和制备抗病毒治疗的产品中的任意一种应用均属于本发明的保护范围。本发明提供的pac1核酸适配体为肿瘤靶向诊断与治疗以及抗病毒治疗提供新思路与新工具，具有重要的临床价值。
51.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种pac1核酸适配体及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.实施例1
53.pac1蛋白的核酸适配体筛选及克隆
54.1.文库预处理
55.初始筛选文库为总长76nt的单链寡核苷酸序列库，两端各为18nt的恒定引物序列，便于序列的扩增，其中间为40nt的随机核酸文库序列(5'-atccagagtgacgcagca-n40-tggacacggtggcttagt-3'，seq id no.9)。将随机核酸文库粉末溶解，并加热至95～100℃变性5～10min，之后立即置于冰上冷却5～10min，使其形成较为稳定的二级结构(记为预处理后的随机核酸文库)，每轮筛选前都需要对文库进行预处理，再投入筛选流程中。
56.2.筛选靶标的制备
57.将镍珠悬液(ge healthcare)加入到500μl蛋白缓冲液(包含30mmol/l咪唑的pbs)中平衡三次，得到蛋白缓冲液-镍珠悬液的混合液。按照镍珠与pac1蛋白(uniprot数据库)的质量比为1:12，将pac1蛋白加入到100μl蛋白缓冲液-镍珠悬液的混合液中，充分混匀后，在4℃振捣器上孵育1h。孵育结束后，再用蛋白缓冲液洗涤3次，即得到了目的蛋白固定于镍珠的靶标，记为pac1-beads。筛选时，以pac1-beads作为正筛选靶标，以裸镍珠(ni-beads)作为反筛选靶标。
58.3.反筛和正筛
59.采用蛋白selex技术筛选pac1核酸适配体，将预处理后的随机核酸文库按照筛选步骤进行8轮筛选，其中前3轮只进行正筛，后5轮进行反筛+正筛(顺次完成一次反筛和一次正筛为一轮筛选)。整个核酸适配体筛选具体步骤如下：
60.3.1前3轮正筛选：
61.3.1.1向步骤1得到的预处理后的随机核酸文库中加入pac1-beads，4℃震荡孵育后，用洗涤缓冲液洗涤3次，弃去上清；收集pac1-beads至ep管中，95～100℃变性5～10min，高速离心，保留上清液。
62.以所述上清液为模板进行第一次pcr扩增，其中，
63.第一次pcr扩增的体系为(总体积1500μl)：10
×
pcrbuffer 150μl，dntp mixture 120μl，上下游引物各37.5μl，模板1000μl，rtaq 5μl，ddh2o 150μl。按如下条件在pcr仪上进行扩增：95～100℃预变性5～10min；95～100℃变性30～40s，45～55℃退火30～40s，72℃延伸30～40s，共计10个循环；72℃延伸5～15min，最后永久保温在4℃环境当中。上游引物：5'-atccagagtgacgcagca-3'(seq id no.10)；下游引物：5'-tggacacggtggcttagt-3'(seq id no.11)。
64.以第一次pcr扩增的产物为模板，进行第二pcr扩增，其中，
65.第二次pcr扩增的体系为(总体积2000μl)：10
×
pcrbuffer 200μl，dntp mixture 160μl，上下游引物各50μl，模板200μl，rtaq 10μl，ddh2o1520μl(此时所用的上游引物需带荧光标记，下游引物需带生物素标记)。按如下条件在pcr仪上进行扩增：95～100℃预变性5～10min；95～100℃变性30～40s，45～55℃退火30～40s，72℃延伸30～40s，共计10个循环(该循环数是经过优化后确定的)；72℃延伸5～15min，最后永久保温在4℃环境当中。上游引物：5'-atccagagtgacgcagca-3'(seq id no.10)；下游引物：5'-tggacacggtggcttagt-3'(seq id no.11)。
66.上述pcr实验相关的10
×
