高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针

1.本实用新型属于质谱检测前处理领域，具体涉及一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针。


背景技术：

2.具有空间分辨能力的原位质谱（ambient mass spectrometry）或质谱成像（mass spectrometry imaging, msi）是一种新型的质谱检测技术。他结合了质谱的多通道检测特点以及各种原位采样电离探针的实时采样以及空间分辨的特点。其多通道同时检测的特点满足了系统生物学中蛋白组学和代谢组学要求的高通量非靶标分析。同时其具有的空间分辨能力可以得到多种分子的空间分布信息，也满足了生物学在组织功能区域以及细胞层面的分子机理探索对空间分辨的要求。例如脑科学中神经信号传导的机理研究依赖于对脑部多种信导物质在不同脑功能区块上含量分布变化的追踪；癌细胞扩散转移的识别离不开对组织内单细胞尺度的代谢组学分析。
3.为实现质谱的空间分辨检测，各种应用于质谱成像的采样或电离技术不断发展。原位液体萃取技术（ambient liquid extraction techniques）就是其中一种空间分辨采样技术。其通过在探针与样品表面之间产生稳定的微米到亚毫米直径的液结点来在一定微小区域内对样品中的分析物实现萃取作用，再通过液体流路控制将萃取溶液实时送入质谱进行检测。比其他电离采样的方法理论上具有更高的采样效率，灵敏度更高；同时装置简单灵活，造价低廉；可与不同的质谱离子源联用实现在线的质谱成像。目前由探针的结构可分为液流探针技术(flow-probe)、单探针技术（single-probe）、液体萃取表面分析技术（liquid extraction surface analysis, lesa）、纳流解析电喷雾技术（nanospray desorption electrospray ionization, nanodesi）、天鹅探针技术（swan probe）等。其中，单探针技术目前可以达到最高的空间分辨率（8.5
ꢀµ
m），且其具有针尖可插入细胞的优势，可以实现高空间分辨的质谱成像甚至单细胞分析。目前其他探针都难以做到。但是，由于其探针流路结构的限制和弊端导致其萃取后的分析物扩散十分严重，使得检测到的分析物信号降低，分析灵敏度下降。同时此探针液结点很难稳定。 而最早出现的微液结点表面采样技术虽然具有更高的液结点稳定性，但目前受到毛细管直径的限制空间分辨率很低，通常是300-1000
µ
m左右。目前随着生物领域对质谱成像空间分辨率以及成像质量的要求，以及对单细胞分析的前沿探索，同时具有高稳定性、小的管路内分子扩散、高空间分辨率的探针急需进行开发。


技术实现要素：

4.本实用新型所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种同时具有高稳定性、小的管路内分子扩散、高空间分辨率的原位液体采样探针。
5.为解决上述技术问题，本实用新型提出的技术方案为：
6.一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，包括石英
外毛细管和石英内毛细管，所述石英内毛细管同轴套于所述石英外毛细管的内部；所述石英内毛细管的外径小于石英外毛细管的内径；
7.所述石英外毛细管、石英内毛细管均由外径较小的尖端延伸到外径较大的b端；所述石英外毛细管的尖端外径为10-200
µ
m，所述石英内毛细管的尖端外径为2-30
µ
m；
8.所述石英外毛细管的b端与三通的其中一个出口进行连接；
9.所述石英内毛细管的b端穿过所述三通的内腔从三通的另一个出口露出，所述石英内毛细管的尖端位于所述石英外毛细管的内部并靠近尖端一侧。
10.上述的原位液体萃取采样探针，优选的，所述石英外毛细管的长度为3-5cm，所述石英内毛细管的长度为10-20cm。
11.优选的，所述石英内毛细管b端的外径与石英外毛细管b端的内径差值为50-100
µ
m。
12.优选的，所述石英内毛细管的尖端相对于所述石英外毛细管尖端的间距为0-50
µ
m。
13.优选的，所述石英外毛细管的b端通过转接套管和接头与三通的其中一个出口进行连接。
