软骨组织特异性Cul7基因敲除小鼠模型及基于Cre/LoxP系统建立的方法和应用

软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型及基于cre/loxp系统建立的方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型以及基于cre/loxp系统建立其的方法和应用。


背景技术：

2.3m综合征（omim 273750, 612921, 614205）是一种罕见的骨骼发育异常的常染色体隐性遗传病，其主要临床表现为严重宫内和出生后生长迟缓，骨骼发育异常，明显的身材矮小(《-4 sd)，同时伴有面部畸形，但智力水平与内分泌功能正常。迄今为止，3m综合征致病有关的分子机制并不完全清楚，目前发现三种致病的基因突变包括cul7， obsl1 以及 ccdc8，其中cul7占70%左右，是最常见的一种突变形式。
3.3m 综合征表现为明显的身材矮小，长骨的线性生长依赖于生长板软骨细胞的增殖、分化、凋亡，cul7在小鼠生长板各带软骨细胞的胞浆、胞核和胞膜中均有表达，并且随着周龄的增加，表达量在增殖带下降的最为明显，此外huber等人在研究中发现在cul7基因突变导致的3m综合征胎儿的股骨生长板静止带和增殖带软骨细胞的密度和体积增加，这些研究都表明cul7参与了生长板软骨细胞的生长和增殖。
4.cul7（p185，kiaa0076）在1994年被nomura n等人首次发现，其编码基因位于人类6号染色体短臂(6p21.1)，在人的全身组织中基本都有表达。cul7属于cullin 家族的一员，在信号转导、周期调控和凋亡、衰老中发挥重要的作用。cul7与肿瘤的发生也密切相关，它在多种恶性肿瘤中都有表达，多项研究表明它能够抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞增殖生长。
5.既往研究表明：全身cul7基因敲除的小鼠表现为严重宫内生长迟缓，而且易在围产期因呼吸窘迫而死，阻碍了在出生后生长发育的进一步研究。通过特异性敲除疾病相关的目的基因，引起特定的蛋白或细胞因子缺失来构建出自发性动物疾病模型现在已得到越来越多人的认同。应用cre/loxp系统可以实现在特定类型的组织或器官中特异性敲除目的基因，避免了某些与生长发育相关的基因敲除所导致的胚胎致死问题，在人类动物疾病模型的构建上有着明显优势，并有多篇文献的成功报道。有鉴于此，为了进一步研究3m综合征的致病机制，有必要构建软骨组织特异性cul7 基因条件敲除小鼠模型，而目前并未有基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7 基因条件敲除小鼠模型的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种软骨组织特异性cul7 基因条件敲除小鼠模型，同时提供基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7 基因条件敲除小鼠模型的方法，为进一步研究3m综合征的致病机制以及其他与cul7 基因相关的疾病提供研究基础。
7.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案是：本发明一方面提供了一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其包括如下步骤：s1：选用亲代cul7
fl/fl
小鼠与col2a1-creert2小鼠杂交，获得的基因型cul7
fl/+
；col2a1-creert2小鼠；s2：将获得的基因型cul7
fl/+
；col2a1-creert2小鼠与基因型cul7
fl/fl
小鼠杂交，通过对子代小鼠基因型鉴定的得到cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠。
8.s3：将cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠于出生后第11天，开始腹腔注射他莫昔芬，构建cul7 cko小鼠模型。
9.作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s2中的基因鉴定为根据打靶载体构建时flox区域所在的位置，利用pcr扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳并根据基因片段长度和产物的有无判断小鼠的基因型。
10.作为本发明的一些优选实施方式，所述pcr反应体系中，cul7引物对序列如下:forward p1,5
’‑
tcccagaaacttacgatgtgc-3’；reverse p2，5
’‑
cttgggggtggggagagtg-3’;cre转基因引物对序列如下：forward p3,5
’‑
tcgatgcaacgagtgatgag-3’；reverse p4，5
’‑
tccatgagtgaacgaacctg-3’。
