多肽稳定剂和药物组合物的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽稳定剂和药物组合物。


背景技术：

2.近百年来，药物研发专家不断提出开发口服多肽制剂以替代常用的注射剂型，既解决患者用药不便及心理不适等用药依从性问题，也能满足多肽药物日益旺盛的临床用药需求，扩大多肽药物的市场空间。然而，时至今日，全球仅口服索马鲁肽一款口服多肽药物上市，并且还存在生物利用度低、受食物影响大、个体差异大等缺陷。因此，多肽药物的口服制剂开发依然是药物研发界尚待征服的高峰，有着巨大的技术壁垒和挑战。
3.多肽药物在口服递送途径中要经历多种组织器官和分子环境，大多数环境因素都会阻碍多肽药物到达作用靶标。其中一大阻碍在于多肽的三维结构容易被破坏，特别是容易被胃液和肠液中的蛋白酶降解，导致失活。因此，为了防止多肽药物被胃肠道酶破坏和降解，最常用的方法就是使用酶抑制剂，初代的酶抑制剂有抑肽酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂、甲磺酸卡莫司特和色素抑制剂等。新一代的抑制剂(如：禽卵类粘蛋白)目前也被用于剂型开发中，其中，鸭卵类粘蛋白完美地抑制了胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶，对胰岛素起到了100％的保护作用。另外，据报道，羧甲基纤维素-弹性蛋白(cmc-ela)聚合物抑制剂也显示出对酶胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的体外抑制作用，在给药4小时后发现仍有33％的多肽存在活性。然而，这些酶抑制剂都存在一个共同的缺陷：长期使用会导致肠道酶失活，引起更为严重的炎症反应。
4.长期使用酶抑制剂造成的肠道环境破坏无法有效解决，而多肽药物多用于治疗慢性疾病，需要长期使用药物，两者存在明显矛盾。基于此，研发一类具有不破坏酶活性且能保护多肽药物在肠道稳定性的多肽稳定剂迫在眉睫。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种多肽稳定剂和药物组合物，以用于提高多肽在肠道的稳定性。
6.本发明的具体技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供了一种多肽稳定剂，包括：辛酰基肉碱，用于提高多肽在肠道的稳定性。
8.在一些实施例中，所述多肽包括环肽和/或链肽；和/或
9.所述多肽的分子量小于或等于4k da。
10.在一些实施例中，所述多肽包括布舍瑞林、舍瑞林、司美格鲁肽、催产素和兰瑞肽中的至少一种。
11.经实验检测，辛酰基肉碱均可有效提高环肽(催产素、兰瑞肽)和链肽(布舍瑞林、戈舍瑞林、司美格鲁肽)在肠道(如小肠和结肠)的稳定性，同时，辛酰基肉碱对人、猴及大鼠肠道中的酶活性无影响，避免长期用药导致的肠道酶失活，从而避免引起严重的炎症反应。
采用辛酰基肉碱作为多肽稳定剂，解决了当前多肽药物在口服给药途径和肠道给药途径所面临的稳定性低的问题，且可避免长期用药导致的肠道酶失活，降低不良反应。由此，将本发明所提供的多肽稳定剂应用于制备用于口服或肠道给药的制剂，可有效提高制剂在肠道的稳定性。
12.第二方面，本发明还提供了一种药物组合物，包括：辛酰基肉碱和多肽。
13.在一些实施例中，所述多肽包括环肽和/或链肽；和/或
14.所述多肽的分子量小于或等于4k da。
15.在一些实施例中，所述多肽包括布舍瑞林、舍瑞林、司美格鲁肽、催产素和兰瑞肽中的至少一种。
16.在一些实施例中，所述辛酰基肉碱的浓度为1～100mm；和/或
17.所述多肽和所述辛酰基肉碱的浓度比为5:(2～150)。
18.在一些实施例中，所述药物组合物为用于治疗慢性疾病的药物制剂。该些慢性疾病包括但不限于糖尿病、骨质酥松、肥胖、炎症性肠病、肢端肥胖症等。
19.在一些实施例中，所述药物组合物为用于口服或肠道给药的固体制剂。固体制剂包括但不限于片剂、胶囊、微丸、栓剂、膏剂等。
20.在一些实施例中，所述药物组合物还包括：药学上可接受的辅料或载体。该辅料或载体可以为口服固体制剂的常用药用辅料，如：淀粉、乳糖、糊精、微晶纤维素、无机盐类、甘露醇、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚维酮、明胶、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、十二烷基硫酸钠等。
21.本发明提供的药物组合物基于上述多肽稳定剂，一方面，辛酰基肉碱能提高多肽在肠道的稳定性，解决了当前多肽药物在口服给药途径和肠道给药途径所面临的稳定性低的问题，适用于制备成用于口服或肠道给药的固体制剂。另一方面，辛酰基肉碱不破坏人、猴及大鼠肠道中的酶活性，可作为用于治疗慢性疾病的药物制剂，避免长期用药导致肠道酶失活，从而避免引起严重的炎症反应。由此，本发明所提供的药物组合物在肠道中具有良好的稳定性，具有良好的商业前景。
