一种肺结节联合诊断预测模型、检测试剂盒以及应用

1.本发明属于试剂盒及测试应用技术领域，涉及一种肺结节联合诊断预测模型、检测试剂盒以及应用。


背景技术：

2.肺癌是全世界常见的恶性肿瘤，严重影响着各国人民的生命健康安全，据统计肺癌是最常见的癌症发病率和死亡率类型之一。现阶段，肺癌的发生增长率和死亡率已居癌症发生率和死亡率首位，并且5年生存率低于20％，i期患者5年生存率显著高于iii期和iv期。因此肺癌筛查是改善患者生存，降低肺癌死亡率的首要手段。
3.随着低剂量螺旋计算机断层扫描的广泛应用，肺结节的早期筛查率和假阳性率大幅增高，结节性质是不确定的，肺结节患者是否需要进一步检测，是临床医生面临的核心问题，由于缺乏科学鉴别孤立性肺结节良恶性方法造成肺癌发病率和死亡率居高不下，结节的分类和管理成为肺癌筛查中的主要问题。肺结节是大部分肺癌的早期表现，肺结节并不等于肺癌，肺结节的定义为单发或多发的、直径小于3cm的圆形或不规则的肺内不透明病灶，且不伴有肺不张、肺门增大和胸腔积液。
4.目前区分良恶性结节的临床辅助诊断主要有以下几种：1)血液生化检查：对于肺结节，目前无特异性血液生化检查；2)肿瘤标志物检查：progrp、sccag、cea、nse、cyfra21-1。若这些指标联合检测，可提高鉴别良恶性结节的准确率；3)影像学检查：胸部x线检查、ct检查、超声检查、骨扫描以及pet检查。4)其它检查，例如：痰细胞学检查、纤维支气管镜检查、如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等。虽然都能用于良恶性结节的诊断，但是这些手段都不能完全做到早发现，早诊断。
5.所以亟需符合中国国情的肺结节的肺结节分类和处理方法，提高肺癌筛查的参与率和早诊率，降低人群肺癌死亡率。提出适合我国肺癌高风险人群的筛查推荐意见，为相关学科医师及工作人员提供科学的，适用的，可操作性强的肺癌筛查指导，为临床早期诊断肺结节和预测肺癌风险提供新的思路，为肺癌诊疗提供参考，推动中国肺癌防治的发展。
6.随着技术的飞速发展，医用液体活检技术的肿瘤标志物检测成为继影像学诊断和病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断、检测以及治疗产生重大的影响，通过血液、尿液等样本的采集对受检者进行肺癌的机率评估、预测，相比于传统活检方式，此检查方式属非侵入式，更简单、便捷，且有较高确诊率；例如，血浆游离dna(circulating cell-free dna,cfdna)是指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外dna，可用于检测早期肺癌，提高肺癌ct筛查的准确性；dna循环肿瘤dna(circulatingtumor dna,ctdna)是指坏死或调亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤dna片段，其带有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变，它包含在ctdna当中，是肿瘤患者cfdna中的一部分。同时，研究还发现，肿瘤患者体内ctdna的平均含量约是健康人体的6倍，ctdna包含与肿瘤相同的特异性基因突变，且在某些富含gc的片段携带相同的独特表观遗传标志，即dna甲基化，dna甲基化是指在dna甲基转移酶(dna methyltransferases,dnmt)介导下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基基
团添加到dna分子的碱基上，抑癌基因启动子甲基化在肺癌的发生、发展中起着至关重要的作用；并且dna甲基化往往发生在cpg岛的dna特定区域，且一致性好，提取的dna浓度较低时，可通过pcr实现扩增。研究发现，通过检测cfdna甲基化状态，应用panseer技术，可提前4年发现癌症患者血液中的甲基化信号，因此，检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便，另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。fabrizio等发现肺癌中keapl基因也存在高甲基化，keapl基因甲基化会对多种肺癌组织中keapl转录调控产生影响，表明keapl基因甲基化与肺癌的形成有关。huang等在研究接触烟煤的原发性非小细胞肺癌(nsclc)基因启动子的甲基化情况时发现，cdkn2a、dlec1、cdh1、dapk、runx3、apc、w1f1均有不同程度的高甲基化，这一组基因可作为肺癌早期检测的潜在表观遗传标志物，并且cdh1启动子甲基化与燃烧烟煤造成的空气污染地区的肺癌转移有关。以上研究结果充分证明了dna异常高甲基化与肺癌密切相关。
