一种基于三维DNAWalker检测大肠杆菌的比色生物传感器

一种基于三维dna walker检测大肠杆菌的比色生物传感器
技术领域
1.本发明属于传感器技术领域，特别涉及基于三维dna walker的比色传感平台用于大肠杆菌的高效检测。


背景技术：

2.食源性致病菌引起的疾病已经严重威胁到公共健康和食品安全。根据世界卫生组织统计，全球每年大约有6亿人因食用受到细菌、寄生虫等污染的食物而患病。大肠杆菌（escherichia coli）是人类结肠菌群中的兼性厌氧菌，可以随粪便排出后在环境中广泛散播，因此大肠杆菌被视为水体卫生学检测以及食品类粪源污染的卫生学指标。目前，常规的对大肠杆菌o157:h7的分离鉴定方法通常包括增菌、分离、生化实验、血清学鉴定等步骤，稳定性好、操作简便，但是需要的劳动强度大，耗时长。酶联反应吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, elisa)是以抗体为识别元件，利用酶的催化特性使底物产生颜色变化，从而能够进行定性或定量分析。该方法特异性强、检测效率高，被广泛用于基层检测单位，但是制备成本高、生产过程复杂、用于目标物的捕获分子的可用性有限、物理和化学稳定性差、批次间差异巨大。聚合酶链式反应(pcr)主要检测的是大肠杆菌的致病基因，具有检测速度快、灵敏度高等优点。但也存在假阳性、需要复杂的仪器设备、反应效率差异大等缺点。因此，开发简单、快速、特异性高的检测技术对食源致病菌的预防及诊断具有重大意义。


