一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌及应用的制作方法

1.本发明涉及羔羊养殖和益生菌筛选技术领域，更具体地说是涉及一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌及应用。


背景技术：

2.羔羊生长发育过程受多种因素的制约，临床生产中为增加其生长性能，增进其抗病力，抗生素作为作为养殖中首选。然而抗生素虽可以提高羊只生长发育性能，但极易紊乱羊只肠道菌群，使其机体产生耐药性，导致羊只发病率和死亡率相对提高。
3.在临床生产中，抗生素作为饲料添加剂在我国已被禁止。因此，为了提高动物生长性能及其保障其相关动物产品的食用安全，抗生素相关替代品的研发备受关注。
4.益生菌作为一类可通过改善动物肠道菌群、调节机体免疫系统而对健康产生有益作用的非病原微生物，其可粘附于动物肠道，分泌抗菌活性物质及维持肠道稳态。其大多数为人和动物机体不可或缺的成分。此外，还可增加机体免疫能力增加其抗病性，降低天气等情况带来的应激。同时，还可产生多种短链脂肪酸促进代谢增加其生长发育。
5.因此，如何提供一种对羔羊生长发育具有促进作用、提高其抗病力的复合益生菌是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌，包括双岐杆菌(bifidobacterium sp.)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)和罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)；
9.其中，双岐杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24771，分类命名为双岐杆菌bifidobacterium sp.；
10.所述嗜酸乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24772，分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus；
11.罗伊氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24773，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌在促进羔羊生长发育、提高其抗病能力中的应用。
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明复合益生菌具有以下优点和效果：首先是罗伊氏乳酸菌可产生罗伊氏菌素等抑菌物质，粘附于肠道形成细菌膜，可防止
肠道病原微生物对肠道的损伤，防止腹泻的发生。嗜酸乳杆菌、双歧杆菌可分泌抑菌物质、促进胃肠道蠕动，增加其采食量。改善了肠道微环境，对其生长发育具有促进作用。其次，益生菌定殖于肠道后，促进il-10、tgf-β的分泌调整机体免疫系统，增加其抗病力，使其免疫力提高。最后，还可避免抗生素等使用引起机体耐药性，改善肠道菌群，增加拟杆菌门等有益菌门增殖。该复合益生菌添加配方可为益生菌添加于饲料中提供新的方法和思路。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为相关益生菌的核酸凝胶电泳结果；
16.图2附图为相关致病菌的核酸凝胶电泳结果；
17.图3附图为复合益生菌培养上清抑菌效果；
18.图4附图为复合益生菌饲喂后羔羊体重变化；
19.图5附图为复合益生菌饲喂后羔羊腹泻率变化；
20.图6附图为复合益生菌饲喂后血液ifn-γ、il-10、tgf-β的相对表达量；
21.图7附图为复合益生菌饲喂组il-10、tgf-β的相对表达量。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
24.菌株来源：嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、双歧杆菌分离于健康羊只粪便中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌由本实验室保存。
25.双岐杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24771，分类命名为双岐杆菌bifidobacterium sp.；
26.所述嗜酸乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24772，分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus；
27.罗伊氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24773，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri。
28.试验材料：mrs培养基购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；细菌基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；tryptone、yeast extract购自thermofisher；
琼脂购自biofrox、nacl购自萍乡市白狮化学试剂有限公司。
29.引物序列表如表1所示，pcr反应体系如表2所示；
30.表1pcr引物序列
[0031][0032]
表2pcr反应体系
[0033]
成分体系(μl)2
×
taqpcrmastermix12.5上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1模板1ddh2o9.5
[0034]
实施例1益生菌的复苏鉴定
[0035]
于-20℃冰箱中取出冻存于甘油中的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌室温解冻后按1:50接于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h待底部有白色沉淀后取出。使用移液器吹打均匀后利用dna提取试剂盒提取其dna，以提取的细菌dna为模板，使用细菌特异性引物进行基因扩增，于pcr仪进行目的片段的克隆，pcr反应条件如表3所示，将pcr产物进行1％琼脂凝胶电泳检测，符合预期结果证明为该菌(图1)。结果显示复苏菌株为罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双岐杆菌。
[0036]
表3pcr反应条件