7.现有的肺癌检测技术中主要存在灵敏度低、假阳性高，有创，并且，目前常规检测技术难以检出早期肺癌。尽管相关研究已进展多年，但至今仍未有可以推向临床的肺癌无创筛查方法，因此，目前本领域中仍然需要进一步研究能够切实地应用于肺癌的筛查手段。


技术实现要素：

8.针对现有肺结节早期诊断存在的灵敏度低以及假阳性高的技术问题，本发明提供一种肺结节联合诊断预测模型、检测试剂盒以及应用，对肺结节具有较高的特异性和灵敏性，检测模型的诊断效能显著增强，
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
10.一种甲基化hoxa7基因、甲基化sox17基因和cea作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺结节的产品中的应用。
11.进一步的，所述诊断或者辅助诊断肺结节过程如下：
12.1)分别测定待测试者外周血中的hoxa7基因甲基化水平、sox17基因甲基化水平以及cea含量；
13.2)将步骤1)的测定结果代入联合诊断预测模型，计算诊断模型预测值；
14.3)当诊断模型预测值≤0.366时，则认为待测试者不为或候选不为肺恶性结节患者；当诊断模型预测值＞0.366时，则认为待测试者为或候选为肺恶性结节患者；
15.所述联合诊断预测模型如下式所示：
16.诊断模型预测值＝-2.811+0.008
×
hoxa7+0.033
×
sox17+0.226
×
cea；
17.上式中，hoxa7为待测试者hoxa7基因的甲基化水平，所述sox17为待测试者sox17基因的甲基化水平，所述cea为待测试者外周血中的cea含量。
18.进一步的，所述hoxa7基因甲基化水平和sox17基因甲基化水平均是通过相应基因的甲基化率来体现，所述甲基化率均按照下列公式计算：
[0019][0020]
δct＝ct
u-ctm[0021]
上式中：ctu为基因未甲基化经pcr扩增反应的ct值，ctm为基因甲基化经pcr扩增反应的ct值。
[0022]
进一步的，所述肺恶性结节为肺癌。
[0023]
进一步的，所述肺恶性结节为t1-2期肺癌或t3-4期肺癌。
[0024]
一种用于检测待测试者hoxa7基因的甲基化水平的hoxa7基因甲基化试剂盒，包括第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；
[0025]
第一甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：1；后引物的核苷酸序列参见序列表id：2；
[0026]
第一非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：3；后引物的核苷酸序列参见序列表id：4。
[0027]
一种用于检测待测试者soxa17基因的甲基化水平的soxa17基因甲基化试剂盒，包括第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对；
[0028]
所述第二甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：5；后引物的核苷酸序列参见序列表id：6；
[0029]
所述第二非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：7；后引物的核苷酸序列参见序列表id：8。
[0030]
本发明的有益效果是：
[0031]
1、本发明将甲基化hoxa7基因、甲基化sox17基因和cea作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺结节的产品中的应用，并构建三标志物联合诊断肺结节模型，具有高灵敏度性和高特异性，可以通过联合检测血液标志物来提高肺结节的诊断效能，检测甲基化异常更易发现早期病变。
