一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法与流程

1.本发明涉及一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其属于土壤检测的技术领域。


背景技术：

2.抗生素作为药品和生长促进剂已被广泛应用于医药、畜牧业和水产养殖业。据报道，全球抗生素的年消费量为10万～20万吨，但30％以上的抗生素以原药或代谢产物的形式通过排泄进入土壤等环境介质中。迄今为止，已在环境土壤中检测到包括四环素、喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类在内的30多种抗生素，其残留总浓度最高可达mg/kg水平，远超兽药注册技术国际协调会指导委员会(scvich)提出的土壤中抗生素的生态毒理学阈值(100μg/kg)。在土壤中积累的抗生素不仅可以破坏微生物菌落，诱发耐药菌的产生，还将通过与其他离子结合影响生物群落的多样性和功能。更严重的是，一些植物源食品(如生菜、黄瓜、胡萝卜、土豆、豌豆、小麦、大麦和玉米)可以从土壤中吸收抗生素，通过食物链作为重要的迁移方式进一步积累，最终对人类健康造成危害。为了有效监测土壤中抗生素的变化并评估其生态风险，开发可行的土壤中抗生素筛查分析方法迫在眉睫。
3.固相萃取结合高效液相色谱串联质谱(hplc-ms/ms)是土壤中抗生素检测最常用的方法，通过不断优化前处理技术和分析条件，获得了满意的检测结果。由于土壤中抗生素的来源与受抗生素污染的化肥和灌溉水的施用有关，因此不同地区土壤中抗生素的种类和浓度存在一定差异。随着现代化学工业的发展，可能会有越来越多的新型抗生素进入土壤，大大增加了抗生素污染的不确定性。从本质上讲，现有的土壤中抗生素检测方法大部分为靶向分析，即在由给定抗生素建立的数据库中进行筛查。这些方法对数据库中抗生素具有良好的检测性能，但却无法识别数据库外抗生素，增加了抗生素的潜在暴露风险。因此，发展非靶向检测技术是实现土壤中抗生素全面监测和风险评估的重点。


技术实现要素：

4.代谢组学方法用于污染物的非靶向筛查是一种新兴的分析技术，其在分析样本量少、干扰物多、噪声高等复杂特征的海量数据时表现出极大的优势。更为复杂的土壤基质和污染条件成为建立代谢组学筛查方法的主要障碍。
5.为解决现有技术中存在的问题，本发明通过代谢组学分析策略，将追踪残留污染物的过程转化为追踪对应“标志化合物”的过程；具体采用的技术方案为：一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，包括以下步骤：
6.s1.土壤样品收集
7.收集未经施肥和灌溉的表层土壤样品，剔除异物；样品经风干、研磨、经过50-100目筛分后，得到土壤样品；
8.s2.提取和净化
9.a)准确称取土壤样品，置于聚丙烯管中，加入环丙沙星-d8甲醇溶液作为回收率内标，涡旋混匀；
10.b)将乙腈与na2edta-mcllvaine缓冲液按体积比1:1倒入离心管中，经震荡、超声离心；重复提取，混合上清液，用氮吹仪浓缩，再用纯水稀释至原体积；调节溶液ph至8.0，得到样品溶液；
11.c)依次加入甲醇和纯水活化hlb柱，然后将样品溶液转移到柱中，继续加入水冲洗hlb柱，待泵抽干后，采用甲醇与乙腈体积比为1:1进行洗脱；洗脱液氮气吹干后，再溶解于甲醇-0.1％甲酸水溶液中，过滤后备用；甲醇-0.1％甲酸水溶液中甲醇的体积比为40％；
12.s3.分离分析
13.所有化合物均通过accucore rp-ms色谱柱进行分离；
14.流动相a和b分别为0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-甲醇溶液，流速为0.2-0.5ml/min；
15.洗脱程序：0～3.0min,10％b～15％b；3.0～6.0min,15％b～60％b；6.0～7.0min,60％b～95％b；7.0～9.0min,95％b；9.0～10.0min,95％b～10％b；10.0～12.0min,10％b；
16.采用四极杆/静电场轨道阱lc-ms/ms系统，配备电喷雾离子源正模式(esi
+
)，对检测库中化合物和环丙沙星-d8进行分析；
17.s4.代谢组学数据处理
18.a)多变量分析
19.代谢组学非靶向筛查需要使用hplc-ms/ms全扫描模式下的raw格式输出文件，该文件通过proteowizard软件转换为mzxml格式的文件，将其上传到workflow4metabolomics平台进行分析；
