一种装载VEGF-mRNA的外泌体及其制备方法与流程

一种装载vegf-mrna的外泌体及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种装载vegf-mrna的外泌体及其制备方法。


背景技术：

2.血管新生和血运重建对于提高皮片移植、任意皮瓣转移成活率，以及促进创面愈合方面都起到至关重要的作用，整形外科手术后常见并发症之一就是移植物因血运障碍而发生部分坏死，甚至全部坏死。然而，目前临床上尚未有一种有效的药物或手段能够在手术后促进移植组织的血管新生或血运重建，从而提高皮片移植、皮瓣移植的成活率。
3.外泌体是一种近年来发现的，可被所有细胞类型分泌的，具有“细胞间通讯”功能的纳米级别囊泡。作为一种天然药物载体，外泌体可以携带一些具有生物功能的小分子物质，如：dna，mrna，mirna，lncrna等。因此，可以通过“工程化”的手段，使外泌体携带特定的目标分子，从而达到将目标分子直接递送进入目标细胞或组织，从而达到某些特殊治疗效果。目前，现有技术尚未公开具有增强促血管生成功能工程化干细胞外泌体的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种装载vegf-mrna的外泌体及其制备方法，该制备方法能够将vegf-mrna装载于外泌体中，并使得外泌体能够促进huvec细胞增殖和迁移，同时能够更好的诱导huvec细胞形成血管。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.本发明第一方面提供了一种装载vegf-mrna的外泌体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
7.(a)采用selex技术筛选针对vegf-mrna的单链核苷酸序列，其中，所述单链核苷酸序列的aug端能够与目标mrna特异性结合；
8.(b)根据rna-蛋白质互作原理选择一个具有颈环结构的ms2核苷酸序列，所述茎环结构能够识别外泌体跨膜蛋白cd9连接的mcp位点；
9.(c)将单链核苷酸序列和ms2核苷酸序列进行链接，得到特异性双向识别vegf-mrna和mcp蛋白位点的复合核苷酸适配体；
10.(d)构建包含所述复合核苷酸适配体序列以及cd9-mcp融合蛋白翻译序列的慢病毒质粒载体，再经细胞转染、培养、收集上清、提取，得到所述装载vegf-mrna外泌体。
11.本技术发明人研究发现，使用核酸适配体(aptamer)结合外泌体跨膜蛋白修饰的方法，可以特异性的结合细胞内的某种mrna，从而使目标mrna装载入外泌体，外泌体膜保护mrna不被其他酶类降解，靶细胞内吞外泌体后mrna可直接进入靶细胞并行使翻译功能。
12.mrna递送是改变靶组织中某种功能蛋白表达的最直接有效的手段，目前多用于疫苗的研制，理论上，一个外泌体囊泡(半径＝10-70nm)可以装载分子量2000nt左右的mrna(半径＝16.5-58.3nm)一个以上，然而由于其分子量较大且易与核糖体等蛋白形成符合结
构，天然情况下很难装载入外泌体内，因此就需要借助aptamer将其转载进入外泌体。
13.aptamer是一段从核苷酸文库中筛选出来的对特定离子、分子、蛋白质、细胞等有较高特异性和亲和力的长约20-70个碱基的核苷酸序列，通过折叠成三级结构与目标物结合。由于与生物抗体类似，与靶标分子有较强的亲和力和特异性，因此被科学家们称为“化学抗体”，己经鉴定出能够与很多目标物如金属离子、小分子、蛋白质、病毒、细胞等结合的适配体。与生物抗体相比aptamer展现出多种优势：首先，aptamer是化学合成的分子，合成成本低、过程简单、批次间差异小；其次，它的化学性质使其在不同的位点、不同的官能团上均可进行简单可控的化学修饰，实现不同目的的分子诊断和治疗。第三，由于识别是基于其高级结构，而核酸序列不同结构之间可逆，这使得它具有耐酸、耐碱、耐高温的特性；适配体的筛选、设计、合成目前已商业化。
14.本发明制备方法先通过使用指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,selex)技术，筛选出针对vegf-mrna的单链核苷酸序列，此单链部分在aug端与vegf-mrna通过碱基配对特异性结合；另外根据rna-蛋白质互作原理选择一个茎环结构的ms2核苷酸序列，此结构能够识别与外泌体跨膜蛋白cd9连接的mcp位点；两个序列组合而成的复合适配体通过双向识别，就可将vegf-mrna装载于外泌体内。
15.优选地，所述单链核苷酸序列具体如seq id no:1所示。
16.优选地，所述ms2核苷酸序列具体如seq id no:2所示。
17.优选地，所述cd9-mcp融合蛋白的编码序列如seq id no:3所示。
18.本发明第二方面提供了一种上述制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体。