[0032]
2、本发明所提供的试剂盒以血浆作为检测样本，对肺癌进行可靠的诊断，血浆样品获得非常容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便；使用样本量极少，取样过程非常方便且对病人无任何影响。
[0033]
3、本发明的试剂盒以及诊断模型，可以检测多种类型的肺癌，其也具有相对其他标志物更高的灵敏度。
[0034]
4、本发明的试剂盒无需考虑检测的对象和年龄，适用范围广。
[0035]
5、本发明将hoxa7基因和sox17基因这两个甲基化dna标记物作为候选标记物，在一个符合肺癌流行病学特征的人群中进行分析，同时联合cea蛋白，以建立肺癌诊断效率高、覆盖面广的联合诊断标志物为目的。
附图说明
[0036]
图1为hoxa7 cpg岛预测图；
[0037]
图2为sox17 cpg岛预测图；
[0038]
图3为hoxa7基因和sox17基因pcr扩增产物电泳图(注：m甲基化引物，u未甲基化引物，b蒸馏水空白对照；a甲基化阳性对照，b为甲基化阴性对照)；
[0039]
图4为建模组3个指标在健康人群、良性结节、肺癌患者中的比较；
[0040]
图5为验证组3个指标在健康人群、良性结节、肺癌患者中的比较；
[0041]
图6为训练组单个检测指标及联合检测诊断模型roc比较；图中，hoxa7表示人同源
盒基因7；sox17表示转录因子基因17；cea表示癌胚抗原；模型表示3指标联合检测模型；
[0042]
图7为验证组单个检测指标及联合检测诊断模型roc比较；图中，hoxa7表示人同源盒基因7；sox17表示转录因子基因17；cea表示癌胚抗原；验证模型表示3指标联合检测模型。
具体实施方式
[0043]
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
[0044]
本发明的目的是提供外周血甲基化基因及cea联合检测诊断肺癌模型。
[0045]
具体的，以检测待测者的hoxa7基因甲基化水平、sox17基因甲基化水平和cea含量作为标志物，构建三标志物联合诊断肺结节模型，制备出用于诊断或者辅助诊断肺结节的产品，用于肺结节的诊断预测。
[0046]
本发明中，待测者hoxa7基因的甲基化水平为来自于所述待测者的外周血中hoxa7基因的甲基化水平；待测者sox17基因的甲基化水平为来自于待测者的外周血中sox17基因的甲基化水平。
[0047]
本发明中，用于检测hoxa7基因甲基化水平的物质为能够基于甲基化特异性real-time pcr检测hoxa7基因甲基化水平的成套试剂。
[0048]
hoxa7基因甲基化试剂盒，包括第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对。
[0049]
第一甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：1；后引物的核苷酸序列参见序列表id：2。
[0050]
第一非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：3；后引物的核苷酸序列参见序列表id：4。
[0051]
具体的，第一甲基化引物对为：前引物tatgtattgtttttaggtatttcgg；后引物acaacttctaattcccctctaacg。
[0052]
具体的，第一非甲基化引物对为：前引物tatgtattgtttttaggtattttgg；后引物acaacttctaattcccctctaacac。
[0053]
本发明中，用于检测sox17基因甲基化水平的物质为能够基于甲基化特异性real-time pcr检测sox17基因甲基化水平的成套试剂。
[0054]
soxa17基因甲基化试剂盒包括第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
[0055]
第二甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：5；后引物的核苷酸序列参见序列表id：6；所述第二非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：7；后引物的核苷酸序列参见序列表id：8。