11.作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s3中cul7 cko小鼠模型的验证为根据打靶载体构建时flox全部区域所在的位置，利用pcr扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳或sanger测序判断小鼠的基因型。
12.作为本发明的一些优选实施方式，所述flox全部区域引物对序列如下：forward p5，5
’‑
gatgagggccagttccgacaga-3’；reverse p6，5
’‑
tgggcagcaaaggcagacg-3’。
13.作为本发明的一些优选实施方式，所述步骤s3中，他莫昔芬的注射量为75mg/kg，注射时间为3d，既保证敲除效率，又保证小鼠存活率。
14.本发明另一方面提供了上述方法所建立的软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型。
15.本发明再一方面提供了上述方法所建立的软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型在cul7基因信号传导通路以及3m综合征的致病机制研究以及筛选药物中的应用。
16.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明首次基于cre/loxp系统成功建立了软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型，表现为明显的生长发育迟缓，四肢短小，与3m综合征患者的临床表现相一致。本发明模型的成功建立为后续进一步研究cul7基因信号传导通路以及3m综合征的致病机制提供了可靠的实验模型。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
18.图1为本发明cul7
flox/flox
小鼠模型的构建思路图；图2为本发明实施例1的实验流程图；图3为cul7 cko基因小鼠模型的基因型验证图；其中：（a）cul7
fl/fl
纯合子有399 bp一条带；cul7
fl/+
杂合子有399 bp和258 bp两条带，cul7
+/+
野生型有258bp一条带；cre重组酶有400bp有一条带；（b）cul7 cko在903 bp有一条带；cre没有发挥作用，在2484bp有一条带；图4为本发明cul7 cko基因小鼠模型的sanger测序图；图5为本发明cul7 cko基因小鼠模型的蛋白印迹图；图6为本发明实施例2cul7蛋白表达对比图；图7为本发明实施例2cul7免疫组化染色图；图8为本发明实施例2cul7 cko基因小鼠模型和对照组小鼠外观形态照；其中:（a）两组小鼠外观照；（b）x 射线片形态照；（c）两组小鼠后肢外观形态照；图9为本发明实施例2cul7 cko基因小鼠模型和对照组小鼠鼻尾长对比图；图10为本发明实施例2cul7 cko基因小鼠模型和对照组小鼠股骨长对比图；图11为本发明实施例2cul7 cko基因小鼠模型和对照组小鼠胫骨长对比图。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
20.本部分所用的实验动物来源如下：本部分使用了c57bl/6遗传背景下的亲代cul7
flox/flox
小鼠与 col2a1-creert2小鼠，spf级，雌雄各半，8周龄，平均体重约20g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，生产许可证号：scxk（沪）2017-0010；于河北医科大学第二医院动物实验中心恒温恒湿 spf 级环境下饲养，使用许可证号：syxk（冀）2021-003；所有动物程序和协议均经河北医科大学第二医院（中国河北）伦理委员会 (批准号：2022-ae252) 批准。
21.本部分建立了创新性的软骨组织特异性敲除代替全身cul7基因敲除小鼠模型，为3m综合征的致病机制提供了可靠的实验模型。3m 综合征表现为明显的身材矮小，软骨是动物重要又特殊的支撑器官和组织。在胚胎发育时期，软骨首先形成，并在发育过程中主导成骨过程并最终形成成熟的骨骼(软骨内成骨，endochondralossification)。软骨内成骨是长骨等骨骼的主要形成方式，包括股骨(femur)、胫骨(tibia)、尺骨(ulna)、桡骨(radius)、肱骨(humerus)等在内的全身大部分主要四肢骨、以及椎骨(vertebra)、肋骨(rib)等主要的躯干支持骨骼，其产生和发育都来源于软骨内成骨过程。
22.本部分应用cre/loxp系统建立cul7条件性基因敲除小鼠模型，需要2种转基因动物，一种是在靶向敲除组基因序列中引入loxp序列的cul7转基因小鼠，另一种是通过col2a1启动子驱动的creert2转基因小鼠。然后通过杂交构建出体内同时含有cre重组酶基因和loxp序列的条件性基因敲除小鼠。
23.1、cul7
flox/flox
小鼠模型的构建思路为：(1)目的基因名称（ensembl号）：cul7（ensmusg00000038545）(2)目的基因ensembl网址链接：