14.优选的，所述石英内毛细管与三通的另一个出口处利用转接套管和接头将所述石英内毛细管固定。
15.更优选的，所述三通为peek三通，所述转接套管为fep转接套管，所述接头为标准1/16
’’
的peek接头。
16.更优选的，所述三通的第三个出口通过传输管与注射泵相连。
17.更优选的，露出的石英内毛细管b端（利用fep转接套管和标准1/16
’’
的peek接头）与质谱离子源入口连接或（利用硅胶密封垫）与真空腔连接。
18.更优选的，所述真空腔再与真空泵相连。
19.更优选的，与所述三通第三个出口连接的注射泵（以一定流速）向所述石英外毛细管泵入萃取溶液，萃取溶液流入尖端再由所述质谱离子源喷雾形成的真空或所述真空腔连接的真空泵产生的真空吸入所述石英内毛细管。
20.上述的原位液体萃取采样探针的制备方法，包括如下步骤：
21.s1. 将两种不同内外直径的石英毛细管在丁烷打火机上拉细后用镊子趁热夹断，产生两种不同开口直径的尖端，石英毛毛细管未拉细的另一端为b端，得到直径较大的石英外毛细管和直径较小的石英内毛细管；
22.s2. 将石英内毛细管的尖端套入石英外毛细管的尖端一头的内部形成同轴套管，石英外毛细管的b端（利用fep转接套管和标准1/16
’’
的peek接头）与三通的其中一个出口连接，石英内毛细管的b端穿过三通内腔从三通的另一个出口露出，并（利用fep转接套管和标准为1/16
’’
的peek接头）将石英内毛细管固定在三通的此出口处；三通的第三个出口通过传输管与注射泵相连；露出的石英内毛细管b端（利用fep转接套管和标准1/16
’’
的peek接头）与质谱离子源入口连接或（利用硅胶密封垫）与真空腔连接，真空腔再与真空泵相连；
23.s3. 在显微镜下调节石英内毛细管尖端和石英外毛细管尖端的距离并固定。
24.上述的原位液体萃取采样探针在原位质谱检测中的操作方法，包括如下步骤：
25.（1）与三通第三个出口连接的注射泵以一定流速向探针的石英外毛细管泵入萃取
溶液，溶液流入尖端再由质谱电离源喷雾形成的真空或真空腔连接的真空泵产生的真空吸入石英内毛细管；
26.注射泵设置的推液流速在0-50
µ
l/min，优选0-2
µ
l/min；质谱离子源为电喷雾电离源或大气压化学电离源；
27.（2）探针尖端悬于待检测的样品表面上方，探针与样品的间距控制在5-50
µ
m；滴入萃取溶液使其在探针尖端与样品表面之间接触，并在探针尖端与样品之间形成液结；
28.液结点的直径需调节到与探针尖端直径基本一致；萃取溶剂为对样品中分析物有萃取作用的且与质谱离子源兼容的有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂，优选甲醇、乙腈、水及其混合溶剂；样品为固体或半固体，优选动物植物组织、微生物菌落、细胞爬片、包装纸或壁画等商业产品；
29.液结点的调节方式如下：在固定推液流速下，通过调节真空泵的真空度来产生稳定的、直径与探针直径基本一致的液结点。当采用质谱离子源提供真空度时，通过调节注射泵的推液流速来产生稳定的、直径与探针直径基本一致的液结点。
30.与现有技术相比，本实用新型的有益效果为：
31.1、本实用新型针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，将液流探针的内石英外毛细管1的尖端进行拉制，形成尺寸可调节的更小（10-200
µ
m）的探针针尖；同时通过实验探究内石英外毛细管1间距与萃取流出曲线之间的关系，优化得到了探针内扩散最小且液节点稳定的最优内石英外毛细管1间距（0-50
µ
m）；此新型的探针集高的单细胞级别的空间分辨率与低的探针内谱带扩散以及高的液节点稳定性于一体。
32.2、对比传统的液流探针，本实用新型探针解决了目前所有已报道的探针的大部分问题的新型原位液体萃取探针技术，具体如下：
33.1）本实用新型探针的空间分辨率提高10倍以上，最小采样直径可到10
µ
m，而传统液流探针在300
µ
m以上；
34.2）对比已报道的单探针，本实用新型探针萃取后的分析物谱带扩散减小了5倍左右，且其可以在悬空状态下形成液节点，而单探针只能在精确控制探针样品间距的条件下形成液节点，所以其液节点稳定所需的条件更低；