19.本发明第三方面提供了一种上述制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体在制备促进huvec细胞增殖和/或迁移的产品中的应用。
20.本发明第四方面提供了一种上述制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体在制备诱导huvec细胞形成血管的产品中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
22.本发明制备方法能够将vegf-mrna装载于外泌体中，使得制备得到的外泌体能够促进huvec细胞增殖和迁移，同时能够更好的诱导huvec细胞形成血管。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
24.图1为本发明装载vegf-mrna外泌体的制备原理图；
25.图2为本发明实施例3中复合核苷酸适配体序列与vegf-mrna特异性结合的结构示意图；
26.图3为本发明实施例3中adsc细胞和adsc外泌体中cd9-mcp表达的western blot检测结果；
27.图4为本发明实施例3中adsc细胞和adsc外泌体中vegf-mrna表达的检测结果；
28.图5为本发明实施例4中外泌体与靶细胞huvecs共培养后荧光显微镜观察图；
29.图6为本发明实施例4中靶细胞huvcec中vegf-mrna的表达情况；
30.图7为本发明实施例4中wound healing细胞划痕试验检测结果；
31.图8为本发明实施例4中matrigel成小管试验检测结果。
具体实施方式
32.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
33.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
34.本发明制备方法先通过使用selex技术，筛选出针对vegf-mrna的单链核苷酸序列，此单链部分在aug端与vegf-mrna通过碱基配对特异性结合；另外根据rna-蛋白质互作原理选择一个具有茎环结构的ms2核苷酸序列，此结构能够识别与外泌体跨膜蛋白cd9连接的mcp位点；两个序列组合而成的复合适配体通过双向识别，就可将vegf-mrna装载于外泌体内。本发明外泌体的制备原理图见图1。
35.以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
36.实施例1
37.本实施例为mrna适配体的设计和合成：
38.可依据适配体筛选的selex方法，进行dna文库的构建、靶标分子(vegf-mrna)与文库的孵育、未结合序列的去除以及结合序列的扩增。如此循环若干轮后，将得到的序列进行测序，从中挑选同源系数较高、结合力强的序列，在此基础上再删减特殊的茎环、假结结构缩减序列长度，得到数个(＜5个)所需的aptamer序列，然后将初步筛选得到的mrnaaptamer序列与具有茎环结构的ms2核苷酸序列分别人工合成并链接，就形成了具有特异性双向识别目标mrna和mcp蛋白位点的复合核苷酸适配体；此步骤由核酸相关业务生物工程公司(上海生工)完成。
39.初步筛选得到mrna aptamer序列包括seq id no:1，具体为uaccaaugaagacggu；
40.上述ms2核苷酸序列如seq id no:2所示，具体为：uguacuccacuaggaguacaggacgucuguacuccacuaggaguaca ugcgucuucgauuccuguacuccacuaggaguaca。
41.实施例2
42.本实施例为包含复合核苷酸适配体序列、cd9-mcp融合蛋白翻译序列的逆转录病毒合成和细胞转染：
43.设计并构建包含初步筛选的数个复合核苷酸适配体序列、cd9-mcp融合蛋白翻译序列的主质粒载体(gfp绿色荧光)，将其与慢病毒辅助包装原件载体质粒(pspax2,pmd2g)分别进行高纯度无内毒素抽提，使用lipo2000共同转染293t工具细胞(项目组实验室保存)，转染后6h更换为完全培养基，培养一段时间后分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，通过超速离心浓缩病毒；
44.将1
×
106的adscs接种于75cm2平皿内，加入5ml培养基，并分别使用moi为50，100，150的病毒对细胞进行转染。
45.上述cd9-mcp融合蛋白的编码序列如seq id no:3所示，具体为：atgccggtcaaagg