20.通过峰检测、峰对齐和保留时间校准对所有色谱峰进行识别，然后对数据进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，得到峰强度值，形成以变量和样品名分别为横、纵坐标的数据矩阵；每个变量包含一组信息，记为m
××
t
××
，其中m和t分别表示质荷比和保留时间；通过simca 14.1软件导入数据矩阵后进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，正交偏最小二乘判别分析模型中的置换检验、s-plot图和变量投影重要性依赖于特定规则挑选符合条件的变量作为“标志化合物”候选变量；
21.挑选的特定规则为：
22.正交偏最小二乘判别分析模型中的r2y和q2分别用于评估模型沿y轴的解释水平和模型的预测水平；x轴和y轴上离原点越远的点，代表该变量对阵营间差异的贡献越大，置信水平越高；置信度绝对值高于0.9作为筛选“标志化合物”候选变量；
23.vip值反映变量的加载权重，用于特征选择；每个变量都有对应的vip值，vip值与变量的重要性成正相关；vip》1.5是选取“标志化合物”候选变量的阈值；
24.b)单变量分析
25.采用成对t检验和浓度的倍数变化进行单变量分析，成对t检验用于判断筛查出来的“标志化合物”在特定浓度组与另一浓度组之间是否存在显著的浓度差异，成对t检验的p值小于0.05；
26.浓度的倍数变化中将组间浓度倍数差异大于2的变量选定为“标志化合物”候选变量；
27.s5.建立质谱数据库
28.建立抗生素检测库，检测库中抗生素包含恶喹酸、西诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、达诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、马波沙星、司帕沙星、双氟沙星、竹桃
霉素、红霉素、螺旋霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、四环素、土霉素、金霉素、磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、苯甲酰磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯；
29.对以上36种抗生素进行分析，获得精确分子量、碎片离子、保留时间等信息，通过xcalibur软件对36种抗生素进行模拟碎裂，以二级质谱图中实际碎片离子质量数与理论精确质量数偏差低于5
×
10-6
，且丰度强度排在前五的离子作为特征碎片离子。将获取的保留时间、精确质量数和特征碎片离子信息录入trace finder软件，建立36种抗生素筛查数据库。
30.通过步骤s4找出的“标志化合物”质荷比和离子的相对丰度信息与抗生素筛查数据库中的信息进行比较，达到匹配“标志化合物”的目的。
[0031]“标志化合物”与抗生素筛查数据库中的信息进行比较：在full ms/dd-ms2模式下，通过trace finder软件对实际土壤样品数据进行筛查分析，设定参数如下：母离子精确质量数偏差5
×
10-6
、峰阈值强度1
×
104、信噪比5、子离子精确质量偏差5
×
10-6
、匹配最少碎片个数为1，在数据库中检索，符合以上全部条件的化合物即通过初步筛查。
[0032]
所述步骤s5中在抗生素筛查数据库中没有匹配的“标志化合物”，进入化合物数据库中进行筛查；化合物数据库为scifinder、pubchem、chemspider、metlin和massbank。
[0033]
土壤样品中化合物回收率校准以环丙沙星-d8作为回收率内标进行回收率计算；
[0034]
在空白土壤提取液中配制环丙沙星-d8的一系列标准曲线溶液，用于环丙沙星-d8在土壤样品中的回收率计算；将环丙沙星-d8在每个土壤样品中的回收率乘以校准系数换算至100％回收率，并以此校准环丙沙星-d8的峰强度以及所有变量的峰强度。
[0035]
na2edta-mcllvaine缓冲液的制备为：用na2hpo4、na2edta和柠檬酸溶解于纯水中，配制0.1mol/l的na2edta-mcllvaine缓冲液，再用hcl或naoh溶液调至ph 4.0。
[0036]