[0056]
具体的，第二甲基化引物对为：前引物ttaaacgattttgggtaagtacgtc；后引物actaaccgaaactaaactctaacgc。
[0057]
具体的，第二非甲基化引物对为：前引物ttaaatgattttgggtaagtatgttga；后引物aaaaactaaccaaaactaaactctaacac。
[0058]
本发明建立用于诊断或者辅助诊断肺癌的系统，可包括数据输入模块、数据运算模块、数据比较模块和结论输出模块。
[0059]
数据输入模块用于输入检测得到的待测者的hoxa7基因甲基化水平、sox17基因甲基化水平和外周血中cea蛋白含量的检测值。
[0060]
数据运算模块用于将所述检测值代入联合检测诊断预测模型，计算诊断模型预测值。
[0061]
联合检测诊断预测模型如公式i所示；
[0062]
诊断模型预测值＝-2.811+0.008
×
hoxa7+0.033
×
sox17+0.226
×
cea(公式i)
[0063]
上式中，cea表示待测者的外周血中cea蛋白的浓度；hoxa7表示待测者的hoxa7基因的甲基化水平；sox17表示待测者的sox17基因的甲基化水平。
[0064]
数据比较模块用于将所述诊断模型预测值与阈值进行比较；阈值为0.366。
[0065]
结论输出模块用于输出结论，当诊断模型预测值≤0.366时，则输出“待测者不为或候选不为肺恶性患者(即所述待测者为肺癌患者的可能性较低)”的结论；当模型预测值＞0.366时，则输出“待测者为或候选为肺恶性结节患者(即待测者为肺癌患者的可能性较高)”的结论。
[0066]
待测试者的hoxa7基因的甲基化水平即hoxa7基因的甲基化率，是通过待测试者的hoxa7基因在pcr扩增反应的ct值，代入甲基化率计算公式来体现的。
[0067]
待测试者的sox17基因的甲基化水平即sox17基因的甲基化率，是通过待测试者的soxa7基因在pcr扩增反应的ct值，代入甲基化率计算公式来体现的。
[0068]
本发明中，待测者为肺癌患者或者健康人。其中肺癌如肺腺癌或非腺癌，再如t1-2期肺癌(肿瘤大小≤5cm)或t3-4期肺癌(肿瘤大小＞5cm)。
[0069]
良性结节为经胸部x光或薄层计算机断层扫描证实有肺结节，穿刺为良性结节；健康人为经胸部x光或薄层计算机断层扫描证实无肺结节，无恶性肿瘤病史。
[0070]
下面以具体的实施例对本发明的诊断预测模型进行详细的说明。
[0071]
需要说明的是：实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0072]
实施例
[0073]
1、hoxa7基因甲基化水平和sox17基因甲基化水平测试
[0074]
一、研究人群
[0075]
在健康对照患者、良性结节患者、肺癌患者的样本中测量和统计分析外周血样本dna中hoxa7和sox17基因的甲基化水平，检测血清中cea蛋白的含量。
[0076]
从2020年12月到2021年12月，陕西中医药大学附属医院的210名受试者被纳入本发明研究，并随机分为建模组和验证组。
[0077]
收集符合下列标准的肺癌患者的血样：(a)无其他特异性恶性疾病史；(b)在采血过程之前不进行抗癌治疗。
[0078]
对照组：健康人群同期从体检中心选取；经胸部x光或薄层计算机断层扫描证实，这些患者无肺结节，无恶性肿瘤病史。
[0079]
二、实验方法
[0080]
血浆样本中游离dna的hoxa7基因的甲基化水平和sox17基因的甲基化水平测定。
[0081]
使用10ml bd真空edta采血管(bd biosciences，san jose，ca)进行血液采集，每个受试者采集10ml血液。采血管在4000r/min下室温离心5min，然后转移血浆至一个干净的1.5ml的ep管中，以12000r/min离心5min，将血浆转移至干净的1.5ml的ep管中，置于-80℃保存。
[0082]
(1)游离dna的提取及亚硫酸盐转化
[0083]
游离dna的提取采用北京天根生物科技有限公司血浆游离dna提取试剂盒，货号为：dp316。
[0084]
亚硫酸盐转化使用zymo research生物公司的ez dna methylation-gold kit，货号为：d5005。