35.3）对比已报道的nanodesi和天鹅探针这两种新型探针，本实用新型的针尖型探针形式非常利于插入细胞内部进行单细胞分析，而前两种探针无法插入细胞；且本实用新型探针的空间分辨率也比前两种探针要更高。
附图说明
36.为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1是微型套管探针的结构示意图。
38.图例说明：1、石英外毛细管；2、石英内毛细管；3、转接套管；4、接头；5、三通；6、传输管；7、探针内外毛细管间距。
具体实施方式
39.为了便于理解本实用新型，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本实用新型做更全面、细致地描述，但本实用新型的保护范围并不限于以下具体实施例。
40.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本实用新型的保护范围。
41.除非另有特别说明，本实用新型中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
42.本实用新型方法先进行探针的制作，探针具体结构由图1所示。在本实用新型一个具体实施方式中，探针采用外径360
µ
m内径250
µ
m的聚酰亚胺膜保护的熔融石英毛细管作为外管（即石英外毛细管1），采用外径150
µ
m内径100
µ
m的聚酰亚胺膜保护的熔融石英毛细管作为内管（即石英内毛细管2）。两种石英毛细管均采用蜡烛火焰将下端2cm长度的外层聚酰亚胺膜烧掉，然后利用丁烷打火机将此区域加热，同时利用镊子将毛细管迅速拉伸至2倍长，关火后用手术剪刀将最细处迅速剪断，可得到尖端平整且直径在10-30
µ
m的探针针尖；此尖端可进一步通过用剪刀截断或用磨砂玻璃打磨的方式调节尖端直径到更大。所有毛细管的与尖端相反的一端称为b端。采用fep（氟化乙烯丙烯共聚物）转接套管3以及标准1/16
’’
的peek接头4将石英外毛细管1的b端连接到peek三通5的其中一个出口处；然后将石英内毛细管2的尖端从三通5的另一个出口插入直到伸入石英外毛细管1的内部，同时在此出口利用fep转接套管3和标准1/16
’’
的peek接头4将石英内毛细管2固定；通过移动石英内毛细管2可以调节石英内毛细管2的针尖相对于石英外毛细管1的回缩间距；将探针内外毛细管间距7调节到0-50
µ
m后便可旋紧接头4将石英内毛细管2固定。石英内毛细管2长度约10-20cm；石英外毛细管1长度约3-5cm。以上参数的具体值见以下各实施例。
43.本实用新型将探针固定在三轴步进电动平台的z轴上，可进行上下移动控制探针与样品之间的距离。而样品被固定在三轴平台的xy轴上，可前后左右移动以控制探针在样品上的相对位置。
44.本实用新型将三通5的第三个出口通过传输管6（供液毛细管）与注射泵的注射器相连，用于向石英外毛细管1泵入萃取液。石英内毛细管2与质谱离子源或真空泵相连以提供真空度将萃取液吸入石英内毛细管2。具体连接方式见具体实施例。
45.本实用新型利用z轴移动探针控制样品与探针之间的距离。通过显微摄像头来观测样品与探针之间的实时距离以及液节点的稳定性。
46.所述三轴步进电动平台为在xyz三个方向可线性移动的平台，三轴步进电机的精度和移动范围视成像样品的大小与成像空间分辨率而定。三轴步进电动平台为本领域技术人员熟知技术。
47.所述真空泵主要为带有真空度控制器的隔膜泵。
48.所述质谱离子源可以是电喷雾电离源和大气压化学电离源等。
实施例1
49.一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其结构示意如图1所示，包括石英外毛细管1和石英内毛细管2，石英内毛细管2同轴套于石英外毛细
管1的内部；石英内毛细管2的外径小于石英外毛细管1的内径；
50.石英外毛细管1、石英内毛细管2均由外径较小的尖端延伸到外径较大的b端；石英外毛细管1的尖端外径为50
µ
m，石英内毛细管2的尖端外径为10
µ
m；石英外毛细管1的长度为3cm，石英内毛细管2的长度为15cm；石英内毛细管2的b端外径与石英外毛细管1的b端内径差值为100
µ
m；石英内毛细管2的尖端相对于石英外毛细管1尖端的间距为20