众所周知，由于缺乏土壤中抗生素最大残留限量的强制性官方文件，很难直接确定抗生素在土壤中的安全浓度阈值。scvich建议100μg/kg作为土壤中抗生素的安全阈值，但考虑到土壤中抗生素可能通过食物链的富集作用危害人类健康，我们参考了国家标准gb31650-2019和欧盟监管委员会37/2010号指导方针中提出的动物源食品中大多数抗生素的最大残留限量不低于10μg/kg，选取该浓度作为开发土壤中抗生素代谢组学非靶向筛查方法的测试浓度。
[0037]
本发明的有益效果：本研究将原本旨在探索生物学中小分子代谢物变化的代谢组学方法应用于土壤中抗生素的非靶向筛查，将传统代谢组学中寻找“生物标志物”过程转变为本研究中寻找土壤中残留抗生素所对应的“标志化合物”过程。该方法具有高度可行性并扩大了应用域，为探索水和气环境介质中更多污染物的非靶向筛查奠定了坚实的基础。该代谢组学方法能够全面、准确、快速地完成土壤中抗生素的非靶向筛查。
附图说明
[0038]
图1是w4m平台输出的标准添加土壤样品组的总离子流图。
[0039]
图2是标准添加土壤样品组的pca图。
[0040]
图3是标准添加土壤样品组的opls-da图。
[0041]
图4是标准添加土壤样品组的s-plot图。
[0042]
图5是标准添加土壤样品组的置换检验图。
具体实施方式
[0043]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0044]
实施例1
[0045]
(1)建立抗生素检测库，检测库中抗生素包含36种抗生素，关于36种抗生素的详细信息见表1。
[0046]
表1 36种抗生素的基本信息
[0047][0048]
表1 36种抗生素的基本信息
[0049][0050]
甲醇和乙腈(hplc级，merck公司，德国)；甲酸(hplc级，上海安谱实验科技股份有
限公司，中国)；乙二胺四乙酸二钠(na2edta)、磷酸氢钠(na2hpo4)、柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司，中国)；超纯水(milli-q超纯水系统，merck公司，德国)；盐酸环丙沙星-d8溶液(100μg/ml，甲醇，first standard公司，美国)。36种抗生素的标准品(纯度》98.3％)分别购自first standard公司(美国)、sigma公司(美国)、trc公司(加拿大)和dr.ehrenstorfer公司(德国)。
[0051]
(2)溶液配制
[0052]
分别配制浓度为100μg/ml的抗生素甲醇溶液，各取1ml混合后进一步用甲醇定容至100ml，获得浓度为1μg/ml的36种抗生素混合溶液。100μg/ml环丙沙星-d8甲醇溶液经稀释后获得100ng/ml甲醇溶液。将na2hpo4(5.5g)、na2edta(37.2g)和柠檬酸(12.9g)溶解于1l纯水中，制备na2edta-mcllvaine缓冲液(0.1mol/l)，再用0.1mol/l hcl或naoh溶液将上述缓冲液调至ph 4.0。
[0053]
(3)样品收集
[0054]
收集未经施肥和灌溉的森林表层土壤样品，剔除石头和杂草等异物。样品经风干、研磨、筛分(100目)后，保存于4℃冰箱中。
[0055]
(4)样品提取和净化
[0056]
a)将2.0、5.0和10.0g土壤样品加入不同的50ml聚丙烯离心管中，然后分别加入20、50和100μl包含36种抗生素的混合溶液(1μg/ml)。各自加入0.5ml环丙沙星-d8甲醇溶液(100ng/ml)作为回收率内标，溶液涡旋1min。
[0057]
b)将15ml 50％(v/v)乙腈/na2edta-mcllvaine缓冲液(0.1mol/l)倒入离心管中，经过20min震荡和10min超声后，4500r/min离心5min。重复提取3次后，混合上清液，用氮吹仪浓缩至9ml，再用纯水稀释至15ml。使用0.1mol/l naoh溶液调节溶液ph至8.0。
[0058]
c)依次加入6ml甲醇和6ml纯水活化hlb柱，然后将样品溶液转移到柱中，继续加入10ml水冲洗hlb柱，待泵抽干后，用10ml甲醇-乙腈(1:1,v/v)洗脱。洗脱液氮气吹干后，再溶解于1ml 40％(v/v)甲醇-0.1％甲酸/水溶液中，过滤后备用。
[0059]
(5)样品分组和命名
[0060]