[0085]
阴性对照和阳性对照使用北京天恩泽基因科技有限公司人甲基化/非甲基化dna标准品。
[0086]
(2)ms-pcr检测
[0087]
a、引物的设计与选择
[0088]
利用在线引物设计程序“methprimer”，在方框输入hoxa7、sox17的启动子序列，选择“pickprimersforbisulfite sequencungpcr”，其他参数选择程序默认值，点击“submit”，即可显示hoxa7的cpg岛、sox17的cpg岛以及引物的相应位置(图1、图2)，同时显示设计的引物有5组，根据5组引物，经过多轮实验验证与筛选，选择以下最优引物。
[0089]
b、引物的订购
[0090]
设计的hoxa7的引物序列、sox17的引物序列如表1所示，引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0091]
表1hoxa7/sox17甲基化荧光定量pcr反应中的引物
[0092][0093][0094]
注：u表示未甲基化，m表示甲基化。
[0095]
c、pcr检测
[0096]
本实验采用的是实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)，其反应体系为(具体见表2)。
[0097]2×
sybr green qpcr mix 10μl，引物共0.8μl，水7μl，荧光定量参比染料reference dyeⅱ0.4μl和经过亚硫酸氢盐处理后的dna模板1.8μl组成20μl的反应体系。
[0098]
表2 qpcr反应体系(μl)
[0099]
产物水mix上游引物下游引物模板rox reference dyeⅱ合计hoxa7(u，m)7100.40.41.80.420sox17(u，m)7100.40.41.80.420
[0100]
注：u表示未甲基化，m表示甲基化。
[0101]
反应条件经过多次预实验才最终确定(具体见表3)，每次反应均准备了2个空白对照进行质量控制，同时每组样本重复检测3次，取平均值。
[0102]
甲基化分析主要分两部分。
[0103]
(1)hoxa7基因甲基化阴性对照、hoxa7基因甲基化阳性对照、sox17基因甲基化阴性对照和sox17基因甲基化阳性对照，均选用经过亚硫酸氢盐试剂盒转化的人甲基化/非甲基化dna标准品。
[0104]
(2)分别检肺癌组、良性结节组和健康对照组外周血ctdna样本中hoxa7基因的甲基化水平、sox17基因的甲基化水平。
[0105]
荧光定量pcr反应在abi 7500荧光定量pcr仪(applied biosystems，ca)上进行，pcr反应程序如表3所示。
[0106]
表3 qpcr反应条件
[0107][0108][0109]
pcr反应结束后，使用abi7500荧光定量pcr仪适配的abi 7500sds软件v2.0.5进行分析，即可得到每个样本2个基因检测ct值。
[0110]
在pcr扩增反应结束后，荧光定量pcr仪可以自动进行数据分析。通过调整基线和阈值得出ct值。
[0111]
其中：c代表cycle，t代表threshold。ct值表示反应产物的荧光信号达到所设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
[0112]
样本甲基化水平(即甲基化率)的计算公式为：
[0113][0114]
δct＝ct
u-ctm[0115]
上式中：ctu为基因未甲基化经pcr扩增反应的ct值，ctm为基因甲基化经pcr扩增反应的ct值。
[0116]
(3)hoxa7基因、sox17基因的凝胶电泳检测
[0117]
本实验采用凝胶电泳实验验证引物特异性，具体检测过程如下。
[0118]
首先，配制1
×
tbe缓冲液，配制2％的琼脂糖。
[0119]
将冷却的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固。将凝固后的胶板小心放入电泳槽中浸润，同时将电泳缓冲液倒入电泳槽中并完全浸入凝胶板，高于胶板胶面大致1mm左右，放置30min后加样。
[0120]
扩增后的样品(20μl)和dnamaker(20μl)，然后各加4μl6
×
dna loadingbuffer(6