[0037]
[0038]
实施例2复合益生菌配比
[0039]
将上述复苏鉴定后的菌株按1:100接种到相应液体培养基中37℃厌氧培养扩增，按罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：双歧杆菌按5:3:2的比例混合后制成复合益生菌悬浊液。
[0040]
实施例3复合益生菌培养上清的抑菌效果
[0041]
复苏保存于本实验室中的致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、腊样芽孢杆菌接种于lb琼脂培养基上并利用dna提取试剂盒提取菌落提取细菌dna，使用三种不同细菌的特异性引物进行基因扩增，于pcr仪进行目的片段的克隆，pcr反应条件如表4所示，将pcr产物进行1％琼脂凝胶电泳检测，结果显示金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌分别于227bp、468bp和91bp处有特异性条带(图2)。
[0042]
表4pcr反应条件
[0043][0044][0045]
将复苏鉴定的三种益生菌37℃条件下液体培养基厌氧培养32～48h后按比例混合后，5000r/min离心20min后，取上清液，用0.22μm滤膜过滤备用。复苏鉴定的致病菌置于液体lb中培养48h后，取100μl加到5ml的无菌lb液体培养基中。同时实验组加入2ml的乳酸菌培养上清，对照组加入2ml的mrs培养基。置于37℃条件下培养48h后，取1ml菌液12000rpm离心10min后弃掉上清加入1mlpbs缓冲液使用移液枪吹打均匀后置于分光光度计下利用od
600
测定其od值。结果显示，培养后混合益生菌上清对常见致病菌具有抑制作用(图3)。
[0046]
实施例4复合益生菌饲料对羔羊生长发育促进作用
[0047]
选取生长状况、健康状况相似的同群2月龄以下羔羊分为实验组与对照组，其中实验组40只，对照组113只。实验组连续28天每只补饲30ml复合益生菌菌液，浓度为10
11
cfu/ml，其他条件与对照组相同。观察期腹泻情况及每周对其体重进行测量。并采取其粪便测其菌群变化。结果显示，每天饲喂复合菌其体重增加快(图4)，全群腹泻率比对照组低(图5)。因此，该复合菌可增加羔羊生长性能，降低腹泻发病率。
[0048]
实施例5饲喂复合益生菌可调节羔羊血液免疫因子
[0049]
为评价复合益生菌饲喂后对羔羊免疫能力调节作用。将实施例4中复合益生菌饲喂组羔羊饲喂前、饲喂28天后分别采集羔羊血液。提取rna并利用试剂盒反转为cdna进行相关免疫因子荧光定量检测。结果显示，复合益生菌饲喂后血液ifn-γ、il-10、tgf-β的相对表达量都高于饲喂前(图6)。因此可以说明，复合益生菌饲喂可调节羔羊血液免疫因子水平并增强其免疫能力。
[0050]
实施例6复合益生菌比单菌饲喂调节羔羊免疫能力更突出
[0051]
为评价复合益生菌与单菌之间的差异，选取生长状况、健康状况相似的同群2月龄以下羔羊25只，分为罗伊氏乳杆菌饲喂组、嗜酸乳杆菌饲喂组、双歧杆菌饲喂组、复合益生
菌饲喂组及空白对照组，每组5只。益生菌组连续饲喂28天30ml菌液，浓度为10
11
cfu/ml，空白对照组不处理，其他饲喂条件相同。28天后采集羔羊血液提取rna并利用试剂盒反转为cdna进行相关免疫因子荧光定量检测。结果显示，复合益生菌饲喂组il-10、tgf-β的相对表达量都高于单个菌株饲喂后(图7)。因此可以说明，单菌株能够调节羔羊免疫能力，但复合益生菌比单个菌株饲喂对羔羊免疫调节能力更突出，对其生长发育更具有优势。
[0052]
实施例7体外模拟胃肠道环境均具有较高成活率
[0053]
为了筛选更具耐受胃肠道环境的乳酸菌，对已分离鉴定菌株进行模拟胃肠道环境耐受检测。筛选出具有耐酸(ph＝2.5～3.0)、耐胃蛋白酶(3mg/ml)、耐胆盐(ph＝8.0,1mg/ml)和耐胰蛋白酶(ph＝8.0,0.3％)的菌株；结果显示，该复合菌配方中单个菌均具有较强的耐受酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐特性，其存活率高于65％。因此，该配方中各个菌株相对于同种属的菌株更具有优势(表5)。
[0054]
表5
[0055][0056]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0057]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌，其特征在于，包括双岐杆菌(bifidobacteriumsp.)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)和罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)；且体积比为：2:3:5；其中，双岐杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.24771，分类命名为双歧杆菌bifidobacteriumsp.；所述嗜酸乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.24772，分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus；罗伊氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年04月26日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.24773，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri。2.根据权利要求1所述的一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌在促进羔羊生长发育、提高其抗病能力中的应用。

技术总结
本发明公开了一种对羔羊生长发育具有促进作用的复合益生菌，包括双岐杆菌(Bifidobacteriumsp.)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；且体积比为：2:3:5；均于2022年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该复合益生菌可以显著提高羔羊的抗病能力，促进其生长发育。促进其生长发育。促进其生长发育。


技术研发人员：马文涛 姜悦才 赵玄多 李登亮 马梦真 陈一鸣
受保护的技术使用者：陕西博德越生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/18