来自于20、50和100ng/ml组的样品分别命名为样品1-1～样品1-9、样品2-1～样品2-9和样品3-1～样品3-9。从每个样品中吸取30μl溶液，混合均匀后作为质量控制(qc)样品。在每个浓度组开始进样前和完成进样后对qc样品进行3次重复进样，共获得12个qc样品点，标记为qc-1～qc-12，用于监督hplc-ms/ms的稳定性。
[0061]
(6)分离分析方法
[0062]
采用四极杆/静电场轨道阱lc-ms/ms系统(q exactive plus,thermo公司,美国)，配备电喷雾离子源正模式(esi
+
)，对36种抗生素和环丙沙星-d8进行分析。
[0063]
所有抗生素均通过accucore rp-ms色谱柱(100
×
2.1mm,2.6μm粒径,thermo公司,美国)进行分离。进样量为10μl。流动相a和b分别为0.1％(v/v)甲酸-水和0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液，流速为0.3ml/min。洗脱程序：0～3.0min,10％b～15％b；3.0～6.0min,15％b～60％b；6.0～7.0min,60％b～95％b；7.0～9.0min,95％b；9.0～10.0min,95％b～10％b；10.0～12.0min,10％b。柱温保持在40℃。
[0064]
q exactive plus参数设置如下：毛细管和加热温度均为320℃；鞘气和辅助气均为n2，流速分别为40和10arb；喷雾电压和透镜电压分别为3200和50v；扫描方式：全扫描/数
据依赖二级扫描(full ms/dd-ms2)；ms参数：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标(agc target)1
×
106，最大驻留时间(maximum it)100ms，m/z扫描范围100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，agc target 2
×
105，最大驻留时间50ms。
[0065]
(7)代谢组学数据处理
[0066]
代谢组学非靶向筛查需要使用hplc-ms/ms全扫描模式下的raw格式输出文件，该文件通过proteowizard软件转换为mzxml格式的文件，将其上传到workflow4metabolomics(w4m)平台(https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/)进行分析。通过峰检测、峰对齐和保留时间校准对所有色谱峰进行识别，然后对数据进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，得到峰强度值，形成以变量和样品名分别为横、纵坐标的数据矩阵。每个变量包含一组信息，记为m
××
t
××
，其中m和t分别表示质荷比和保留时间(单位：秒)。所有变量都有对应的色谱峰，其中一些属于“标志化合物”，另一些则来自干扰物，寻找“标志化合物”的过程实际上是一个寻找符合条件的变量的过程。
[0067]
通过simca 14.1软件导入数据矩阵后进行主成分分析(pca)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，二者是代谢组学研究中最常用的多变量分析方法。opls-da模型中的置换检验、s-plot图和变量投影重要性(vip)依赖于特定规则挑选符合条件的变量作为“标志化合物”候选变量，这些变量在20ng/ml浓度组应具有显著低的峰强度，而在100ng/ml浓度组则应具有显著高的峰强度。
[0068]
为了有效缩小变量的搜索范围，我们选取上述两浓度组中重叠的变量进行成对t检验和浓度倍数变化等单变量分析，可以进一步验证“标志化合物”的有效性。通过将找出的“标志化合物”信息(如质荷比和离子的相对丰度)与一些权威的化合物数据库(如scifinder,pubchem,chemspider,metlin和massbank)中的信息进行比较，达到匹配“标志化合物”的目的。在本研究中，为了方便起见，我们将表1视作36种抗生素的小型数据库，利用其质荷比、保留时间、加合物结构等信息，达到快速匹配“标志化合物”身份的目的。
[0069]
(8)数据预处理
[0070]