pcr buffer、dntp购买于toyobo公司；taq dna聚合酶购自takara公司。pcr引物购于北京擎科新业生物技术有限公司及北京睿博兴科生物技术有限公司。
67.用链霉亲和素微球从第二次pcr产物中分离得到荧光标记的单链dna序列，链霉亲和素球可以除去biotin标记的互补链，从而得到fitc标记的目标链，即次级随机核苷酸文库。
68.3.1.2重复筛选：步骤3.1.1得到的次级核苷酸文库重复上述3.1.1的操作2次，即完成了3轮正筛，得到了第三轮次级核苷酸文库。
69.3.2后5轮反筛+正筛选：
70.3.2.1自第四轮筛选开始，在每轮正筛之前进行反筛操作：用洗涤缓冲液平衡镍珠
后，加入已预处理的第三轮次级核苷酸文库，在4℃条件下共孵育后，收集上清液，并标记为该轮次反筛选产物。
71.3.2.2按照步骤3.1.1对该轮次反筛选产物进行正筛选操作，得到该轮次级随机核苷酸文库。
72.3.2.3重复筛选：步骤3.2.2得到的次级随机核苷酸文库重复上述3.2.1和3.2.2的操作各4次，即进行4轮反筛+正筛的筛选。在这4轮反筛中，下一轮反筛中加入的核苷酸文库为上一轮正筛中制备的次级核苷酸文库；在这4轮正筛中，下一轮正筛中加入的核苷酸文库为上一轮反筛中制备的次级核苷酸文库，重复筛选后，最终得到第8轮富集的随机核苷酸文库。
73.本实施例中，为了提高核酸适配体的亲和力和特异性，在筛选过程中筛选压力逐步增加，期间用流式细胞术对富集情况进行监测，结果如图1，筛选过程的具体调控条件见表1。
74.表1pac1适配体筛选压力调控条件
[0075][0076]
根据图1可以看出，pac1-beads表面的荧光强度随着筛选轮数的增加而逐渐增强(图1中a)；ni-beads表面的荧光强度随着筛选轮数的增加变化并不明显(图1中b)。
[0077]
4.文库克隆测序及候选适配体的获得
[0078]
经8轮筛选后，以筛选产物为模板，利用上游引物：5'-atccagagtgacgcagca-3'(seq id no.10)；下游引物：5'-tggacacggtggcttagt-3'(seq id no.11)进行pcr扩增，并将pcr产物进行克隆ta克隆，随机挑取50个克隆进行测序，得到48条有效测序结果。对得到的48条有效测序结果进行分析，通过对其一级结构与二级结构的同源性比较，将48条序列归为六个序列家族，结果如图2所示。再从六个家族中各选取2条同源性达到60％以上的候选序列进行进一步验证，分别命名为pa1～12(表2)。
[0079]
表2pac1适配体筛选压力调控条件
[0080][0081]
实施例2
[0082]
1.核酸适配体与靶标的结合能力
[0083]
(1)将实施例1得到的12条核酸适配体，使用fam荧光标记后，分别与2
×
105粒ni-beads和pac1-beads，在冰上避光孵育30min(终浓度250nmol/l)。用500μl洗涤缓冲液(由tris-hcl 10mmol/l，nacl 150mmol/l，kcl 5mmol/l，mgcl21mmol/l，cacl21mmol/l和余量的水组成)充分洗涤3次后，使用500μl结合缓冲液(将50μl的tween-20溶于100ml洗涤缓冲液中，充分溶解后获得)对镍珠进行重悬。以未经任何处理的镍珠为阴性对照。使用流式细胞术对实施例1得到的12条核酸适配体进行结合能力的考察，结果如图3。
[0084]
根据图3可以看出，与阴性对照相比，12条候选适配体均能与pac1蛋白结合。其中，适配体pa3、pa11的结合能力较弱，pa1、pa2、pa4、pa5、pa6、pa7、pa8、pa9、pa10、pa12的结合能力较强。对比各候选适配体和裸镍珠的结合情况，可见候选适配体pa1、pa6、pa7、pa8、pa9、pa10、pa11与裸镍珠也有一定的非特异性结合，其中pa6与ni-beads孵育后检测的荧光曲线和其与p-beads孵育后检测的荧光曲线几乎重合，表明该候选适配体的特异性较差。综
上分析，我们选择了pa2、pa4、pa5、pa12作为代表性的候选适配体进行下一步的筛选优化。
[0085]