µ
m。
51.石英外毛细管1的b端通过fep转接套管3、标准1/16
’’
peek接头4与peek三通5的其中一个出口进行连接；石英内毛细管2的b端穿过peek三通5的内腔从peek三通5的另一个出口露出，出口处利用fep转接套管3和标准1/16
’’
的peek接头4将石英内毛细管2固定，石英内毛细管2的尖端位于石英外毛细管1的内部并靠近尖端一侧。
52.peek三通5的第三个出口通过传输管6与注射泵相连；露出的石英内毛细管2的b端与二极管阵列检测器的流通池入口连接（流通池为200nl微量流通池），而流通池出口与真空腔相连，真空腔再与数控隔膜泵相连；注射泵向石英外毛细管1泵入萃取溶液，萃取溶液流入尖端再由与真空腔连接的数控隔膜泵产生的真空吸入石英内毛细管2。
实施例2
53.一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其结构示意如图1所示，包括石英外毛细管1和石英内毛细管2，石英内毛细管2同轴套于石英外毛细管1的内部；石英内毛细管2的外径小于石英外毛细管1的内径；
54.石英外毛细管1、石英内毛细管2均由外径较小的尖端延伸到外径较大的b端；石英外毛细管1的尖端外径为200
µ
m，石英内毛细管2的尖端外径为30
µ
m；石英外毛细管1的长度为3cm，石英内毛细管2的长度为15cm；石英内毛细管2的b端外径与石英外毛细管1的b端内径差值为100
µ
m；石英内毛细管2的尖端相对于石英外毛细管1尖端的间距为20
µ
m。
55.石英外毛细管1的b端通过fep转接套管3、标准1/16
’’
peek接头4与peek三通5的其中一个出口进行连接；石英内毛细管2的b端穿过peek三通5的内腔从peek三通5的另一个出口露出，出口处利用fep转接套管3和标准1/16
’’
的peek接头4将石英内毛细管2固定，石英内毛细管2的尖端位于石英外毛细管1的内部并靠近尖端一侧。
56.peek三通5的第三个出口通过传输管6与注射泵相连；露出的石英内毛细管2的b端与电喷雾电离源-离子阱-飞行时间质谱的离子源入口直接相连；注射泵向石英外毛细管1泵入萃取溶液，萃取溶液流入尖端再由质谱离子源喷雾形成的真空吸入石英内毛细管2。
实施例3
57.一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其结构示意如图1所示，包括石英外毛细管1和石英内毛细管2，石英内毛细管2同轴套于石英外毛细管1的内部；石英内毛细管2的外径小于石英外毛细管1的内径；
58.石英外毛细管1、石英内毛细管2均由外径较小的尖端延伸到外径较大的b端；石英外毛细管1的尖端外径为30
µ
m，石英内毛细管2的尖端外径为10
µ
m；石英外毛细管1的长度为3cm，石英内毛细管2的长度为15cm；石英内毛细管2的b端外径与石英外毛细管1的b端内径差值为100
µ
m；石英内毛细管2的尖端相对于石英外毛细管1尖端的间距为5
µ
m。
59.石英外毛细管1的b端通过fep转接套管3、标准1/16
’’
peek接头4与peek三通5的其
中一个出口进行连接；石英内毛细管2的b端穿过peek三通5的内腔从peek三通5的另一个出口露出，出口处利用fep转接套管3和标准1/16
’’
的peek接头4将石英内毛细管2固定，石英内毛细管2的尖端位于石英外毛细管1的内部并靠近尖端一侧。
60.peek三通5的第三个出口通过传输管6与注射泵相连；露出的石英内毛细管2的b端与电喷雾电离源-离子阱-飞行时间质谱的离子源入口直接相连；注射泵向石英外毛细管1泵入萃取溶液，萃取溶液流入尖端再由质谱离子源喷雾形成的真空吸入石英内毛细管2。
61.总的来说，本实用新型针对目前空间分辨率最高的单探针存在的探针内扩散严重以及液节点不稳定的问题，对传统的稳定性更好的液流探针进行改进与创新。提供了一种针对原位质谱的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，包括将直径不同的两根熔融石英毛细管的一端拉至成10-200μm直径的尖端，然后利用三通将两根毛细管组合成同轴套管，并调节石英内毛细管2和石英外毛细管1的尖端距离在0-50
µ