具体实施方式
22.图1为5种多肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)、大鼠结肠液(c)、人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中的稳定性；
23.图2为不同浓度辛酰基肉碱对布舍瑞林在人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对布舍瑞林在人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响；
24.图3为不同浓度辛酰基肉碱对戈舍瑞林在人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对戈舍瑞林在人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响；
25.图4为不同浓度辛酰基肉碱对司美格鲁肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对司美格鲁肽在人小肠液(a)、猴小肠液(b)和大鼠小肠液(c)中稳定性的影响；
26.图5为不同浓度辛酰基肉碱对催产素(a)以及兰瑞肽(b)在人结肠液中稳定性的影
响，以及不同浓度辛酰基肉碱对催产素(c)以及兰瑞肽(d)在人小肠液中稳定性的影响；
27.图6为不同浓度辛酰基肉碱对人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中蛋白酶活性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中蛋白酶活性的影响；
28.图7为不同浓度辛酰基肉碱对醋酸艾塞那肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)、大鼠结肠液(c)、人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响。
29.具体实施方式
30.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的实例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是实例性的，而非为限制性的。
31.辛酰基肉碱(octanoy-l-carnitine)的分子式为：c
15h29
no4，分子量为：287.395，化学结构如下：
[0032][0033]
以下实施例中，辛酰基肉碱、布舍瑞林(buserelin)、戈舍瑞林(goserelin)、司美格鲁肽(semaglutide)、催产素(oxytocin)、兰瑞肽(lanreotide)均可以从市场上购买获得。
[0034]
其中，表1为各多肽的氨基酸序列结构：
[0035]
表1
[0036][0037]
实施例1
[0038]
s1、溶液配制
[0039]
(1)小肠液的配制与收集
[0040]
人、猴以及大鼠的小肠内容物直接分别取自各物种体内，将其小肠内容物挤出、收集，并于10,000rpm(9600g)、4℃离心10min，收集上清，标记为小肠液。
[0041]
(2)基底液的配制
[0042]
称量2g蛋白胨水溶液(peptone water)和2g酵母提取物(yeast extract)，加入含有600ml蒸馏水的玻璃烧瓶中。依次将盐(0.1g nacl、0.04g k2hpo4、0.01g mgso4.7h2o和0.01g cacl2.6h2o)加入玻璃烧瓶中，搅拌至溶解。然后，缓慢添加2ml tween 80(吐温80)，持续搅拌至完全溶解。搅拌期间，容量瓶用塞子保持关闭，以避免氧气溶入。添加0.5g l-半胱氨酸(l-cysteine)和0.5g胆盐(bile salts)，搅拌至完全溶解。添加10μl vitamin k、0.005g haemin(氯化血红素)和4ml 0.025％resazurin(刃天青)溶液。容量瓶保持关闭。添加2g nahco3，并在搅拌下完全溶解。添加蒸馏水，使最终体积达到1l。持续搅拌20-30分钟，可见溶液逐渐呈现红色至鲜红色。使用前，将瓶子密封置于室温下。培养基应新鲜制备(在同一天制备结肠浆液)。
[0043]
(3)结肠液的配制
[0044]
称取4g粪便(分别取自人、猴以及大鼠)于50ml离心管中，加入基底液至20g。用抹刀混匀。通过筛孔织物过滤，去除纤维材料，得到均匀的10％结肠液。将结肠液分装至7ml玻璃瓶中。所有样品冻存于负80℃，直至使用。
[0045]
(4)样品溶液的配制
[0046]