(2)使用荧光显微镜验证核酸适配体pa2、pa4、pa5、pa12与pac1的结合，实验样品处理操作同上述步骤(1)，初始筛选文库library(5'-atccagagtgacgcagca-n40-tggacacggtggcttagt-3'，seq id no.9)为对照，荧光成像结果见图4。
[0086]
根据图4可以看出，4条核酸适配体与ni-beads孵育后并未能观察到荧光信号，与pac1-beads孵育后可观察到镍珠表面附着荧光，使用标记了fam的初始文库分别与ni-beads和pac1-beads孵育后也均未观察到荧光信号，即各候选适配体都显示出较强的结合能力。
[0087]
(3)参照实施例2中步骤(1)的操作，检测核酸适配体pa2、pa4、pa5、pa12对pac1的亲和力。采用流式细胞仪检测平行配制的5个浓度梯度(10nm，20nm，500nm，100nm，200nm,)的四条候选适配体样品，记录各浓度条件下的fam标记的适配体与靶蛋白结合的荧光强度中位数。并将记录的数据扣除未与任何适配体孵育的p-beads样品的本身荧光背景后，导入sigmaplot软件进行分析，再根据单点吸附模型公式y＝b
max
x/(kd+x)拟合曲线，计算出各候选适配体的平衡解离常数，即kd值。结果如图5所示。
[0088]
根据图5可以看出，4条核酸适配体均能与pac1结合，pa2、pa4、pa5和pa12的kd值依次为86.10
±
24.74nm、118.27
±
14.44nm、61.33
±
17.08nm和92.92
±
40.59nm，pa5具有最小的kd值，结合步骤(1)检测结果，pa5与pac1蛋白的亲和力最强，相比其他3个核酸适配体，pa5的特异性结合的能力更强，因此，在接下来的实验中，选择适配体pa5进行深入研究。
[0089]
2.适配体的截短优化
[0090]
(1)在各类功能研究当中，dna的长度越长，稳定性相应变差。另外，适配体中有部分碱基序列并不具有结合靶蛋白的作用，这些多余的碱基序列可能会产生空间位阻，反而不利于适配体结合靶蛋白。因此，本研究对pa5序列进行进一步优化，主要采用引物端序列截短的方式，即将原序列的两端引物结合区进行全部或部分去除。优化截短后的各适配体序列见表3。
[0091]
表3pa5优化截短序列信息
[0092][0093]
(2)pa5优化序列的结合能力考察
[0094]
a.以pa5为阳性对照，以裸镍珠为空白对照(blank)，使用流式细胞术对阳性对照、空白对照和pa5优化后的序列进行结合能力的考察，结果见图6。
[0095]
根据图6可以看出，与原序列pa5相比，pa5a、pa5b及pa5d与pac1靶蛋白的结合能力有所减弱。而pa5c与pac1靶蛋白的结合能力与原序列pa5基本相同。说明本发明提供的pa5优化截短序列均能与pac1靶蛋白结合，pa5c优化序列的结合效果最好，一定程度上去除了多余的并不发挥特异性结合作用的序列，保留了与靶标结合的关键区域。
[0096]
b.将5’端带有fam荧光标记的优化适配体pa5c与普通jurkat细胞及稳定表达mcherry-pac1(构建方法参考nat immunol.2020mar；21(3):287-297.)的jurkat细胞孵育后，用荧光共聚焦成像仪观察荧光情况，结果如图7所示。
[0097]
根据图7可以看出，荧光标记的核酸适配体pa5c与mcherry-pac1融合蛋白有明显的共定位，能特异性识别稳定表达mcherry-pac1的jurkat细胞，说明本发明提供的核酸适配体pa5c能特异性地与细胞中的pac1结合。
[0098]
实施例3
[0099]
从复杂体系中检测pac1
[0100]
1.实验分组处理：
[0101]
实验组：将稳定表达pac1-flag的jurkat细胞(j-pac1-flag)的细胞裂解液与5’端生物素标记的pa5c在4℃下孵育4小时，得到混合液；混合液与链霉亲和素珠(sa-beads)在4℃下孵育3小时；
[0102]