三个浓度梯度下36种抗生素的总离子流图如图1所示。由于土壤基质的复杂性，每种抗生素在不同土壤样品中的回收率可能存在显著差异。从图1可知，浓度水平与峰强度之间没有明显的正相关关系，因此，需要对抗生素回收率进行校准。根据前人研究结果，本研究选取环丙沙星-d8作为回收率内标(母离子m/z 340.19132；碎片离子m/z 296.20156、253.15933和239.14367；保留时间5.05分钟)进行回收率计算。具体如下：在空白土壤提取液中配制环丙沙星-d8的一系列标准曲线溶液(5、10、25、50和100ng/ml)，用于环丙沙星-d8在土壤样品中的回收率计算。如表2所示，20、50和100ng/ml组的回收率分别为72.7％～84.6％、66.6％～78.9％和61.5％～76.4％。将环丙沙星-d8在每个土壤样品中的回收率乘以校准系数换算至100％回收率，并以此校准环丙沙星-d8的峰强度，以及所有变量的峰强度。删除qc组或任意浓度组中变量峰强度相对标准偏差大于30％的无效变量。最后，获得4491个变量用于进一步分析。
[0071]
表2环丙沙星-d8在土壤样品组中的回收率(％)(n＝9)
[0072][0073]
实施例2多变量分析
[0074]
(1)主成分分析结果
[0075]
pca可以对样品进行分类，并在样品类别不明的情况下进一步消除极端样品。因此，pca可以用于评估数据质量和识别异常值。在图2中，所有样品的可信度均在95％置信区间内，没有出现极端数据和异常值。qc组样品具有良好的聚集性，说明了hplc-ms/ms的稳定性和已得数据的可靠性。每个浓度组样品聚集在一起，但远离其他组样品，意味着各浓度组之间存在重要的变量差异，为寻找“标志化合物”提供了可能。
[0076]
(2)opls-da结果
[0077]
opls-da在分组设计和获取详细的组间信息方面要比pca具有优势。图3描述了两个阵营的分离，其中，y轴左侧阵营代表特定浓度组，y轴右侧阵营则代表剩余的两个浓度组。两阵营之间的明显分离意味着存在显著差异的变量。opls-da模型中的r2y和q2分别用于评估模型沿y轴的解释水平和模型的预测水平。当两个参数值均接近1时，我们认为opls-da模型具有良好的可靠性和预测能力。在图3中，r2y和q2值均不低于0.986，说明了本研究中opls-da模型的稳健性。s-plot图是由代表所有变量的数据点组成的。x轴和y轴上离原点越远的点，代表该变量对阵营间差异的贡献越大，置信水平越高。因此，阵营间最具差异变量应该在s-plot图的两端寻找。置信度绝对值高于0.9被认为是筛选该变量的阈值。选取图4a第一象限中变量(该变量在20ng/ml浓度组中应具有显著低的浓度)和图4b第三象限中变量(该变量在100ng/ml浓度组中应具有显著高的浓度)的重叠变量作为候选“标志化合物”。
[0078]
以q2y的显著性检验(p值)作为评价指标，采用200次迭代置换检验进行opls-da模型过拟合评价。p《0.05对应置换检验图中q2回归线截距小于0.05，说明opls-da模型不易过拟合。如图5所示，所有q2回归线截距均显著低于0.05，说明所有opls-da模型均没有过拟合。vip值反映了变量的加载权重，用于特征选择。每个变量都有对应的vip值，vip值与变量的重要性成正相关。通常，vip》1.5被认为是选取具有候选“标志化合物”特征变量的阈值。在本研究中，我们找到了代表36种抗生素的全部“标志化合物”，如表3所示。此外，我们采用同样的代谢组学分析方法，对空白土壤提取液中36种抗生素的残留浓度进行了测定，结果表明，残留浓度可以忽略不计(《0.1ng/ml)，消除了土壤基质中固有的36种抗生素对寻找“标志化合物”的干扰。
[0079]
表3土壤样品组中筛查出的36种“标志化合物”信息
[0080][0081]
表3土壤样品组中筛查出的36种“标志化合物”信息
[0082][0083]a分别为100和20ng/ml组的两组vip值；b分别为100和20ng/ml组的两组坐标值；c质量误差(ppm)＝(w4m平台提取分子量-hplc-ms/ms提取分子量)*106/hplc-ms/ms提取分子量。
[0084]
实施例3单变量分析
[0085]
成对t检验和浓度的倍数变化是代谢组学研究中常用的单变量分析方法，前者用于判断筛查出来的“标志化合物”在特定浓度组与另一浓度组之间是否存在显著的浓度差异，后者则将组间浓度倍数差异大于2的变量选定为“标志化合物”。本研究中，成对t检验计算出的p值(显著性水平)均小于0.05，证明筛查出的“标志化合物”确实存在显著的组间差异，同时“标志化合物”浓度的变化倍数均大于2，进一步支持了筛查出的“标志化合物”的有效性。
[0086]
