一种鸡卵白蛋白OVA表达系统载体构建方法及其应用与流程

一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法及其应用。


背景技术：

2.鸡卵白蛋白(ovalbumin，ova)是蛋清的主要蛋白组分，其含量占蛋清蛋白总量的54％，是一种优质蛋白质。ova的分子质量为44.5kda，是典型的含磷球形的糖蛋白，其等电点为4.5，由385个氨基酸组成。每1个ova分子含有1个二硫键和4个巯基，是蛋清蛋白中唯一1个含有游离巯基的蛋白质。在各种疫苗及生物药的生产制备中，ova常作为蛋白添加剂用于提高生物药或疫苗等的稳定性，或在抗体制备过程中作为载体蛋白用于半抗原的偶联，可有效调动养殖动物的机体非特异性免疫活动，通过养殖动物的自身免疫活动来杀灭侵袭动物机体的外源致病微生物，是高效、无毒无害的优良免疫刺激剂。
3.鸡卵白蛋白ova现有生产技术已经趋近成熟，市面上已有大量相关系列产品上市，但是鸡卵白蛋白ova还没有应用到水产养殖中，主要是因为水产养殖鱼类受限于养殖环境条件，难以通过注射的方式逐一对鱼类进行给药，而鸡卵白蛋白ova易被胃酸分解、消化，无法通过口服饲喂给药，造成给药困难。因此，本发明提供一种鸡卵白蛋白ova在水产养殖中的应用。


技术实现要素：

4.本发明提供一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法及其应用，具体特征在于，一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法包括：（1）利用trizol法提取鸡卵白蛋白ova的rna；（2）将鸡卵白蛋白ova的rna反转录形成cdna；（3）serpinb14扩增鸡卵白蛋白ova、载体构建；
①
先进行引物设计，使用phanta max super-fidelity dna polymerase对鸡卵白蛋白ova进行扩增，再利用clonexpress ultra one step cloning kit连接克隆载体pce-zero测序；
②
通过反向pcr扩增获得含有cmv启动子的ppiczαa线性化载体，以及获得带有同源臂的ova目的片段，进行引物设计，使用clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒将ppiczaa线性化载体与片段无缝连接。
5.（4）目标载体在酵母中诱导表达并纯化；将成功构建的目标载体线性化整合到酵母染色体组，并通过抗性筛选获得含cmv启动子的ova阳性高产菌株。
6.（5）ova阳性高产菌株的规模化发酵生产；对ova阳性高产菌株的高密度发酵，通过发酵液高速离心获得ova酵母菌体，经烘干、超微粉碎，得到破壁ova菌粉，实现规模化生产。
7.因cmv启动子特异性极强，只能在高等动物细胞内部诱导ova目的基因表达。
8.本发明还提供一种鸡卵白蛋白ova在水产养殖中的应用，具体为破壁ova菌粉作为水产饲料添加剂在鱼苗期、养成期及成鱼病害预防中的应用。
9.本发明提供了一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法，通过引入cmv启动子，基因重组构建形成携带有cmv启动子与ova目的片段的ppiczαa载体，通过载体线性化与电转化，将cmv启动子与ova目的片段整合到毕赤酵母染色体组中，获得含有cmv启动子与ova目的片段的阳性重组酵母菌株，通过高密度发酵收获酵母菌体，制备破壁ova菌粉，用作水产饲料添加剂。
10.通过在养殖饲料中添加破壁ova菌粉投喂养殖鱼类，使得携带有cmv启动子的ova目的基因片段进入养殖鱼类肠道，被肠道上皮细胞吸收后，诱导鱼类肠道上皮细胞分泌表达ova蛋白，调动鱼类非特异性免疫防御系统，从而起到增强鱼类免疫力的目的，通过鱼类自身的非特异性免疫活动，来杀灭侵袭鱼体的外源致病微生物，实现防病抗病效果，提高养殖成活率。
附图说明
11.图1为鸡卵白蛋白ova克隆载体流程图。
12.图2为鸡卵白蛋白ova表达载体示意图。
具体实施方式
13.实验试剂trizol试剂购买于碧云天生物技术有限公司hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit (+gdna wiper)试剂盒、phanta max super-fidelity dna polymerase、clonexpress ultra one step cloning kit购买于诺唯赞生物科技有限公司氯仿，异丙醇，75%乙醇（用rnase-free水配制），rnase-free水为本实验室存留
14.1ml注射器，1.5mlep管（depc处理过），大、中、小号枪头（depc处理过）本实施例结合附图提供一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法，具体操作如下：（1）利用trizol试剂提取鸡卵白蛋白ova的rna；
①
选择产蛋后（约40周龄到52周龄）的母鸡，收取其输卵管新鲜组织，具体为对输卵管分段截取，-80℃冻存，部分新鲜组织立即匀浆或液氮研磨提取，取50-100mg组织，置于1.5ml离心管中，加入1ml trizol充分匀浆，室温静置5min。如样品中含有较多的蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉）可与2-8℃1000*g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量dna，上清中含有rna。特别注意的是在处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步骤。
15.②
在上述充分匀浆静置5min后的组织中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15-30s，静置2-3min，4℃离心，12000g*15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂体积的60%，即600微升左右。小心吸取上清至新的depc处理过的1.5mlep管中，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温
静置10min，4℃离心，12000g*10min。离心前看不出rna，离心后在管侧和管底出现胶状物质。
16.③
弃上清，于沉淀中加入75%乙醇（冰冷）1ml，震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，12000g*5min。弃上清，短暂离心，小心吸取弃上清。加入适量（20微升）depc（rnase-free）h2o溶解rna（65℃促溶10-15min）。2微升电泳检测，-80℃保存。
17.（2）将鸡卵白蛋白ova的rna反转录形成cdna；将质量和浓度达标的rna通过hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit (+gdna wiper)（vazyme，中国）试剂盒反转录形成cdna。
18.（3）serpinb14扩增鸡卵白蛋白ova、载体构建；
①
引物设计5'
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②
使用phanta max super-fidelity dna polymerase（vazyme，中国）鸡卵白蛋白ova进行扩增，再利用clonexpress ultra one step cloning kit连接克隆载体pce-zero测序；如图1。
19.③
通过反向pcr扩增获得含有cmv启动子的ppiczαa线性化载体，以及获得带有同源臂的ova目的片段；
④
引物设计5'
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3'使用clonexpress ultra one step cloning kit（vazyme，中国）试剂盒将ppiczaa线性化载体与片段无缝连接；如图2。
20.（4）目标载体在酵母中诱导表达并纯化；将成功构建的目标载体线性化整合到酵母染色体组，并通过抗性筛选获得含cmv启动子的ova阳性高产菌株。
21.（5）ova阳性高产菌株的规模化发酵生产；对ova阳性高产菌株的高密度发酵，通过发酵液高速离心获得ova酵母菌体，经烘干、超微粉碎，得到破壁ova菌粉，实现规模化生产。
实施例
22.鸡卵白蛋白ova在水产养殖中的应用，具体操作如下：（1）：苗期病害预防将破壁ova菌粉按照0.1%的比例进行添加使用。
23.先按照每kg饲料添加10ml水的用量，将破壁ova菌粉与水均匀混合形成悬浊液，再将破壁ova菌粉悬浊液与饲料均匀混合、在阴凉处晾干3-5min，使得破壁ova菌粉均匀粘附在饲料表面，形成破壁ova菌粉饵料，即可投喂鱼苗。每日仅投喂1次破壁ova菌粉饵料，连续投喂7-10天，进行加州鲈鱼苗病害预防。
24.（2）：养成期鱼类病害预防将破壁ova菌粉按照0.5%的比例进行添加使用。先按照每kg饲料添加10ml水的用
量，将破壁ova菌粉与水均匀混合形成悬浊液，再将破壁ova菌粉悬浊液与饲料均匀混合、在阴凉处晾干3-5min，使得破壁ova菌粉均匀粘附在饲料表面，形成破壁ova菌粉饵料，即可投喂养殖鱼类。每日仅投喂1次破壁ova菌粉饵料，连续投喂10-15天，进行加州鲈养成期病害预防。
25.（3）：鱼类病害治疗将破壁ova菌粉按照1%的比例进行添加使用。先按照每kg饲料添加10ml水的用量，将破壁ova菌粉与水均匀混合形成悬浊液，再将破壁ova菌粉悬浊液与饲料均匀混合、在阴凉处晾干3-5min，使得破壁ova菌粉均匀粘附在饲料表面，形成破壁ova菌粉饵料，即可投喂发病鱼类。每日仅投喂1次破壁ova菌粉饵料，连续投喂5-7天，进行加州鲈成鱼病害治疗。
26.实验结果显示破壁ova菌粉能够在鱼苗期、养成期及成鱼期进行病害预防，提高加州鲈养殖成活率。