(3)针对的转录本（ensembl号）：cul7-201（ensmust00000043464.13）(4)flox针对的exon：exon 5-7，cul7的567外显子发挥着重要作用，因此我们在567外显子两侧加入loxp序列，见图1。
24.2、col2a1-creert2小鼠(1)cre-ert2小鼠是一类含有雌激素受体（estrogen receptor，er）的配体结合区突变体（ert）与cre重组酶的融合蛋白表达的小鼠。软骨作为胶原蛋白的主要承载组织器官之一，同时表达着包括col1a1，col2a1和col10a1等多种胶原蛋白，其中col2a1在软骨细胞形成和发育的全部时期都保持着极高的表达，成为软骨细胞和软骨组织的特异性标记之一。因此本研究使用col2a1启动子驱动的creert2转基因小鼠，从而可以在软骨组织中特异性调控表达cre。
25.(2)cre-ert2在无他莫昔芬（tam，tamoxifen）诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当tamoxifen诱导后，tamoxifen的代谢产物4-oht（雌激素类似物）与ert结合，可使cre-ert2进核发挥cre重组酶活性，特异性识别loxp序列，当两个loxp序列位于同一条dna链且方向相同时，从而敲除两个loxp序列间的dna片段。
26.以下结合具体实施方式详细说明基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法。
27.实施例1 构建cul7 cko小鼠模型1.1鼠的饲养和繁殖将亲代cul7
fl/fl
小鼠与col2a1-creert2小鼠杂交，获得的基因型cul7
fl/+
；col2a1-creert2小鼠再与基因型cul7
fl/fl
小鼠杂交，获得刚出生的小鼠。在模型小鼠繁育过程中，雄性和雌性小鼠以1∶2或1∶3的比例合笼交配。通过对子代小鼠基因型鉴定得到cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠，实验流程示意图见图2。
28.1.2 小鼠子代基因型鉴定根据打靶载体构建时flox区域所在的位置，利用pcr扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳并根据基因片段长度和产物的有无判断小鼠的基因型。
29.1.2.1 dna的提取剪取出生后5天小鼠的脚趾，置于2 ml ep管中，每管加入230
ꢀµ
l buffer ga和20
ꢀµ
l proteinase k，55℃水浴过夜至组织完全酶解；加入250
ꢀµ
l buffer gb，涡旋混匀，70℃水浴10 min。纯化、基因组洗脱。
30.1.2.3 鼠趾cre、cul7基因的扩增和琼脂糖凝胶电泳pcr反应体系总计50μl，cul7引物序列如下:forward p1,5
’‑
tcccagaaacttacgatgtgc-3’；reverse p2，5
’‑
cttgggggtggggagagtg-3’;cre转基因引物序列:forward p3,5
’‑
tcgatgcaacgagtgatgag-3’；reverse p4，5
’‑
tccatgagtgaacgaacctg-3’。
31.前引物(10 μmol/l)2μl，后引物(10 μmol/l)2μl，dna原液1-2μl（根据浓度，使用
量为 10-400 ng），monamp
™ꢀ2×ꢀ
taq mix pro (+dye)25μl，ddh2o 19-20μl。pcr（type:5020，品牌：thermo fisher）扩增条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃ 20 s，32个循环；72 ℃ 5 min。
32.1.4g琼脂糖溶于70 ml1
×
tae（tris-乙酸）中配置2%琼脂糖溶液，煮胶、备板、倒胶后，取10μl扩增产物上样，胶板右端空槽加6μl dna marker，电泳结束后凝胶成像系统（型号：universal hood
ꢀⅲ
，品牌：biorad）观察。电泳条件：120v，30min。
33.1.3 构建 cul7 cko小鼠模型将cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠于出生后第11天，开始按照75mg/kg腹腔注射他莫昔芬（玉米油溶解，20mg/ml）,每天一次，连续注射3d。对小鼠进行敲除后基因型验证（方法同1.2），flox全部区域引物序列如下：forward p5，5
’‑
gatgagggccagttccgacaga-3’；reverse p6，5
’‑
tgggcagcaaaggcagacg-3’。
34.将扩增产物进行sanger测序:纯化pcr产物，定量，上机测序，进行序列分析结果。
35.实施例2 小鼠模型验证2.1 基因水平验证小鼠模型——琼脂糖凝胶电泳和sanger测序通过琼脂糖凝胶电泳鉴定结果筛选出条件性基因敲除cul7
fl/fl
；col2a1-creert2基因小鼠，cul7