按照表2配方配制各药物溶液，具体配制方法为：将多肽和辛酰基肉碱加入至1ml pbs溶液中，移液枪吹打混匀。
[0047]
表2
[0048]
[0049][0050]
注：\表示未添加。
[0051]
s2、稳定性考察
[0052]
(1)小肠稳定性考察
[0053]
取表2中配制的样品溶液1～20各30μl，分别加入至270μl人、猴或大鼠的小肠液中，移液枪吹打混匀。在37℃恒温摇床内，以100rpm速度孵育2小时。在0、5、10、20、30、60、120分钟，从上述混合液中取30μl样本，加入至30μl甲醇中，移液枪吹打混匀。将所得混合样品于10,000rpm(9600g)、4℃离心10min。随后，收集上清液用于进行高效液相色谱hplc分析。
[0054]
(2)结肠稳定性考察
[0055]
取表2中配制的样品溶液1～20各30μl，分别加入至270μl人、猴或大鼠的结肠液中，移液枪吹打混匀。在厌氧工作站(37℃，70％湿度，无氧状态)内，以100rpm速度孵育4小
时。在0、15、30、60、120、180、240分钟，从上述混合液中取30μl样本，加入至30μl甲醇中，移液枪吹打混匀。将所得混合样品于10,000rpm(9600g)、4℃离心10min。随后，收集上清液用于进行高效液相色谱hplc分析。
[0056]
s3、辛酰基肉碱对肠道酶活性影响的考察
[0057]
(1)辛酰基肉碱对小肠酶活性影响的考察
[0058]
取表2中配制的样品溶液21～23各30μl，分别加入至270μl人、猴或大鼠的小肠液中，移液枪吹打混匀。在37℃恒温摇床内，以100rpm速度孵育2小时。2小时后，将混合液按1:20，1:50、1:100的比例用pbs进行稀释。在离心管中加入10μl稀释后的混合液、20μl fitc酪蛋白底物(fitc-casein substrate)和20μl培养缓冲液，混合均匀。将上述混合物在37℃恒温摇床下孵育2小时。取出混合物，向混合物中添加150μl三氯乙酸(trichloroacetic acid)。将混合物于10,000rpm(9600g)、4℃离心10min。收集上清液用于荧光分光光度计分析，在485/520nm激发/发射波长(excitation/emission)的条件下进行测量。
[0059]
(2)辛酰基肉碱对结肠酶活性影响的考察
[0060]
取表2中配制的样品溶液21～23各30μl，加入至270μl人、猴或大鼠的结肠液中，移液枪吹打混匀。在厌氧工作站(37℃，70％湿度，无氧状态)内，以100rpm速度孵育4小时。4小时后，将以上辛酰基肉碱-结肠混合液按1:20，1:50或1:100的比例用pbs稀释。在离心管中加入10μl稀释后的混合液、20μl fitc酪蛋白底物(fitc-casein substrate)和20μl培养缓冲液，混合均匀。将上述混合物在37℃恒温摇床下孵育2小时，取出混合物，向混合物中添加150μl三氯乙酸(trichloroacetic acid)。将混合物于10,000rpm(9600g)、4℃离心10min。收集上清液用于荧光分光光度计分析，在485/520nm激发/发射波长(excitation/emission)的条件下进行测量。
[0061]
图1为5种多肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)、大鼠结肠液(c)、人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中的稳定性结果，5种多肽在结肠中的稳定性均优于其在小肠液中的稳定性。其中，结肠稳定性数据显示，5种多肽在大鼠结肠液中的稳定性最强，猴结肠稳定性次之，人结肠稳定性最差。小肠稳定性数据亦显示相似的结果，5种多肽在大鼠小肠液中的稳定性最强，猴小肠稳定性次之，人小肠稳定性最差。对比不同的多肽药物结构可知，环肽(催产素以及兰瑞肽)在小肠以及结肠液中的稳定性均强于链肽(布舍瑞林、戈舍瑞林以及司美格鲁肽)。
[0062]
图2为辛酰基肉碱对布舍瑞林在人结肠液(a)、猴结肠液(b)、大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对布舍瑞林在人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱均可提高布舍瑞林在人、猴、大鼠结肠液及小肠液中的稳定性。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0063]
图3为不同浓度辛酰基肉碱对戈舍瑞林在人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对戈舍瑞林在人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱均可提高戈舍瑞林在人、猴、大鼠结肠液及小肠液中的稳定性。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0064]