技术实现要素：

3.为了实现更加快速、低成本的检测大肠杆菌，本发明提出了一种基于三维dna walker的比色生物传感器。本发明的传感器具有良好的分析性能，并且具有裸眼可见、检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点。可以弥补外泌体现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。本研究所制备的比色生物传感器对致病菌的检测具有方法上的通用性，在食品样品以及环境监测中具有潜在的应用前景。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
5.一种检测大肠杆菌o157:h7的生物传感器，包括apt-t复合探针，修饰dz-l链和hap的aunrs，血红素，k
+
，mg
2+
，tmb，h2o2；所述apt-t复合探针由适配体apt和t链杂交获得；所述dz-l链由dz链和l链杂交获得；所述apt、t链、dz链、l链、hap的核苷酸序列如seq id no:1-5所示；所述dz链的5’端修饰-sh；所述hap的5’端修饰-sh，3’端第19位为核糖核酸。
6.所述修饰dz-l链和hap的aunrs的制备方法，包括以下步骤：将dz-l链和hap与aunps混合孵养；然后分次加入5m nacl，在室温放置；随后离心并重悬沉淀于ph7.0-7.6的缓冲液中，获得修饰dz-l链和hap的aunrs。
7.dz-l链和hap与aunps的摩尔比为80:800:1。
8.所述aunrs采用以下方法制备获得：（1）将ctab溶液和haucl4溶液混合均匀，加入nabh4溶液混合后水浴反应，获得种子液；（2）金纳米棒的生长：将ctab溶液和haucl4溶液混合均匀，加入agno3、抗坏血酸和种子液混合后水浴反应，反应液离心后沉淀用清水清洗，以去离子水重悬后获得纳米棒溶液。
9.步骤（1）中，ctab和haucl4的摩尔比为400:1；nabh4和haucl4的摩尔比为2-3:1。
10.步骤（1）中，水浴温度为25℃。
11.步骤（2）中，ctab和haucl4的摩尔比为20:1；agno3和haucl4的摩尔比为0.024:1；抗坏血酸和haucl4的摩尔比为0.11:1。
12.步骤（2）中，离心的转速为8500rpm。
13.步骤（2）中，水浴温度为28℃。
14.一种包含上述生物传感器的试剂盒。
15.所述试剂盒还可包括目标物大肠杆菌o157:h和缓冲液。
16.本发明的检测原理如图1所示，其中各序列如下：apt：5
’‑
ccggacgctta tgccttgccatctacagagc aggtgtgacgg-3’；t链：5
’‑
t ccgtcacacct ttt taagcgtccgg-3’；dz链5
’‑
sh-ployt
55-acctttttaagcgtccggtctctt ctccgagccggtcgaaatagc-3’；l链5
’‑
aagagaccggacgcttaaaaaggt gtgacgga-3’；发夹hap5
’‑
sh-ployt
10-tgggtagggcgggttgggactat/ra/ggaagagaaaagccctac-3’。
17.该反应体系由两大部分组成：（1）apt-t复合探针，该探针由大肠杆菌的适配体apt和一条t链组成，在无目标物时，该探针处于稳定结构；（2）dna功能化的aunrs，其中，dz链含有mg
2+
dnazyme的序列，hap修饰有酶切位点（ra），其5’端均修饰有巯基（-sh）。上述dna链与aunrs通过金硫键结合，组成三维dna walker体系。在最初的状态下，l链与dz链部分互补配对结合，使得mg
2+
dnazyme活性区域被封闭，不能发生切割作用。当目标物存在时，apt-t复合探针中的适配体序列与之特异性识别并结合，从而释放t链，t链与l链的toehold区域互补配对，通过链置换反应将l链从dz链上置换下来，dnazyme切割活性得以恢复。dz链与hap杂交，在加入mg
2+
的情况下，产生切割作用。hap断裂成两部分之后dz链与其不能稳定结合从而被释放，转而与aunrs上的其他hap发夹相结合并切割，产生一个行走的效应，最终导致hap发夹均被裂解。hap的裂解导致被封闭在发夹中的g-四链体序列暴露，k
+
的存在使其自发折叠形成g-四链体。血红素嵌入g-四链体后形成g-四链体dnazyme，添加tmb作为底物，会发生氧化反应从而产生从无色到蓝色的颜色变化。
18.本发明具有以下优点：
dna walker是一种dna分子机器，其组成部分的核酸可以自主地、渐进地沿着预定的轨迹运动，具有较强的信号放大能力。利用适配体对e. colio157:h7进行识别，极大的降低了背景信号，特异性高；制备了基于aunrs的三维dna walker。由于dna walker具有扩增性能好以及dna富集能力强等优势，提高了信号的放大效率以及放大倍数。所制备的生物传感器利用了g-四链体dnazyme的类辣根过氧化物酶性质，使得tmb氧化成为oxtmb，产生裸眼可见的颜色反应，通过吸光度即可进行定量检测。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
19.图1为该实验的原理图；图2为血红素浓度优化检测结果图；图3为反应时间优化检测结果图；图4为mg
2+
浓度优化检测结果图；图5为传感器检测大肠杆菌的可见光扫描图；图6为传感器检测大肠杆菌的工作曲线。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
21.实施例1 生物传感器的构建（1）细菌样品制备将大肠杆菌o157:h7在luria-bertani培养基（12 g胰蛋白胨，7 g氯化钠，6 g酵母提取物）中培养，在恒温摇床中培育12 h。收集到的培养液在800 rpm下离心5 min后，沉淀用pbs冲洗一次，再次离心并将沉淀重悬于pbs中，采用平板计数法测定菌悬液浓度。
22.（2）apt-t复合探针的制备商业化合成t链和大肠杆菌o157:h7的适配体apt；将等体积10 μm apt和10 μm t链在tris-hcl缓冲液（50 mmtris、0.5 m nacl、100 mmkcl）中于95℃下共孵育5 min，自然冷却至室温以形成apt-t复合探针（10μm），贮存在4℃备用；商业化合成dz链和l链，按照上述方法制备dz-l链（10μm），贮存在4℃备用。
23.（3）aunrs的制备及修饰（i）制备金种子：将5ml ctab溶液（0.2 m）、5ml haucl4（0.0005 m）和0.6 ml新鲜制备的nabh4（0.01 m）依次加入，在26℃水浴中孵育1 h；（ii）金纳米棒的生长：将100 ml的haucl4（0.01 m）加入至100 ml的0.2 m的ctab溶液中，随后加入6 ml的agno3（0.004 m）、1.4 ml 0.0788 m抗坏血酸和240 μl的（i）中所制备的种子溶液，28℃下生长8 h；将制备好aunrs溶液以8500 rpm离心15 min，去离子水清洗两次后重悬，倒掉上清液后，放置于4℃保存备用。
24.（iii）aunrs进行dna功能化：将10 μl的dz-l（10 μm）和10 μl的hap（100 μm）与1 ml的aunrs（1.25 nm）混合，并在室温下孵养6小时；将10
µ
l nacl（5 m）在20 h内分10次慢慢
nm处吸光度值。结果如图4所示，从图中可以看出，检测到随着mg
2+
的浓度增大紫外吸光强度逐渐增加，吸光度在其浓度达到5.0 μm以后吸光度增加不再明显，因此选用5.0 μm mg
2+
浓度为最佳浓度。
29.实施例5 比色传感器对大肠杆菌的检测限取实施例1制备的细菌样品、apt-t复合探针、dna-aunrs，然后按照以下步骤测定比色传感器的检测限：取8只ep管，分别加入27 μl的由apt-t复合探针（3 μl，10μm）、dna-aunrs溶液（3 μl）、10
×
tris-hcl缓冲液（3 μl）、kcl（3 μl，200 mm）、mgcl2（3 μl，5 mm）和h2o2（12 μl）、hemin（3 μl，1μm）组成的混合溶液中，再分别加入3 μl浓度为0cfu/ml，10cfu/ml，50cfu/ml，102cfu/ml，1
×
103cfu/ml，1
×
104cfu/ml，5
×
104cfu/ml，1
×
105cfu/ml的大肠杆菌，在37℃孵育90 min。随后，加入tmb试剂，室温反应30 min后加入h2so4（1 m）终止反应。使用紫外-可见光分光光度计扫描测定350nm-600 nm处吸光度值，分别以大肠杆菌浓度-a
450
和lg大肠杆菌浓度-a
450
作图，结果如图5-6所示。随着大肠杆菌浓度的不断增加，从0 cfu/ml-1
×
105cfu/ml，在450 nm处，吸收光强度逐渐增强，这表明所制备的比色生物传感器对大肠杆菌浓度的变化敏感。大肠杆菌的浓度在10cfu/ml-1
×
105cfu/ml这一范围内，其浓度的对数值与吸收光强度具有良好的线性关系。线性回归方程为a=0.017+0.172
×
lgc，相关系数r2为0.997，其中a代表吸收光强度，c代表大肠杆菌的浓度（cfu/ml）。根据空白样品所对应的紫外吸收光强度的三倍偏差的计算方法，计算出该比色传感器的检测限为5.8 cfu/ml。

