一种适用于甜瓜CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体及其应用

一种适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑的载体及其应用。


背景技术：

2.基因编辑技术已经在多种植物中应用成功，但在甜瓜中的研究还处于初级阶段。目前，关于甜瓜中成功使用基因编辑技术的报道并不多，且其要么存在编辑效率低的问题，要么存在操作较为复杂的问题。因此，开发更多的可适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体对于不断完善优化甜瓜crispr/cas9基因编辑系统具有重要的意义。
3.pyl_cas9系列载体是华南农业大学刘耀光教授开发的用于植物基因编辑的骨架，其cas9氨基酸序列由水稻密码子优化，启动cas9基因的启动子分为用于单子叶体系的osubi，和用于双子叶体系的camv 35s。pyl_cas9系列载体的cas9序列前后各包含1个核定位信号，更易于转化和获得基因编辑苗，在提高植物基因编辑效率方面具有重要的前景，并且已有研究证明其在水稻、玉米、拟南芥、油菜和苜蓿等植物中的编辑效率极高，普遍在50％以上。因此，我们在甜瓜中首次尝试使用pyl_cas935s_b骨架搭配atu6-26与atu6-1启动子启动cmpds基因的2个sgrna，但是转化厚皮甜瓜“都蜜5号”材料并没有获得基因编辑苗。
4.因此，如何对pyl_cas9系列载体进行改造，使其适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统，对于不断完善优化甜瓜crispr/cas9基因编辑系统具有重要意义。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的之一在于提供一种适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体，所述载体为pmel-c02载体，其是在pyl_cas9pubi_b载体的基础上将启动子修改为“patubq10+sv40nls”，“cas9+sv40nls+nos(t)”元件替换为“atcas9+sv40nls+hsp(t)”，之后在asc酶切位点处按顺序加入patu6-26启动子、2x的bsai酶切位点、grna-sc和atu6-1(t)终止子改造得到；其中，“atcas9+sv40nls+hsp(t)”来自于pmod_a0501载体，patubq10+sv40nls的序列如seq id no:1所示。
6.本发明通过将pyl_cas9pubi_b载体中的启动子修改为“patubq10+sv40nls”，“cas9+sv40nls+nos(t)”元件替换为pmod_a0501载体上的“atcas9+sv40nls+hsp(t)”，之后在asc酶切位点处按顺序加入patu6-26启动子、2x的bsai酶切位点、grna-sc和atu6-1(t)终止子，使其能够适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑，且当其不添加可视化元件时，在甜瓜中的编辑效率可达到3.23％，添加可视化元件后，其编辑效率可达到2.08％，该研究对于完善优化pyl_cas9pubi_b载体在甜瓜中的应用并为进一步提高甜瓜的基因编辑效率奠定了基础。
7.作为一种优选的实施方式，所述载体还包括可视化元件。
8.作为一种优选的实施方式，所述可视化元件添加在pmel-c02载体的pme酶切位点
处。
9.作为一种优选的实施方式，所述可视化元件包括pcamv35s启动子、atcor47-5’utr、eygfpuv、hsp-3’utr和hsp(t)终止子。
10.包含的可视化荧光元件在指示甜瓜基因编辑材料上更具优势，亮度更强，即使在完全黑暗的条件下也能用荧光手电筒观察到强荧光，该改造后的高效基因编辑工具能够有效的促进甜瓜的基因功能研究。
11.本发明的目的还在于提供上述载体在甜瓜crispr/cas9基因编辑系统中的应用。
12.作为一种优选的实施方式，所述应用包括以下步骤：
13.当插入单靶点sgrna时，设计sgrna序列的接头引物分别为t1-f：attgnnnnn......nn，t1-r：aaacnnnnn......nn，将接头引物t1-f和t1-r混合，变性并退火连接获得sgrna表达盒；
14.当插入双靶点sgrna时，设计两个sgrna序列的接头引物分为sgrna1-f：nnnnnnggtctcnattgnnnn......nngtt，sgrna1-f0：tgnnnn......nngttttagagctagaaatagc，sgrna2-r0：aacnnnn......nncaatcactacttcgtctctaa，sgrna2-r：nnnnnnggtctcnaaacnnnn......nnncaa，以pylsgrna-atu6-1载体为模板进行上述四引物扩增，获得sgrna表达盒；
15.将获得的sgrna表达盒连接到上述载体上，转化大肠杆菌感受态筛选并测序验证获得阳性克隆；
16.提取阳性克隆中的质粒转化农杆菌agl1后进行遗传转化；