图4为不同浓度辛酰基肉碱对司美格鲁肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对司美格鲁肽在人小肠液(a)、猴小肠液(b)和大鼠小肠液(c)中稳定性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱均可提高司美
格鲁肽在人、猴、大鼠结肠液及小肠液中的稳定性。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0065]
图5为不同浓度辛酰基肉碱对催产素(a)以及兰瑞肽(b)在人结肠液中稳定性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对催产素(c)以及兰瑞肽(d)在人小肠液中稳定性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱均可提高催产素以及兰瑞肽在结肠液及小肠液中的稳定性。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0066]
图6为不同浓度辛酰基肉碱对人结肠液(a)、猴结肠液(b)和大鼠结肠液(c)中蛋白酶活性的影响，以及不同浓度辛酰基肉碱对人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中蛋白酶活性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱对人、猴以及大鼠结肠液及小肠液中的酶活性无影响。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0067]
实施例2
[0068]
本对比例参照实施例1的方法，测定了不同浓度辛酰基肉碱对醋酸艾塞那肽(exendin-4)在肠液中稳定性的影响。
[0069]
图7为不同浓度辛酰基肉碱对醋酸艾塞那肽在人结肠液(a)、猴结肠液(b)、大鼠结肠液(c)、人小肠液(d)、猴小肠液(e)和大鼠小肠液(f)中稳定性的影响。如图所示，三种浓度的辛酰基肉碱均不能提高醋酸艾塞那肽在结肠液及小肠液中的稳定性。其中，对照组为没有加入辛酰基肉碱的空白对照。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种多肽稳定剂，包括：辛酰基肉碱，用于提高多肽在肠道的稳定性。2.根据权利要求1所述的多肽稳定剂，其特征在于，所述多肽包括环肽和/或链肽；和/或所述多肽的分子量小于或等于4k da。3.根据权利要求2所述的多肽稳定剂，其特征在于，所述多肽包括布舍瑞林、舍瑞林、司美格鲁肽、催产素和兰瑞肽中的至少一种。4.一种药物组合物，其特征在于，包括：辛酰基肉碱和多肽。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽包括环肽和/或链肽；和/或所述多肽的分子量小于或等于4k da。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽包括布舍瑞林、舍瑞林、司美格鲁肽、催产素和兰瑞肽中的至少一种。7.根据权利要求4至6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述辛酰基肉碱的浓度为1～100mm；和/或所述多肽和所述辛酰基肉碱的浓度比为5:(2～150)。8.根据权利要求4至6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为用于治疗慢性疾病的药物制剂。9.根据权利要求4至6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为用于口服或肠道给药的固体制剂。10.根据权利要求4至6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：药学上可接受的辅料或载体。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多肽稳定剂和药物组合物。本发明所提供的多肽稳定剂和药物组合物均包括：辛酰基肉碱，辛酰基肉碱能提高多肽在肠道的稳定性，同时，不破坏肠道中的酶活性，解决了当前多肽药物在口服给药途径和肠道给药途径所面临的稳定性低的问题，还可避免长期用药导致肠道酶失活。将本发明所提供的多肽稳定剂应用于制备用于口服或肠道给药的制剂，可有效提高制剂在肠道的稳定性。稳定性。稳定性。


技术研发人员：窦浏 麦扬 秦羽嘉 邵海彬
受保护的技术使用者：深圳奥礼生物科技有限公司
技术研发日：2023.01.12
技术公布日：2023/7/12