技术特征：
1.一种鸡卵白蛋白ova表达系统载体构建方法，具体步骤包括：（1）利用trizol法提取鸡卵白蛋白ova的rna；（2）将鸡卵白蛋白ova的rna反转录形成cdna；（3）serpinb14扩增鸡卵白蛋白ova、载体构建；
①
先进行引物设计，使用phanta max super-fidelity dna polymerase对鸡卵白蛋白ova进行扩增，再利用clonexpress ultra one step cloning kit连接克隆载体pce-zero测序；
②
通过反向pcr扩增获得含有cmv启动子的ppiczαa线性化载体，以及获得带有同源臂的ova目的片段，进行引物设计，使用clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒将ppiczaa线性化载体与片段无缝连接；（4）目标载体在酵母中诱导表达并纯化；将成功构建的目标载体线性化整合到酵母染色体组，并通过抗性筛选获得含cmv启动子的ova阳性高产菌株；（5）ova阳性高产菌株的规模化发酵生产；对ova阳性高产菌株的高密度发酵，通过发酵液高速离心获得ova酵母菌体，经烘干、超微粉碎，得到破壁ova菌粉，实现规模化生产。2.根据权利要求1所述的一种鸡卵白蛋白ova在水产养殖中的应用，具体为破壁ova菌粉作为水产饲料添加剂在鱼苗期、养成期及成鱼病害预防中的应用。

技术总结
一种鸡卵白蛋白OVA表达系统载体构建方法，通过引入CMV启动子，基因重组构建形成携带有CMV启动子与OVA目的片段的pPICZαA载体，通过载体线性化与电转化，将CMV启动子与OVA目的片段整合到毕赤酵母染色体组中，获得含有CMV启动子与OVA目的片段的阳性重组酵母菌株，通过高密度发酵收获酵母菌体，制备破壁OVA菌粉。将OVA菌粉用作水产饲料添加剂，实现防病抗病效果，提高养殖成活率。提高养殖成活率。


技术研发人员：张婷婷 李文辉 朱新鹏 刘锦秀 龚婷婷
受保护的技术使用者：江苏亢钧生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/12