17.其中“n”代表sgrna的序列且当sgrna第一位碱基是g时，进行移除，“n”代表任意碱基。
18.作为一种优选的实施方式，当插入双靶点sgrna时，扩增获得sgrna表达盒的体系为：
19.成分体积/μl5
×
sf buffer25dntp1sgrna1-f5sgrna1-f01sgrna2-r01sgrna2-r5phanta tmsf dna polymerase1ddh2o11total50
20.程序为：95，3min；95，10s，58～65，30s，72，15～30s/kb，35个循环；72，10min；20，5min。
21.作为一种优选的实施方式，该应用包括以下步骤：
22.根据甜瓜cmpds基因序列，选定其sgrna1：gtagtgagattgtgggcgatggg，sgrna2：tatcatctatctgtggtctaggg；
23.合成含有bsa酶切位点的引物t1cmpds-f:gtatccggtctcgattgtagtgagattgtgggcgatgtt，
24.t1cmpds-f0:tgtagtgagattgtgggcgatgttttagagctagaaatagc，
25.t2cmpds-r0:aactagaccacagatagatgatacaatcactacttcgtctctaa，
26.t2cmpds-r:tagattggtctcgaaactagaccacagatagatgatacaa；
27.在前述的载体上构建双靶点敲除载体，并转化到农杆菌agl1中；
28.将含有敲除载体的农杆菌侵染甜瓜外植体，培养即得cmpds基因定向编辑的植株。
附图说明
29.图1改造后的载体结构图，其中a为现有技术中使用的中间载体元件，b为本发明改造后的pmel-c02载体结构，c为本发明改造后的pmel-c03载体的可视化元件结构；
30.图2为实施例3中甜瓜基因编辑表型与测序结果，其中a为pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds载体获得的基因编辑白化苗，b为pmel-c03-cmpds载体的白化表型与荧光表型，c为cmpds基因双靶点位置的序列与突变类型。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
32.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
33.本发明是对现有的植物基因编辑载体pyl_cas9pubi_b进行改造，首先在ecor和dra酶切位点之间添加patubq10+sv40nls序列，其中patubq10+sv40nls序列如seq id no:1所示，之后利用酶切和同源重组的方式替换pyl_cas9pubi_b载体的cas、核定位信号和终止子，在其dra和maub位点之间加入atcas9+sv40nls+hsp(t)序列获得载体pmel-c01，以载体pkse401质粒为模板，扩增获得patu6-26+2xbsa+grna-sc+atu6-1(t)模块，并将其连接到pmel-c01的asc位点获得pmel-c02载体。进一步还可利用pmel-c02骨架在其pme酶切位点之间添加可视化元件pcamv35s启动子、atcor47-5’utr、eygfpuv、hsp-3’utr和hsp(t)终止子，获得可视化载体pmel-c03。
34.实施例1
35.本发明实施例提供了一种适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体的构建方法，具体步骤如下：
36.(1)对目的载体pyl_cas9pubi_b的改造
37.a、对目的载体pyl_cas9pubi_b的启动子进行改造
38.在原始载体pyl_cas9pubi_b(a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants,ma xingliang et al.molecular plant,2015(8)8:1274-1284)的ecori和draiii酶切位点之间合成patubq10+sv40nls序列，其中patubq10+sv40nls的序列信息如seq id no:1所示，改造后的载体命名为pyl_cas9atubq10_b。
39.patubq10+sv40nls序列：agtctagctcaacagagcttttaacccaaattggtacaatagaa tacaactttagatcataattctcaaaagaaagagattccttagctattctatctgccactccatttccttctcggctt