技术特征：
1.一种检测大肠杆菌o157:h7的生物传感器，其特征在于，包括apt-t复合探针，修饰dz-l链和hap的aunrs，血红素，k
+
，mg
2+
，tmb，h2o2；所述apt-t复合探针由适配体apt和t链杂交获得；所述dz-l链由dz链和l链杂交获得；所述apt、t链、dz链、l链、hap的核苷酸序列如seq id no:1-5所示；所述dz链的5’端修饰-sh；所述hap的5’端修饰-sh，3’端第19位为核糖核酸。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，修饰dz-l链和hap的aunrs的制备方法，包括以下步骤：将dz-l链和hap与aunps混合孵养；然后分次加入5m nacl，在室温放置；随后离心并重悬沉淀于ph7.0-7.6的缓冲液中，获得修饰dz-l链和hap的aunrs。3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，dz-l链和hap与aunps的摩尔比为80:800:1。4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，aunrs采用以下方法制备获得：（1）将ctab溶液和haucl4溶液混合均匀，加入nabh4溶液混合后水浴反应，获得种子液；（2）金纳米棒的生长：将ctab溶液和haucl4溶液混合均匀，加入agno3、抗坏血酸和种子液混合后水浴反应，反应液离心后沉淀用清水清洗，以去离子水重悬后获得纳米棒溶液。5.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，步骤（1）中，ctab和haucl4的摩尔比为400:1；nabh4和haucl4的摩尔比为2-3:1。6.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，步骤（2）中，ctab和haucl4的摩尔比为20:1；agno3和haucl4的摩尔比为0.024:1；抗坏血酸和haucl4的摩尔比为0.11:1。7.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，步骤（1）中，水浴温度为25℃；步骤（2）中，水浴温度为28℃。8.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，步骤（2）中，离心的转速为8500rpm。9.一种包含如权利要求1-8任一所述生物传感器的试剂盒。10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括目标物大肠杆菌o157:h和缓冲液。

技术总结
本发明提供了一种基于三维DNA Walker检测大肠杆菌的比色生物传感器，包括Apt-T复合探针，修饰Dz-L链和HAP的AuNRs，血红素，K


技术研发人员：黄加栋 王会会 王玉 刘素 李静静 郭志强 李倩茹 姚玉颖 朱镜儒 李宗强 孟焱铃 张明朔 岳旭东 潘欢
受保护的技术使用者：济南大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/12