根据美国环保署8061a方法测定了36种抗生素的检出限。首先，称取2.0g空白土样进行前处理，获得1ml的空白土样提取液。将含有36种抗生素的20μl甲醇溶液(1μg/ml)用1ml空白土样提取液稀释，获得其20ng/ml溶液。采样上述相同方法，获得7个平行样品，并进
行相同的代谢组学分析，得到36种抗生素的峰强度。每种抗生素在7个平行样品中的平均峰强度对应于该抗生素20ng/ml浓度水平。因此，我们可以根据公式：峰强度
×
20/平均峰强度，计算出任意一个样品中每种抗生素的浓度(单位：ng/ml)，用于平行样品的标准偏差计算。最后，计算得到36种抗生素的检出限为0.6～2.6μg/kg，如表3所示。
[0087]
实施例4实用性测试
[0088]
1)样品采集
[0089]
采集表层土壤样品，挑除石子等异物，并进行风干处理，风干后充分研磨和过筛(100目)，于4℃条件下保存。
[0090]
2)提取和净化
[0091]
准确称取2.50g土壤样品，置于15ml聚丙烯管中，加入0.5ml环丙沙星-d8甲醇溶液(100ng/ml)作为回收率内标，涡旋混匀。将15ml 50％(v/v)乙腈/na2edta-mcllvaine缓冲液(0.1mol/l)倒入离心管中，振荡20min，超声10min，4500r/min离心5min。重复提取3次后，混合上清液，用氮吹仪浓缩至9ml，再用纯水稀释至15ml。使用0.1mol/l naoh溶液调节溶液ph至8.0。依次加入6ml甲醇和6ml纯水活化hlb柱，然后将样品溶液转移到柱中，继续加入10ml水冲洗hlb柱，待泵抽干后，用10ml甲醇-乙腈(1:1,v/v)洗脱。洗脱液氮气吹干后，再溶解于1ml 40％(v/v)甲醇-0.1％甲酸/水溶液中，过滤后备用。
[0092]
3)分析条件
[0093]
采用四极杆/静电场轨道阱lc-ms/ms系统(q exactive plus,thermo公司,美国)，配备电喷雾离子源正模式(esi
+
)，对抗生素和环丙沙星-d8进行分析。所有化合物均通过accucore rp-ms色谱柱(100
×
2.1mm,2.6μm粒径,thermo公司,美国)进行分离。进样量为10μl。流动相a和b分别为0.1％(v/v)甲酸-水和0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液，流速为0.3ml/min。洗脱程序：0～3.0min,10％b～15％b；3.0～6.0min,15％b～60％b；6.0～7.0min,60％b～95％b；7.0～9.0min,95％b；9.0～10.0min,95％b～10％b；10.0～12.0min,10％b。柱温保持在40℃。q exactive plus参数设置如下：毛细管和加热温度均为320℃；鞘气和辅助气均为n2，流速分别为40和10arb；喷雾电压和透镜电压分别为3200和50v；扫描方式：全扫描/数据依赖二级扫描(full ms/dd-ms2)；ms参数：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标(agc target)1
×
106，最大驻留时间(maximum it)100ms，m/z扫描范围100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，agc target 2
×
105，最大驻留时间50ms。
[0094]
4)建立质谱数据库
[0095]
在优化的质谱条件下，对36种抗生素进行分析，获得精确分子量、碎片离子、保留时间等信息，通过xcalibur软件对36种抗生素进行模拟碎裂，以二级质谱图中实际碎片离子质量数与理论精确质量数偏差低于5
×
10-6
，且丰度强度排在前五的离子作为特征碎片离子。将获取的保留时间、精确质量数和特征碎片离子等信息录入trace finder软件，建立36种抗生素筛查数据库。在full ms/dd-ms2模式下，通过trace finder软件对实际土壤样品数据进行筛查分析，设定参数如下：母离子精确质量数偏差5
×
10-6
、峰阈值强度1
×
104、信噪比5、子离子精确质量偏差5
×
10-6
、匹配最少碎片个数为1，在数据库中检索，符合以上全部条件的化合物即通过初步筛查。
[0096]
采用以上方法，我们选择了大连市旅顺口区、庄河市和金普新区的温室土壤作为研究对象，从表4可知，6个采样点均检出了土霉素、金霉素、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星