×
dna上样缓冲液)，得到对应的混合后的样品和混合后的dnamaker。
[0121]
每个样品孔里加7μl混合后的样品和7μl混合后的dnamaker；接通电泳槽电源，确定样品孔一侧在负极，设置电压120v，时间20min，扫胶，拍照，电泳结果如图3所示，其中(a)为hoxa7基因电泳结果，(b)为soxa17基因电泳结果。
[0122]
hoxa7基因阳性对照组和sox17基因阳性对照组，使用hoxa7基因的甲基化引物、sox17基因的甲基化(methylation，m)引物进行荧光定量pcr扩增。
[0123]
hoxa7基因甲基化引物对为：前引物tatgtattgtttttaggtatttcgg；后引物acaacttctaattcccctctaacg。
[0124]
soxa17基因甲基化引物对为：前引物ttaaacgattttgggtaagtacgtc；后引物actaaccgaaactaaactctaacgc。
[0125]
hoxa7基因阴性对照组和sox17基因阴性对照组，分别使用未甲基化(unmethylation，u)的引物进行荧光定量pcr扩增。
[0126]
hoxa7基因未甲基化引物对为，前引物tatgtattgtttttaggtattttgg；后引物acaacttctaattcccctctaacac。
[0127]
soxa17基因未甲基化引物对为，前引物ttaaatgattttgggtaagtatgttga；后引物aaaaactaaccaaaactaaactctaacac。
[0128]
参见图3，阳性对照组pcr扩增出目的产物说明发生了甲基化，与之相反则说明未发生甲基化，阴性对照组pcr扩增出目的产物说明未发生甲基化，与之相反则说明发生了甲基化。蛋白电泳实验佐证了引物的特异性和反应结果的准确性。
[0129]
2、血清中cea蛋白浓度的测定
[0130]
遵照国家ws/t224-2002技术规范，使用一次性真空分离胶采血器。用bd真空器乙二胺四乙酸管(bd biosciences，san jose，ca)缓慢抽取受检者5ml静脉血，避免在采血管内部产生红色血泡。轻轻颠倒180
°
，摇匀5～8次。将采血管立即放入4℃冰盒或2℃～8℃冰箱，在4h～8h内按4000r/min离心5min完成血清分离。采用雅培architect i400sr仪器，配套使用雅培厂家试剂，利用化学发光免疫分析检测血清中cea水平。
[0131]
3、甲基化基因及cea联合检测诊断肺癌模型的建立及应用
[0132]
一、实验数据的统计分析
[0133]
数据统计分析采用kruskal-wallis h检验对正常对照组、良性结节组、肺癌患者的生物标志物水平进行统计分析。
[0134]
为了建立肺癌鉴别的预测模型，采用正向逻辑回归方法筛选变量。应用95％置信区间(ci)的受试者工作特征曲线(roc)下面积(auc)，比较单标记物与模型的诊断性能。另外，利用训练组的约登指数确定预测模型的cut-off值。通过比较roc曲线的auc来分析我们的模型在不同亚组中的诊断性能。其他描述性统计，如敏感性、特异性、标准差(sd)。
[0135]
采用spss24.0、graphpad prism 5.0、medcalc(版本11.4.2.0)、microsoft excel等软件进行统计分析。p值是双尾的；差异有统计学意义，p值小于0.05。
[0136]
二、实验结果
[0137]
在本发明研究中，将所有的入组人群随机分为训练组和验证组。
[0138]
训练组有150名候选人(50名健康对照组、50名良性结节组、50名肺癌组)。
[0139]
验证组有60名候选人(30名健康对照、10名良性结节患者、20名肺癌患者)被随机选择作为验证队列，其他基本信息见表4。
[0140]
表4试验人群的基本信息
[0141][0142]
将试验人群血浆ctdna hoxa7、sox17基因甲基化、cea水平之间的比较，结果见表5、图4和图5，图4和图5中，lung cancer group为肺癌组，pulmonary nodule group为良性结节组，healthy control group为健康对照组。
[0143]
参见表5可知，数据水平呈偏态分布，数据分析使用kruskal-wallish检验，结果显示，验证组和训练组中各个指标检测水平在3组之间均有统计学意义(p《0.05)。