gtatgcacaagcataaaatcctcaaacttgctaagtagatactttatgtcttggataattggattgagacttgacaagcataactttcatgtaaccaaagacacaagttgctgagaatccacctcaaaaatgatcttcctataattgaatcgggataatgacagcacagcccatctaagagcctccacttctacttccagcacgcttcttacttttaccacagctcttgcacctaaccataacaccttccctgtatgatcgcgaagcacccaccctaagccacattttaatccttctgttggccatgccccatcaaagttgcacttaacccaagattgtggtggagcttcccatgtttctcgtctgtcccgacggtgttgtggttggtgctttccttacattctgagcctctttccttctaatccactcatctgcatcttcttgtgtccttactaatacctcattggttccaaattccctccctttaagcaccagctcgtttctgttcttccacagcctcccaagtatccaagggactaaagcctccacattcttcagatcaggatattcttgtttaagatgttgaactctatggaggtttgtatgaactgatgatctaggaccggataagttcccttcttcatagcgaacttattcaaagaatgttttgtgtatcattcttgttacattgttattaatgaaaaaatattattggtcattggactgaacacgagtgttaaatatggaccaggccccaaataagatccattgatatatgaattaaataacaagaataaatcgagtcaccaaaccacttgccttttttaacgagacttgttcaccaacttgatacaaaagtcattatcctatgcaaatcaataatcatacaaaaatatccaataacactaaaaaattaaaagaaatggataatttcacaatatgttatacgataaagaagttacttttccaagaaattcactgattttataagcccacttgcattagataaatggcaaaaaaaaacaaaaaggaaaagaaataaagcacgaagaattctagaaaatacgaaatacgcttcaatgcagtgggacccacggttcaattattgccaattttcagctccaccgtatatttaaaaaataaaacgataatgctaaaaaaatataaatcgtaacgatcgttaaatctcaacggctggatcttatgacgaccgttagaaattgtggttgtcgacgagtcagtaataaacggcgtcaaagtggttgcagccggcacacacgagtcgtgtttatcaactcaaagcacaaatacttttcctcaacctaaaaataaggcaattagccaaaaacaactttgcgtgtaaacaacgctcaatacacgtgtcattttattattagctattgcttcaccgccttagctttctcgtgacctagtcgtcctcgtcttttcttcttcttcttctataaaacaatacccaaagagctcttcttcttcacaattcagatttcaatttctcaaaatcttaaaaactttctctcaattctctctaccgtgatcaaggtaaatttctgtgttccttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatgttctttggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgttagatatcatcttaattctcgattagggtttcatagatatcatccgatttgttcaaataatttgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagatctggtgttagtttctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacagcctaagaagaagcggaaggttggtatt(seq id no:1所示)。
40.b、连接atcas9+sv40nls+hsp(t)模块
41.利用draiii(购自neb)和maubi(购自thermo)对载体pyl_cas9atubq10_b进行双酶切。其中，酶切体系为：draiii-hf 1μl，rcutsmart buffer 2μl，pyl_cas9atubq10_b质粒1μg，补ddh2o至50μl，37反应30min后加入maubi 1μl，10x fastdigest buffer 2μl，37反应30min后回收目标片段。
42.以pmod_a501(购自addgene)质粒dna为模板，使用321l/r引物进行pcr扩增atcas9+sv40nls+hsp(t)，回收pcr产物。其中，反应体系为：5
×
sf buffer(诺维赞，南京)5μl，phantatm sf dna polymerase(诺维赞，南京)0.5μl，dntp 0.5μl，左右引物各0.5μl，dna模板2μl，ddh2o 11μl，pcr扩增程序为：95，3min；95，10sec，58，30sec，72，1min 30sec，35个循环；72，10min；20，5min。扩增的引物序列如下：