等5种抗生素，这些抗生素的检出归因于它们在畜牧业中作为药物和饲料添加剂的广泛使用以及对土壤颗粒的强吸附能力。金普新区受到的污染比其他两个地区更加严重。每个采样点的抗生素总浓度均在120μg/kg以上，超过了scvich提出的安全浓度限值(100μg/kg)，应当尽快开展土壤中抗生素来源调查，并采取措施切断污染源。温室土壤的筛查结果证明了我们的代谢组学方法在实现土壤中抗生素非靶向筛查的实用性，但正如我们前面介绍的，该方法只考虑了抗生素浓度不低于10μg/kg的情况，这可能会导致一些低浓度抗生素无法被检出。因此，大连市土壤抗生素污染的实际情况可能比我们预期的还要严重，应引起更多的关注，以化解潜在的危机。
[0097]
表4大连市3个行政区域温室土壤中抗生素浓度筛查结果(μg/kg)
[0098][0099]
要实现土壤中抗生素的全面风险评估，更好的解决方法是结合靶向和非靶向筛查方法的优势，如通过降低污染物的检出限和扩大污染物的检测范围等手段。
[0100]
尽管参照前述实施例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.土壤样品收集收集未经施肥和灌溉的表层土壤样品，剔除异物；样品经风干、研磨、经过50-100目筛分后，得到土壤样品；s2.提取和净化a)准确称取土壤样品，置于聚丙烯管中，加入环丙沙星-d8甲醇溶液作为回收率内标，涡旋混匀；b)将乙腈与na2edta-mcllvaine缓冲液按体积比1:1倒入离心管中，经震荡、超声离心；重复提取，混合上清液，用氮吹仪浓缩，再用纯水稀释至原体积；调节溶液ph至8.0，得到样品溶液；c)依次加入甲醇和纯水活化hlb柱，然后将样品溶液转移到柱中，继续加入水冲洗hlb柱，待泵抽干后，采用甲醇与乙腈体积比为1:1进行洗脱；洗脱液氮气吹干后，再溶解于甲醇-0.1％甲酸水溶液中，过滤后备用；甲醇-0.1％甲酸水溶液中甲醇的体积比为40％；s3.分离分析所有化合物均通过accucore rp-ms色谱柱进行分离；流动相a和b分别为0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-甲醇溶液，流速为0.2-0.5ml/min；洗脱程序：0～3.0min,10％b～15％b；3.0～6.0min,15％b～60％b；6.0～7.0min,60％b～95％b；7.0～9.0min,95％b；9.0～10.0min,95％b～10％b；10.0～12.0min,10％b；采用四极杆/静电场轨道阱lc-ms/ms系统，配备电喷雾离子源正模式，对检测库中化合物和环丙沙星-d8进行分析；s4.代谢组学数据处理a)多变量分析代谢组学非靶向筛查需要使用hplc-ms/ms全扫描模式下的raw格式输出文件，该文件通过proteowizard软件转换为mzxml格式的文件，将其上传到workflow4metabolomics平台进行分析；通过峰检测、峰对齐和保留时间校准对所有色谱峰进行识别，然后对数据进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，得到峰强度值，形成以变量和样品名分别为横、纵坐标的数据矩阵；每个变量包含一组信息，记为m
××
t
××
，其中m和t分别表示质荷比和保留时间；通过simca 14.1软件导入数据矩阵后进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，正交偏最小二乘判别分析模型中的置换检验、s-plot图和变量投影重要性依赖于特定规则挑选符合条件的变量作为“标志化合物”候选变量；挑选的特定规则为：正交偏最小二乘判别分析模型中的r2y和q2分别用于评估模型沿y轴的解释水平和模型的预测水平；x轴和y轴上离原点越远的点，代表该变量对阵营间差异的贡献越大，置信水平越高；置信度绝对值高于0.9的筛选“标志化合物”候选变量；vip值反映变量的加载权重，用于特征选择；每个变量都有对应的vip值，vip值与变量的重要性成正相关；vip>1.5是选取“标志化合物”候选变量的阈值；b)单变量分析采用成对t检验和浓度的倍数变化进行单变量分析，成对t检验用于判断筛查出来的
“