对照组1：将稳定表达pac1-flag的jurkat细胞(j-pac1-flag)的细胞裂解液与5’端生物素标记初始的筛选文库(5'-atccagagtgacgcagca-n40-tggacacggtggcttagt-3'，seq id no.9)在4℃下孵育4小时，得到混合液；混合液分别与链霉亲和素珠(sa-beads)在4℃下孵育3小时；
[0103]
对照组2：将稳定表达对照载体的jurkat细胞(j-mock-flag)的细胞裂解液与5’端生物素标记的pa5c在4℃下孵育4小时，得到混合液；混合液分别与链霉亲和素珠(sa-beads)在4℃下孵育3小时；
[0104]
空白组：将稳定表达pac1-flag的jurkat细胞(j-pac1-flag)的细胞裂解液在4℃下放置4小时后与链霉亲和素珠(sa-beads)在4℃下孵育3小时；
[0105]
2.步骤1各处理组孵育结束后洗涤3次，收集珠子并对孵育后的样品进行加热变性处理，最后进行免疫印迹分析，用抗flag标签抗体对蛋白进行检测，结果如图8所示，其中图8中input检测结果表示在反应体系中存在pac1蛋白。
[0106]
根据图8可以看出，j-pac1-flag细胞裂解液中加入适配体pa5c及sa-beads的样品检测到了pac1的目的条带，而纯链霉亲和素珠(sa-beads)或加入筛选文库序列和链霉亲和素珠(sa-beads)的样品都未能检测到目的条带。同时，j-mock-flag细胞裂解液中加入适配体pa5c及sa-beads的样品也没有显示目的条带。这说明适配体pa5c能在复杂的体系中与pac1蛋白特异性结合，可用于pac1蛋白的检测。
[0107]
根据上述内容可以看出，本发明提供的pac1核酸适配体与pac1具有较高的亲和力，无免疫原性，便于合成和保存，可作为pac1的小分子靶向探针，检测pac1蛋白。
[0108]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种pac1核酸适配体，所述pac1核酸适配体选自以下任意一种或多种：(a)核酸适配体pa5，所述核酸适配体pa5的核苷酸序列如seq id no.1所示；(b)核酸适配体pa2，所述核酸适配体pa2的核苷酸序列如seq id no.2所示；(c)核酸适配体pa4，所述核酸适配体pa4的核苷酸序列如seq id no.3所示；(d)核酸适配体pa12，所述核酸适配体pa12的核苷酸序列如seq id no.4所示；(e)与(a)～(d)任一项核酸适配体的同源性在60％以上的寡核苷酸序列；(f)(a)中所述核酸适配体pa5的截短序列；(g)在(a)～(d)任一项核酸适配体的基础上进行修饰得到的序列。2.根据权利要求1所述的pac1核酸适配体，其特征在于，所述修饰的方式包括荧光修饰或生物素修饰。3.权利要求1或2所述的pac1核酸适配体在制备检测pac1蛋白的产品中的应用。4.权利要求1或2所述的pac1核酸适配体在制备诊断和/或治疗肿瘤的产品中的应用。5.权利要求1或2所述的pac1核酸适配体在制备抗病毒治疗的产品中的应用。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PAC1核酸适配体及其应用。本发明利用蛋白SELEX技术，筛选得到4个分子量小，稳定易修饰，能够高特异性地识别PAC1的核酸适配体，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4。经实施例验证4个核酸适配体与PAC1具有较高的亲和力，不与其它蛋白发生特异性结合，无免疫原性，便于合成和保存，并且与所述核酸适配体同源性在60％以上的寡核苷酸序列，或者经截短或修饰处理后的核酸适配体仍能高效结合PAC1。本发明提供的PAC1核酸适配体可作为PAC1的小分子靶向探针，为肿瘤靶向诊断与治疗以及抗病毒治疗提供了新思路与新工具，弥补了现有技术的空白，具有重要的临床价值。的临床价值。的临床价值。


技术研发人员：尹玉新 胡子茜 姜中雨
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/12