43.321l:cggaaggttggtattcacggggtgatggataagaagtactctat(seq id no:2)；
44.321r:taacatagatgacaccgcgcgcgcttatctttaatcatattcc(seq id no:3)；
45.将以上步骤回收的质粒目标片段和pcr产物通过同源重组的方式连接，连接体系
为：5x ce ii buffer 2μl，exnase ii 1μl，draiii-hf与maubi酶切后的pyl_cas9pubi_b载体(50ng)1μl，回收的atcas9+sv40nls+hsp(t)元件(15ng)1μl，ddh2o 5μl。37反应30min后取5μl转化大肠杆菌，保存测序验证正确的单克隆备用，该中间载体命名为pmel-c01。
46.c、连接patu6-26+2x bsai+grna-sc+atu6-1(t)模块
47.以载体pkse401(购自addgene)质粒dna为模板，通过322f/r引物pcr扩增patu6-26+2x bsai模块，通过323f/r引物pcr扩增2x bsai+grna-sc+atu6-1(t)模块。两次扩增体系和pcr扩增程序相同，其中扩增体系为：5
×
sf buffer(诺维赞，南京)5μl，phantatm sf dna polymerase(诺维赞，南京)0.5μl，dntp 0.5μl，左右引物各0.5μl，dna模板2μl，ddh2o 11μl。pcr扩增程序为：95，3min；95，10sec，58，30sec，72，30sec，35个循环；72，10min；20，5min。扩增引物为：
48.322f:cgggagcaccggtaaggcgcgccgaatgattaggcatcgaacc(seq id no:4)；
49.322r:ctgagaccctctctcggtctcccaatcactacttc(seq id no:5)；
50.323f:gagagagggtctcagttttagagctagaaatagca(seq id no:6)；
51.323r:gccgctagctcgagaggcgcgcctattggtttatctcatcgga(seq id no:7)；
52.以上述两个模块的回收产物为模板，以322f和323r引物进行重叠pcr，扩增完整的patu6-26+2x bsai+grna-sc+atu6-1(t)模块，切胶回收目的片段。其中，重叠pcr的反应体系为：5
×
sf buffer 5μl，phanta
tm sf dna polymerase 0.5μl，dntp 0.5μl，322f和323r引物各0.5μl，322f/r回收产物1μl，323f/r回收产物1μl，ddh2o 11μl，pcr扩增程序为：95，3min；95，10sec，58，30sec，72，1min，35个循环；72，10min；20，5min。
53.利用asci对pmel-c01载体进行单酶切，回收目标片段。通过同源重组的方式将回收的目标片段和上一步获得的patu6-26+2x bsai+grna-sc+atu6-1(t)模块连接，转化大肠杆菌dh10b，保存测序验证正确的克隆，改造后的目的载体命名为pmel-c02。改造后的载体如图1b所示。
54.其中，酶切的反应体系为：asci(neb)1μl，rcutsmart buffer 2μl，pmel-c01质粒1μg，补ddh2o至50μl，37反应30min后回收目标片段。同源重组的体系为：5x ce ii buffer 2μl，exnase ii 1μl，asci酶切后的pmel-c01载体(50ng)1μl，回收的patu6-26+2x bsai+grna-sc+atu6-1(t)模块(15ng)1μl，ddh2o 5μl。条件为：37反应30min。
55.(2)对改造后的pmel-c02载体增加可视化元件
56.人工合成可视化元件的所有片段pcamv35s+atcor47-5’utr+eygfpuv+hsp-3’utr+hsp(t)到pmel-c02骨架的pmei酶切位点上，其中，合成的片段序列如seq id no:8所示，改造后的目的载体命名为pmel-c03，改造后的载体如图1c所示。
57.seq id no:8：cgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgg
aaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctcgagctttcgcgagctcggtacccaaacattactcattcacaaaaccatcttaaagcaactacacaagtcttgaaattttctcatattttctatttactatataaacttttaatcaaatcaagattaaagatgacaaccttcaaaatcgagtcccggatccacggcaacctcaacggggagaagttcgagttggttggaggtggagtaggtgaggagggtcgcctcgagattgagatgaagactaaagataaaccactggcattctctcccttcctgctgaccacttgcatgggttacgggttctaccacttcgccagcttcccaaaggggattaagaacatctatcttcatgctgcaacgaacggaggttacaccaacaccaggaaggagatctatgaagacggcggcatcttggaggtcaacttccgttacacttacgagttcaacaagatcatcggtgacgtcgagtgcattggacatggattcccaagtcagagtccgatcttcaaggacacgatcgtgaagagttgtcccacggtggacctgatgttgccaatgtccgggaacatcatcgccagctcctacgcttacgccttccaactgaaggacggctctttctacacggcagaagtcaagaacaacatagacttcaagaatccaatccacgagtccttctcgaagtcagggcccatgttcacccacagacgtgtcgaggagactctcaccaaggagaaccttgccatagtggagtaccagcaggttttcaacagcgccccaagagacatgtagatatgaagatgaagatgaaatatttggtgtgtcaaataaaaagcttgtgtgcttaagtttgtgtttttttcttggcttgttgtgttatgaatttgtggctttttctaatattaaatgaatgtaagatctcattataatgaataaacaaatgtttctataatccattgtgaatgttttgttggatctcttctgcagcatataactactgtatgtgctatggtatggactatggaatatgattaaagataagatgggctcatagagtaaaacgaggcgagggacctataaacctcccttcatcatgctatttcatgatctattttataaaataaagatgtagaaaaaagtaagcgtaataaccgcaaaacaaatgatttaaaacatggcacataatgaggagattaagttcggtttacgtttattttagtactaattgtaacgtgagactacgtatcgggaatcgcctaattaaagcattaatgcgaacctgattagattcaccgaccctcctatcgtgtcgacctttctgtttcttagaattttttggtagtctatgtactaataatgtcagcttcgtatttatttcataagcaatttgcatttgcaatttgttttttacttttatttttattgtattgtggaatgtggactcgtaccaacatgaagttatataccaccaaaaaaattacagttagtcaaaagattcacgagtgagagctacttatgattgtcttttacgtatatgtctaattgtctatttgctcaataatctttgtactttcttttgtcgttgataaaatcacaaagttccaaaagtaatcgaatgatttgcttttaagaaaagaagagctcaataattcaacatatatctgtacaca。
58.实施例2
59.本实施例提供一种实施例1中所述的适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体的应用方法，具体如下：
60.(1)连接sgrna序列的引物设计
61.插入单靶点sgrna时，按以下序列顺序设计连接sgrna序列的引物，其中“n”代表任意碱基，连接的20个“n”代表sgrna序列。其中t1-f中插入sgrna的正向序列，t1-r中插入sgrna的方向互补序列，如果sgrna第一位碱基是g需要移除，即插入19位sgrna序列即可。
62.t1-f:attgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；
63.t1-r:aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn。
64.插入双靶点sgrna时，按以下序列顺序设计连接sgrna序列的引物，其中“n”代表任意碱基，连接的20个“n”代表sgrna序列。其中t1'-f和t1-f0中插入第1个sgrna的正向序列，t2-r0和t2-r中插入第2个sgrna的反向互补序列，如果sgrna第一位碱基是g需要移除，即插入19位sgrna序列即可。
65.t1'-f:nnnnnnggtctcnattgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngtt；
66.t1-f0:tgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttttagagctagaaatagc；
67.t2-r0:aacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaatcactacttcgtctctaa；
68.t2-r:nnnnnnggtctcnaaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaa。