标志化合物”在特定浓度组与另一浓度组之间是否存在显著的浓度差异，成对t检验的p值小于0.05；浓度的倍数变化中将组间浓度倍数差异大于2的变量选定为“标志化合物”候选变量；s5.建立质谱数据库建立抗生素检测库，检测库中抗生素包含恶喹酸、西诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、达诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、马波沙星、司帕沙星、双氟沙星、竹桃霉素、红霉素、螺旋霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、四环素、土霉素、金霉素、磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、苯甲酰磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯；对以上36种抗生素进行分析，获得精确分子量、碎片离子、保留时间等信息，通过xcalibur软件对36种抗生素进行模拟碎裂，以二级质谱图中实际碎片离子质量数与理论精确质量数偏差低于5
×
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，且丰度强度排在前五的离子作为特征碎片离子。将获取的保留时间、精确质量数和特征碎片离子信息录入trace finder软件，建立36种抗生素筛查数据库。通过步骤s4找出的“标志化合物”质荷比和离子的相对丰度信息与抗生素筛查数据库中的信息进行比较，达到匹配“标志化合物”的目的。2.根据权利要求1所述的一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其特征在于：“标志化合物”与抗生素筛查数据库中的信息进行比较：在full ms/dd-ms2模式下，通过trace finder软件对实际土壤样品数据进行筛查分析，设定参数如下：母离子精确质量数偏差5
×
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、峰阈值强度1
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104、信噪比5、子离子精确质量偏差5
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、匹配最少碎片个数为1，在数据库中检索，符合以上全部条件的化合物即通过初步筛查。3.根据权利要求1所述的一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其特征在于：所述步骤s5中在抗生素筛查数据库中没有匹配的“标志化合物”，进入化合物数据库中进行筛查；化合物数据库为scifinder、pubchem、chemspider、metlin和massbank。4.根据权利要求1所述的一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其特征在于：土壤样品中化合物回收率校准以环丙沙星-d8作为回收率内标进行回收率计算；在空白土壤提取液中配制环丙沙星-d8的一系列标准曲线溶液，用于环丙沙星-d8在土壤样品中的回收率计算；将环丙沙星-d8在每个土壤样品中的回收率乘以校准系数换算至100％回收率，并以此校准环丙沙星-d8的峰强度以及所有变量的峰强度。5.根据权利要求1所述的一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其特征在于：na2edta-mcllvaine缓冲液的制备为：用na2hpo4、na2edta和柠檬酸溶解于纯水中，配制0.1mol/l的na2edta-mcllvaine缓冲液，再用hcl或naoh溶液调至ph 4.0。

技术总结
一种土壤中抗生素非靶向筛查的方法，其属于土壤检测的技术领域。该方法将代谢组学方法应用于土壤中抗生素的非靶向筛查，将传统代谢组学中寻找“生物标志物”过程转变为本研究中寻找土壤中残留抗生素所对应的“标志化合物”过程。该方法具有高度可行性并扩大了应用域，为探索水和气环境介质中更多污染物的非靶向筛查奠定了坚实的基础。该代谢组学方法能够全面、准确、快速地完成土壤中抗生素的非靶向筛查。查。查。


技术研发人员：薛伟锋 吕莹 万雪 王琦 侯娜
受保护的技术使用者：中国检验认证集团辽宁有限公司
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/7/19