aggtagcaagtgcatcaaatacctgctcttcggatttaacttcatcttctggctcgctggcattgcagtgcttgctattggactatggctccgattcgactctcagaccaagagcatcttcgagcaagagaataaccattccagtttctacacaggagtgtacattctgattggagccggggccctcatgatgctggttggtttcctgggctgctgtggagctgtacaagagtcccagtgcatgctgggattgttcttcgggttcctcttggtgatattcgccattgagatagccgccgccgtctggggctatacccacaaggatgaggtgattaaagaactccaggagttttacaaggacacctaccaaaagttacggagcaaggatgaaccccagcgggaaacactcaaagccatccatatggcgttggactgctgtggcatagctggtcctttggagcagtttatctcggacacctgccccaagaaacagcttttggaaagtttccaggttaagccctgccctgaagccatcagtgaggtcttcaacaacaagttccacatcattggagcagtgggtatcggcatcgccgtggtgatgatcttcggcatgatcttcagcatgatcctgtgctgcgccatccgcaggagccgagaaatggtcatggcttcaaactttactcagttcgtgctcgtggacaatggtgggacaggggatgtgacagtggctccttctaatttcgctaatggggtggcagagtggatcagctccaactcacggagccaggcctacaaggtgacatgcagcgtcaggcagtctagtgcccagaagagaaagtataccatcaaggtggaggtccccaaagtggctacccagacagtgggcggagtcgaactgcctgtcgccgcttggaggtcctacctgaacatggagctcactatcccaattttcgctaccaattctgactgtgaactcatcgtgaaggcaatgcaggggctcctcaaagacggtaatcctatcccttccgccatcgccgctaactcaggtatctactag。
46.实施例3
47.本实施例为不同复合核苷酸适配体介导mrna装载效果的进一步验证和筛选：
48.将不同复合核苷酸适配体序列转染的adscs分组，收集无血清细胞培养上清，提取exo
plus
，以原始adscs外泌体exo
orig
作为对照组，通过pcr检测不同组外泌体体中vegf mrna的表达，验证所设计的复合核苷酸适配体向外泌体内装载目标mrna的假设，并最终筛选出一个转载效率最高的复合核苷酸适配体序列进行后续实验，筛选出转载效率最高的复合核苷酸适配体序列：
49.uguacuccacuaggaguacaggacgucuguacuccacuaggaguacaugcgucuucgauuccuguacuccacuaggaguacauaccaaugaagacggu；其与vegf-mrna特异性结合的结构如图2所示。
50.对adsc细胞和adsc外泌体中cd9-mcp表达情况进行western blot检测，检测结果如图3所示；pcr检测adsc细胞和adsc外泌体中vegf-mrna的表达，检测结果如图4所示；
51.由图3、图4可知：cd9-mcp融合蛋白在adsc细胞和adsc外泌体中均成功表达；细胞中和工程化外泌体中vegf mrna表达量均明显升高。
52.实施例4
53.本实施例为复合核苷酸适配体递送vegf-mrna效果的验证：
54.(1)置换外泌体exo
dis
的合成：
55.根据上述复合核苷酸适配体序列，设计合成一条与其高度配对的向导rna序列(grna：augguuacuucugcca)，grna可以竞争性的与适配体结合，并将mrna从结合的适配体上解离下来，从而促进其翻译。将此grna人工合成并使用lipo2000转染入293t工具细胞，收集细胞上清并提取外泌体，使用pcr检测exo
dis
中grna的表达。另外随机设计一序列相似但不配对的grna(cugcaggacgcagaagcuaagg)，转染后作为对照组exo
dis-control
。
56.(2)huvecs的分离、培养、鉴定：
57.使用健康新生儿无菌脐带一根，将脐带使用无菌预冷pbs溶液反复清洗去除血渍；将脐静脉两端剥离出来，pbs溶液冲洗血管内的血凝块；而后将20ml 0.1％的ⅰ型胶原酶溶液缓缓注入静脉腔内，后放入细胞培养箱内消化15分钟；将脐静脉内的消化液吸出，置于
50ml离心管内，4℃，1200转离心5分钟，将离心后的沉淀接种于含egm-2完全培养基的0.1％明胶包被的t25小瓶中，贴壁培养；观察细胞呈铺路卵石样排列，并使用免疫荧光染色和流式细胞术验证细胞表面抗原：cd31和vegf-r2；经鉴定确定为huvecs。
58.(3)exo
plus
和exo
dis
的表征和外泌体内吞试验：