[0144]
表5试验人群外周血hoxa7甲基化水平、sox17甲基化水平和cea的结果
[0145][0146]
[0147]
注：采用kruskal-wallish检验；a表示中位数；b表示四分位间距；*，与良性结节组相比p《0.05；
▲
，与健康对照组相比，p《0.05。
[0148]
参见图4和图5，建模组肿瘤患者hoxa7基因的甲基化水平和sox17基因的甲基化水平显著高于健康对照组(p《0.05)。验证组的情况类似，即与健康对照组相比，肺癌患者hoxa7、sox17甲基化水平显著升高(p《0.05)。
[0149]
通过同时检测三个生物标记物的水平，根据logistic回归分析的结果建立预测模型(表6)。
[0150]
结果显示，所有三个测量的生物标志物都被纳入，最终获得联合检测诊断预测模型如下：
[0151]
诊断模型预测值＝-2.811+0.008
×
hoxa7+0.033
×
sox17+0.226
×
cea
[0152]
式中，cea表示待测者的血清中cea蛋白的浓度；hoxa7表示待测者外周血中的hoxa7基因的甲基化水平(甲基化率)；sox17表示待测者外周血中的sox17基因的甲基化水平(甲基化率)。
[0153]
对训练组单个检测指标及联合检测诊断模型roc比较，结果如图6，图中，hoxa7表示人同源盒基因7；sox17表示转录因子基因17；cea表示癌胚抗原；模型表示3指标联合检测模型。对验证组单个检测指标及联合检测诊断模型roc比较，结果如图7所示；图中，hoxa7表示人同源盒基因7；sox17表示转录因子基因17；cea表示癌胚抗原；验证模型表示3指标联合检测模型。
[0154]
以建模组(即训练组)中的预测值绘制roc曲线，并根据约登指数值(0.570)确定诊断的cut-off值0.366。即当诊断模型预测值≤0.366时，则认为待测者不为或候选不对恶性肺结节患者(待测者为肺癌患者的可能性较低)；当模型预测值＞0.366时，则认为待测者为或候选为恶性肺结节患者(待测者为肺癌患者的可能性较高)。
[0155]
表6多因素回归分析
[0156]
研究变量β系数标准误瓦尔德值自由度p值or值hoxa70.0080.0080.85610.0161.008sox170.0330.00815.89310.0001.033cea0.2260.0817.78210.0051.254
[0157]
简写：hoxa7＝人同源盒基因7；sox17＝转录基因17；cea＝癌胚抗原。
[0158]
参见图6和图7，单个生物标志物的诊断能力和小组分别分析了三组。在三个生物标志物中，cea检测指标的受试者工作特征曲线面积值(auc)在建模组、验证组分别为0.737(95％ci，0.653-0.821)、0.669(95％ci，0.615-0.865)；hoxa7检测指标的受试者工作特征曲线面积值(auc)在建模组、验证组分别为0.587(95％ci，0.485-0.689)、0.860(95％ci，0.751-0.969)；sox17检测指标的受试者工作特征曲线面积值(auc)在建模组、验证组分别为0.773(95％ci，0.695-0.851)、0.903(95％ci，0.809-0.998)。
[0159]
同时，建模组中联合诊断模型的受试者工作特征曲线面积值(auc)为最高即0.828(95％ci，0.759-0.898)，与任何单个诊断标志物相比，差异有统计学意义(p《0.05)。此外，验证组中，联合诊断模型的受试者工作特征曲线面积值(auc)分别为0.965(95％ci，0.917-1.000)。分析证实，与任何单个生物标志物相比，联合检测模型的诊断价值获得了显著性提高(p《0.05，表7)。
[0160]
表7不同组别中联合诊断模型与单个指标比较结果
[0161][0162]
在这项研究中，通过选择youden指数0.570确定诊断的cut-off值0.366，基于此cut-off值，联合诊断模型在建模组和验证组人群中的敏感度分别为69.2％和90.0％；在验证组的特异性高达93.3％；而训练组相对较低为87.8％。表明了其在鉴别肺癌和健康对照中优于任何单一生物标志物的临床优势(表8)。
[0163]
表8联合诊断模型在建模组及验证组中的诊断能力评估
[0164]