69.(2)sgrna表达盒的获得
70.单靶点双链sgrna表达盒的制备：将接头引物t1-f和t1-r用te缓冲液溶解成10μm母液，各取10μl加入混合。约90 30s，移至室温冷却完成退火。
71.双靶点sgrna表达盒的扩增：以5～10ng/μl的中间载体pylsgrna-atu6-1(ampicillin抗性，购自addgene)为模板进行四引物pcr扩增。-f/-r为正常引物浓度；-f0/-r0稀释10倍，选用高保真酶进行扩增，pcr扩增体系如下表1所示：
72.表1pcr扩增体系
73.成分体积(μl)5
×
sf buffer(诺维赞，南京)25dntp1t1'-f5t1-f01t2-r01t2-r5phanta tm
sf dna polymerase(诺维赞，南京)1ddh2o11total50
74.pcr扩增程序如下：95，3min；95，10sec，58～65，30sec，72，15～30sec/kb，35个循环；72，10min；20，5min。产物大小约为490bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用promega pcr产物回收试剂盒进行产物纯化回收。
75.(3)连接sgrna表达盒到目的载体pmel-c02或pmel-c03上
76.将sgrna表达盒连接到目的载体pmel-c02或pmel-c03上，其中，酶切连接体系如下表2所示，pcr反应条件如下表3所示：
77.表2酶切-连接体系
78.成分体积(μl)sgrna表达盒(20-50ng)2目的载体质粒(100ng)110x t4 dna ligase buffer(neb)1.510x cutsmart buffer(neb)1.5bsai-hfv2(10u/μl,neb)1t4 dna ligase(100u/μl,neb)0.5ddh2o7.5total15
79.表3pcr反应条件
[0080][0081]
取以上连接产物5μl转化大肠杆菌感受态，卡那霉素(50mg/l)平板筛选。u6-26-f和324r引物进行菌落pcr鉴定和测序。单靶点产物为374bp，双靶点产物为841bp。其中：
[0082]
u6-26-f：ctgaaagaagagaagcaggc(seq id no:9)；
[0083]
324r：cctctttctccgcacccgac(seq id no:10)。
[0084]
(4)基因编辑载体转化农杆菌
[0085]
提取构建好的基因编辑载体质粒，取2μl质粒转化农杆菌感受态agl-1。使用含有kana(50mg/l)和rif(12.5mg/l)的平板筛选。u6-26-f和324r引物进行菌落pcr鉴定。保存阳性农杆菌克隆用于之后的甜瓜遗传转化实验。
[0086]
实施例3
[0087]
本实施例提供一种甜瓜crispr/cas9基因编辑方法，具体步骤如下：
[0088]
(1)cmpds基因靶位点的选择
[0089]
根据甜瓜cmpds(melo3c017772.2)基因序列，找到其cds区并分析结构，查找潜在的cas9靶位点，并根据所需靶位点的位置和gc含量设计sgrna。最终选定的sgrna1和grna2的序列分别是：
[0090]
sgrna1：gtagtgagattgtgggcgatggg(seq id no:11)；
[0091]
sgrna2：tatcatctatctgtggtctaggg(seq id no:12)。
[0092]
(2)靶标cmpds基因编辑载体的构建
[0093]
根据选择的sgrna模板序列，合成含有bsa酶切位点的dna引物：
[0094][0095]
t1cmpds-f:tatccggtctcgattgtagtgagattgtgggcgatgtt(seq id no:13)；
[0096]
t1cmpds-f0:tgtagtgagattgtgggcgatgttttagagctagaaa tagc(seq id no:14)；
[0097]
t2cmpds-r0:aactagaccacagatagatgatacaatcactacttcg tctctaa(seq id no:15)；
[0098]
t2cmpds-r:tagattggtctcgaaactagaccacagatagatgata caa(seq id no:16)。
[0099]
按照实施例2的方法进行cmpds基因双靶点敲除载体pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds的构建并转化获得含有上述敲除载体的农杆菌。
[0100]
(3)甜瓜的遗传转化
[0101]
发芽处理：将剥壳甜瓜种子(品种：都蜜5号)置于75％酒精中消毒15s，在1％次氯酸钠溶液中消毒15min，之后在无菌水中冲洗3次将种子置于
[0102]
gm培养基(ms+0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤6-ba+1mg/l脱落酸aba+3％蔗糖+0.8％琼脂，ph＝5.85)中，28培养大约24～36小时，待子叶根伸长3毫米左右即可。