fl/fl
纯合子有399 bp一条带，cre重组酶有400bp有一条带（图3a）。予以注射他莫昔芬后cre发挥作用在903 bp有一条带，得到cul7 cko小鼠模型，见图3b。sanger测序结果再次证实了pcr结果，见图4，即cul7基因在软骨中条件性被敲除，验证 cul7 cko小鼠模型构建成功。
36.如图4所示，标记为 cul7切除片段。
37.2.2 蛋白水平验证小鼠模型——western blot和免疫组化western印迹显示，相对于对照组，cul7蛋白在3周实验组表达量显著降低（图5），并且它们的表达水平与gapdh的表达水平标准化（差异具有统计学意义，t=27.956，p《0.001）（图6）。cul7免疫组化染色结果与上述结果一致（图7），进一步验证了他莫昔芬的敲除效率。
38.2.3 宏观形态学水平验证小鼠模型——小鼠外观形态照及x射线观察比较第4周小鼠大体外观照及x射线片发现实验组cul7基因敲除小鼠较对照组小鼠出现了明显的肢体短缩，表现为肢体短小畸形，腹部稍隆起，见图8；比较解剖后两组小鼠的后肢外观形态，实验组表现为：细长的管状骨，见图8c；x射线观察显示3-6周实验组小鼠肢体的长度明显缩短，鼻尾长、胫骨长、股骨长都短于对照组，且差异有显著性意义（*p 《 0.05, **p 《 0.01,***p 《 0.001），两组鼻尾长、胫骨长、股骨长的长度数据对比见图9-11。
39.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，其包括如下步骤：s1：选用亲代cul7
fl/fl
小鼠与col2a1-creert2小鼠杂交，获得的基因型cul7
fl/+
；col2a1-creert2小鼠；s2：将获得的基因型cul7
fl/+
；col2a1-creert2小鼠与基因型cul7
fl/fl
小鼠杂交，通过对子代小鼠基因型鉴定的得到cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠。2.s3：将cul7
fl/fl
；col2a1-creert2小鼠于出生后第11天，开始腹腔注射他莫昔芬，构建cul7 cko小鼠模型。3.根据权利要求1所述的一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤s2中的基因鉴定为根据打靶载体构建时flox区域所在的位置，利用pcr扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳并根据基因片段长度和产物的有无判断小鼠的基因型。4.根据权利要求1所述的一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述pcr反应体系中，cul7引物对序列如下:forward p1,5
’‑
tcccagaaacttacgatgtgc-3’；reverse p2，5
’‑
cttgggggtggggagagtg-3’;cre转基因引物对序列如下：forward p3,5
’‑
tcgatgcaacgagtgatgag-3’；reverse p4，5
’‑
tccatgagtgaacgaacctg-3’。5.根据权利要求1所述的一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤s3中cul7 cko小鼠模型的验证为根据打靶载体构建时flox全部区域所在的位置，利用pcr扩增基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳或sanger测序判断小鼠的基因型。6.根据权利要求1所述的一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述flox全部区域引物对序列如下：forward p5，5
’‑
gatgagggccagttccgacaga-3’；reverse p6，5
’‑
tgggcagcaaaggcagacg-3’。7.根据权利要求1所述的一种基于cre/loxp系统建立软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤s3中，他莫昔芬的注射量为75mg/kg，注射时间为3d。8.一种如权利要求1-6任一项所述的方法所建立的软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型。9.如权利要求7所述的软骨组织特异性cul7基因敲除小鼠模型在cul7基因信号传导通路以及3m综合征的致病机制研究以及筛选药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种特异性Cul7基因敲除小鼠模型以及基于Cre/LoxP系统建立其的方法和应用，具体为选用亲代Cul7


技术研发人员：张亚男 胡芳瑞 李慧 段秦利 李玉倩 皮亚雷
受保护的技术使用者：河北医科大学第二医院
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/7/12