组别肺癌患者良性结节健康人群敏感度特异度约登指数建模组n＝15050505069.20％87.80％57.00％验证组n＝5020103090.00％93.30％83.30％
[0165]
与单个检测指标相比，本发明的研究证实通过联合检测具有分期特异性和病理特异性的生物标志物，所构建的诊断模型的肺癌诊断能力获得显著性的提升。因此，可以通过联合检测血液标志物来提高肺癌的诊断效能。

技术特征：
1.一种甲基化hoxa7基因、甲基化sox17基因和cea作为标志物在制备用于诊断或者辅助诊断肺结节的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断或者辅助诊断肺结节过程如下：1)分别测定待测试者外周血中的hoxa7基因甲基化水平、sox17基因甲基化水平以及cea含量；2)将步骤1)的测定结果代入联合诊断预测模型，计算诊断模型预测值；3)当诊断模型预测值≤0.366时，则认为待测试者不为或候选不为肺恶性结节患者；当诊断模型预测值＞0.366时，则认为待测试者为或候选为肺恶性结节患者；所述联合诊断预测模型如下式所示：诊断模型预测值＝-2.811+0.008
×
hoxa7+0.033
×
sox17+0.226
×
cea；上式中，hoxa7为待测试者hoxa7基因的甲基化水平，所述sox17为待测试者sox17基因的甲基化水平，所述cea为待测试者外周血中的cea含量。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述hoxa7基因甲基化水平和sox17基因甲基化水平均是通过相应基因的甲基化率来体现，所述甲基化率均按照下列公式计算：δct＝ct
u-ct
m
上式中：ct
u
为基因未甲基化经pcr扩增反应的ct值，ct
m
为基因甲基化经pcr扩增反应的ct值。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肺恶性结节为肺癌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肺恶性结节为t1-2期肺癌或t3-4期肺癌。6.一种用于检测待测试者hoxa7基因的甲基化水平的hoxa7基因甲基化试剂盒，其特征在于，所述hoxa7基因甲基化试剂盒包括第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；第一甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：1；后引物的核苷酸序列参见序列表id：2；第一非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：3；后引物的核苷酸序列参见序列表id：4。7.一种用于检测待测试者soxa17基因的甲基化水平的soxa17基因甲基化试剂盒，其特征在于，所述soxa17基因甲基化试剂盒包括第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对；所述第二甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：5；后引物的核苷酸序列参见序列表id：6；所述第二非甲基化引物对为：前引物的核苷酸序列参见序列表id：7；后引物的核苷酸序列参见序列表id：8。

技术总结
本发明属于试剂盒及测试应用技术领域，涉及一种肺结节联合诊断预测模型、检测试剂盒以及应用，甲基化HOXA7基因、甲基化SOX17基因和CEA作为标志物构建肺结节联合诊断预测模型，应用时：1)测定外周血中的HOXA7基因甲基化水平、SOX17基因甲基化水平以及CEA含量；2)将测定结果代入联合诊断预测模型，计算诊断模型预测值；3)当诊断模型预测值≤0.366时，则认为待测试者不为或候选不为肺恶性结节患者；当诊断模型预测值＞0.366时，则认为待测试者为或候选为肺恶性结节患者。本发明构建的肺结节联合诊断预测模型，对肺结节具有较高的特异性和灵敏性，检测模型的诊断效能显著增强。检测模型的诊断效能显著增强。检测模型的诊断效能显著增强。


技术研发人员：马艳侠 冯飞雪 武曼 杨蕊菲 王战争 周嘉迪 杨洋 王大望
受保护的技术使用者：陕西中医药大学附属医院
技术研发日：2023.02.17
技术公布日：2023/7/19