m之间，从而得到尖端直径在10-200μm的微型同轴套管探针。从三通的一个出口向外毛细管泵液，并通过与石英内毛细管2连接的真空泵或质谱离子源产生的负压使探针针尖形成稳定的液节点，来对样品表面进行空间分辨的原位萃取采样与在线质谱检测。这种新的探针相比于传统的原位液体萃取套管探针来说能将空间分辨率提高十倍以上，而相比于近年来新出现的高空间分辨率的单探针来说具有更高的稳定性和更低的萃取分析物的扩散。此探针可应用于高空间分辨率的单细胞分析以及组织质谱成像分析等。

技术特征：
1.一种高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，包括石英外毛细管（1）和石英内毛细管（2），所述石英内毛细管（2）同轴套于所述石英外毛细管（1）的内部；所述石英内毛细管（2）的外径小于石英外毛细管（1）的内径；所述石英外毛细管（1）、石英内毛细管（2）均由外径较小的尖端延伸到外径较大的b端；所述石英外毛细管（1）的尖端外径为10-200
µ
m，所述石英内毛细管（2）的尖端外径为2-30
µ
m；所述石英外毛细管（1）的b端与三通（5）的其中一个出口进行连接；所述石英内毛细管（2）的b端穿过所述三通（5）的内腔从三通（5）的另一个出口露出，所述石英内毛细管（2）的尖端位于所述石英外毛细管（1）的内部并靠近尖端一侧。2.根据权利要求1所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述石英外毛细管（1）的长度为3-5cm，所述石英内毛细管（2）的长度为10-20cm。3.根据权利要求1所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述石英内毛细管（2）b端的外径与石英外毛细管（1）b端的内径差值为50-100
µ
m。4.根据权利要求1所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述石英内毛细管（2）的尖端相对于所述石英外毛细管（1）尖端的间距为0-50
µ
m。5.根据权利要求1所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述石英外毛细管（1）的b端通过转接套管（3）和接头（4）与三通（5）的其中一个出口进行连接。6.根据权利要求5所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述石英内毛细管（2）与三通（5）的另一个出口处利用转接套管（3）和接头（4）将所述石英内毛细管（2）固定。7.根据权利要求6所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述三通（5）为peek三通，所述转接套管（3）为fep转接套管，所述接头（4）为标准1/16
’’
的peek接头。8.根据权利要求1-7中任一项所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述三通（5）的第三个出口通过传输管（6）与注射泵相连；露出的石英内毛细管（2）b端与质谱离子源入口或真空腔连接。9.根据权利要求8所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，所述真空腔再与真空泵相连。10.根据权利要求9所述的高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，其特征在于，与所述三通（5）第三个出口连接的注射泵向所述石英外毛细管（1）泵入萃取溶液，萃取溶液流入尖端再由所述质谱离子源喷雾形成的真空或所述真空腔连接的真空泵产生的真空吸入所述石英内毛细管（2）。

技术总结
本实用新型公开了一种高空间分辨率高稳定性的原位液体萃取采样探针，石英内毛细管同轴套于石英外毛细管的内部；石英外毛细管、石英内毛细管均由外径较小的尖端延伸到外径较大的B端；石英外毛细管的尖端外径为10-200


技术研发人员：吴倩 赵志皓
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2022.10.20
技术公布日：2023/7/14