59.使用pkh67或pkh26荧光膜染料对两种外泌体进行染色，将携带荧光信号的外泌体分别与靶细胞huvecs共培养，在固定时间点(6h、12h)将huvecs进行荧光染色，并于荧光显微镜下观察进入细胞的外泌体数量和聚集情况；观察结果如图5所示；
60.由图5可知：工程化外泌体exo
plus
和exo
dis
均能进入靶细胞。
61.(4)置换外泌体的有效性和mrna在靶细胞中成功表达的验证：
62.将上述携带荧光信号的exo
plus
+exo
dis
与huvecs共培养，exo
plus
+exo
dis-control
以及单独使用exo
plus
作为对照组。一段时间后，使用pcr检测靶细胞huvcec中vegf-mrna的表达情况；检测结果如图6所示；
63.由图6可知：使用含有竞争性grna序列的解离外泌体可以明显提高靶细胞中vegf-mrna的含量，而高度配对序列grna的效率是最高的。说明使用exo
dis
可以进一步提高工程化外泌体mrna的传递效率。
64.(5)工程化外泌体在血管新生体外模型中的作用：
65.在12孔板、预包被鼠尾胶原的48孔板、96孔板、transwell中接种huvecs。加入exo
plus
+exo
dis
与huvecs共培养，只使用exo
orig
作为对照组，不使用外泌体作为空白对照组。使用wound healing细胞划痕试验检测细胞迁移能力；使用matrigel成小管试验检测细胞成血管能力；
66.其中，wound healing细胞划痕试验检测结果如图7所示；matrigel成小管试验检测结果如图8所示：
67.由图7、图8可知：携带vegf mrna的工程化外泌体促进huvec细胞增殖和迁移；vegf mrna的工程化外泌体可以提高huvec细胞的体外成血管能力。
68.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术特征：
1.一种装载vegf-mrna的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)采用selex技术筛选针对vegf-mrna的单链核苷酸序列，其中，所述单链核苷酸序列的aug端能够与目标mrna特异性结合；(b)根据rna-蛋白质互作原理选择一个具有颈环结构的ms2核苷酸序列，所述茎环结构能够识别外泌体跨膜蛋白cd9连接的mcp位点；(c)将单链核苷酸序列和ms2核苷酸序列进行链接，得到特异性双向识别vegf-mrna和mcp蛋白位点的复合核苷酸适配体；(d)构建包含所述复合核苷酸适配体序列以及cd9-mcp融合蛋白翻译序列的慢病毒质粒载体，再经细胞转染、培养、收集上清、提取，得到所述装载vegf-mrna外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单链核苷酸序列具体如seq id no:1所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ms2核苷酸序列具体如seq id no:2所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述cd9-mcp融合蛋白的编码序列如seq id no:3所示。5.权利要求1～4任一所述的制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体。6.权利要求1～4任一所述的制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体在制备促进huvec细胞增殖和/或迁移的产品中的应用。7.权利要求1～4任一所述的制备方法制得的装载vegf-mrna的外泌体在制备诱导huvec细胞形成血管的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种装载VEGF-mRNA的外泌体及其制备方法，该制备方法包括采用SELEX技术筛选针对VEGF-mRNA的单链核苷酸序列；根据RNA-蛋白质互作原理选择一个具有颈环结构的MS2核苷酸序列；将单链核苷酸序列和MS2核苷酸序列进行链接，得到特异性双向识别VEGF-mRNA和MCP蛋白位点的复合核苷酸适配体；构建包含所述复合核苷酸适配体序列以及CD9-MCP融合蛋白翻译序列的慢病毒质粒载体，再经细胞转染、培养、收集上清、提取，得到所述装载VEGF-mRNA外泌体；本发明制备方法能够将VEGF-mRNA装载于外泌体中，使得制备得到的外泌体能够促进HUVEC细胞增殖和迁移，同时能够更好的诱导HUVEC细胞形成血管。HUVEC细胞形成血管。HUVEC细胞形成血管。


技术研发人员：韩愚弟 杨铮 许育健
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第一医学中心
技术研发日：2023.02.24
技术公布日：2023/7/19