[0103]
菌液处理方法：在遗传转化的前2天，接种含有遗传转化载体的农杆菌于3ml含有
50mg/l卡那霉素和12.5mg/l利福平的lb液体培养基中，28 24h，200rpm。取上述培养产物按照1:1000，即50μl加入到50ml液体lb培养基，培养过夜，od
600
为0.6-0.8。离心收集上述菌液，用im培养基(ms+0.5mg/l 6-ba+1mg/l aba+3％蔗糖+0.1mm乙酰丁香酮as，ph＝5.7)重悬使得od
600
为0.2。
[0104]
外植体处理方法：掰开子叶与根连接处，使得u型口出现，用手术刀或纳米刷从末梢到远轴端刷4-5次使外植体表面受伤。将外植体转移到含有20ml农杆菌悬浮液体的100ml容量的三角瓶中。将三角瓶置于超声波仪器kq-100dv，在100w下处理10s。之后使用真空泵加压-0.8*100kpa处理外植体90s。完成上述操作后，将农杆菌悬浮液去除，外植体转移到无菌滤纸上在工作台中吹干表面的农杆菌菌液，再转移到铺上有滤纸的com培养基(ms+0.5mg/l 6-ba+1mg/l aba+3％蔗糖+0.8％琼脂+1.25μm乙磺酸mes(ph 5.2)+0.25μm硫辛酸ala+0.1mm as，ph＝5.7)上，共培养3天。共培养结束后将外植体转移到诱导芽培养基(ms+0.5mg/l 6-ba+1mg/l aba+3％蔗糖+0.9％琼脂+0.2g/l特美汀+2mg/l agno3+4mg/l草铵磷，ph＝5.85)上培养，2-3周继代一次在，直至出芽。出芽后将延长芽切下来置于生根培养基(ms+3％蔗糖+0.9％琼脂+0.2g/l特美汀+2mg/l agno3，ph＝5.85)中。
[0105]
(4)转基因植株获得与统计
[0106]
通过农杆菌遗传转化法分别获得了pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds的再生植株68棵和34棵，两个载体的转基因植株中均有白化表型，其中pmel-c02-cmpds载体产生的5棵白化苗，其中3颗为全白化表型，编辑率为3.23％(编辑苗数/总外植体数)；pmel-c03-cmpds载体产生的3棵全白化苗，编辑率为2.08％(编辑苗数/总外植体数)。
[0107]
(5)pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds编辑系统对cmpds基因的定向编辑
[0108]
转基因植株dna水平鉴定：取经草铵磷筛选的生根植株的少量叶片，提取dna进行pcr检测，阳性对照为质粒dna，阴性对照为未经过遗传转化的野生植株dna。将引物和go taqgreen master mix(2x)(诺维赞，南京)混匀后进行pcr反应，反应体系为10μl，pcr反应条件如下：94，3min；94，30sec，58，30sec，72，30sec，30个循环；72，10min；20，10min，之后通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带641bp。检测的阳性率为：pmel-c02-cmpds为5/68(阳性苗数/再生苗总数)，pmel-c03-cmpds为3/34(阳性苗数/再生苗总数)。引物序列如下：
[0109]
pmel-cas9-344f：taccctcgctaacggtgaga(seq id no:17)；
[0110]
pmel-cas9-344r：gcttgtgctgctcaacgaaa(seq id no:18)。
[0111]
转基因植株的突变型鉴定：以靶位点特异性引物cmpds-341f/r扩增转基因阳性植株中的cmpds基因，目的条带405bp，挖胶回收后连接pm-18t载体，进行ta克隆检测。pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds载体获得的不同白化苗单株的测序结果如图2c所示。克隆用的引物序列如下：
[0112]
cmpds-341f：ctatgtgggtctgtctctgc(seq id no:19)；
[0113]
cmpds-341r：actactttcaatggcttcct(seq id no:20)。
[0114]
pmel-c02-cmpds和pmel-c03-cmpds载体的在所检测的全白化表型的植株中，t1靶位点发生突变的比例为66.7％，t2靶位点的突变比例为100％，2个靶位点的突变类型主要表现为是碱基插入(1～2bp)和缺失(1～30bp)，白化植株表型如图2a所示。含有可视化元件的pmel-c03-cmpds载体转化甜瓜在芽延长培养基上的白化表型和荧光信号重叠性好，如图2b所示。
[0115]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体，其特征在于，所述载体为pmel-c02载体，其是在pyl_cas9pubi_b载体的基础上将启动子修改为“patubq10+sv40nls”，“cas9+sv40nls+nos(t)”元件替换为“atcas9+sv40nls+hsp(t)”，之后在asc酶切位点处按顺序加入patu6-26启动子、2x的bsai酶切位点、grna-sc和atu6-1(t)终止子改造得到；其中，“atcas9+sv40nls+hsp(t)”来自于pmod_a0501载体，patubq10+sv40nls的核苷酸序列如seq id no：1所示。2.根据权利要求1所述的适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体，其特征在于，所述载体还包括可视化元件。3.根据权利要求2所述的适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体，其特征在于，所述可视化元件添加在pmel-c02载体的pme酶切位点处。4.根据权利要求2或3所述的适用于甜瓜crispr/cas9基因编辑系统的载体，其特征在于，所述可视化元件包括pcamv35s启动子、atcor47-5’utr、eygfpuv、hsp-3’utr和hsp(t)终止子。5.权利要求1～4任一项所述的载体在甜瓜crispr/cas9基因编辑系统中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：当插入单靶点sgrna时，设计sgrna序列的接头引物分别为t1-f：attgnnnnn......nn，t1-r：aaacnnnnn......nn，将接头引物t1-f和t1-r混合，变性并退火连接获得sgrna表达盒；当插入双靶点sgrna时，设计两个sgrna序列的接头引物分为sgrna1-f：nnnnnnggtctcnattgnnnn......nngtt，sgrna1-f0：tgnnnn......nngttttagagctagaaatagc，sgrna2-r0：aacnnnn......nncaatcactacttcgtctctaa，sgrna2-r：nnnnnnggtctcnaaacnnnn......nnncaa，以pylsgrna-atu6-1载体为模板进行上述四引物扩增，获得sgrna表达盒；将获得的sgrna表达盒连接到权利要求1所述的载体上，转化大肠杆菌感受态筛选并测序验证获得阳性克隆；提取阳性克隆中的质粒转化农杆菌agl1后进行遗传转化；其中“n”代表sgrna的序列且当sgrna第一位碱基是g时，进行移除，“n”代表任意碱基。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，当插入双靶点sgrna时，扩增获得sgrna表达盒的体系为：成分体积/μl5
×
sf buffer25dntp1sgrna1-f5sgrna1-f01sgrna2-r01sgrna2-r5phanta tmsf dna polymerase1ddh2o11
total50程序为：95，3min；95，10s，58～65，30s，72，15～30s/kb，35个循环；72，10min；20，5min。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：根据甜瓜cmpds基因序列，选定其sgrna1：gtagtgagattgtgggcgatggg，sgrna2：tatcatctatctgtggtctaggg；合成含有bsa酶切位点的引物t1cmpds-f:gtatccggtctcgattgtagtgagattgtgggcgatgtt，t1cmpds-f0:tgtagtgagattgtgggcgatgttttagagctagaaatagc，t2cmpds-r0:aactagaccacagatagatgatacaatcactacttcgtctctaa，t2cmpds-r:tagattggtctcgaaactagaccacagatagatgatacaa；在权利要求1所述的载体上构建双靶点敲除载体，并转化到农杆菌agl1中；将含有敲除载体的农杆菌侵染甜瓜外植体，培养即得cmpds基因定向编辑的植株。

技术总结
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种适用于甜瓜CRISPR/Cas9基因编辑的载体及其应用。本发明通过将pYL_Cas9Pubi_B载体启动子修改为“pAtUBQ10+SV40NLS”，“Cas9+SV40NLS+NOS(t)”元件替换为pMOD_A0501载体上的“AtCas9+SV40NLS+HSP(t)”，之后在Asc酶切位点处按顺序加入pAtU6-26启动子、2X的BsaI酶切位点、gRNA-sc和AtU6-1(t)终止子，使其能够适用于甜瓜CRISPR/Cas9基因编辑的载体，且当其不添加可视化元件时，在甜瓜中的编辑效率可达到3.23％，添加可视化元件后，其编辑效率可达到2.08％，该研究对于完善优化pYL_Cas9Pubi_B载体在甜瓜中的应用并为进一步提高甜瓜的基因编辑效率奠定了基础。编辑效率奠定了基础。编辑效率奠定了基础。


技术研发人员：王转茸 万丽丽 汤谧 张学军 任俭 张娜 曾红霞 孙玉宏 熊建顺
受保护的技术使用者：新疆农业科学院海南三亚农作物育种试验中心 新疆农业科学院哈密瓜研究中心
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/18