一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法。


背景技术：

2.辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)，分布于植物界，辣根中含量较高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，分子量40kda左右，糖含量18％。由于辣根过氧化物酶与特定的底物反应，能产生有颜色或发光的产物，使得其在分子生物学和蛋白质研究中主要应用于免疫测定和其他基于探针的测定技术(例如elisa、western印迹、emsa和southern印迹)。
3.目前市面上传统的辣根过氧化物酶标记物多与抗体进行偶联。此偶联方式多利用抗体或酶上的氨基或巯基进行定向偶联。由于抗体分子大小不同，以及不同抗体上游离氨基巯基数量的限制，一个抗体上往往只能连接1-2个hrp分子，一定程度上会影响到检测的灵敏性。此外，利用抗体偶联后进行后续检测，抗体的非特异性吸附会使得检测底色偏高，影响检测质量。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，针对传统偶联方法的不足，提出一种新的辣根过氧化物酶标记物及其制备方法，从而达到简化纯化流程，增加检测灵敏性，降低检测底色的目的。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，将辣根过氧化物酶糖基化上的羟基氧化成醛基，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。
7.进一步地，所述氧化剂为高碘酸钠，优选为高碘酸钠；所述辣根过氧化物酶与所述氧化剂的摩尔比为1∶(2～500)，优选为优选1∶(50～200)，更优选1∶(50～100)。
8.进一步地，所述氧化在避光环境中进行，温度为2～25℃，时间为1～6h，优选为2～5h，更优选为3～4h。
9.之所以在避光环境中进行氧化，是由于氧化剂高碘酸钠遇光容易分解。
10.进一步地，所述辣根过氧化物酶与所述生物素酰肼的摩尔比为1∶(10～500)，优选为1∶(100～400)，更优选为1∶(200～300)。
11.进一步地，所述偶联反应的温度为10～25℃，时间为2～24h，优选为2～10小时，更优选为2～4小时。
12.进一步地，所述氧化在缓冲液体系中进行；所述缓冲液体系为5～100mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲液，优选为10～50mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲液，更优选为10～20mmol/l醋酸-醋
酸钠缓冲液。
13.进一步地，所述氧化和所述偶联反应后均还包括纯化的操作，其中氧化后进行纯化是为了除去多余的氧化剂，偶联反应后进行纯化是为了除去多余的生物素酰肼，以得到纯化的生物素化辣根过氧化物酶。
14.进一步地，所述纯化方法为透析或超滤，优选为透析；所述纯化在2～8℃下进行。
15.更进一步地，所述透析采用的透析袋截留分子量为3～30kda，优选为10～20kda；透析液体积为反应液体积的50～500倍，优选为100～400倍，更优选为200～300倍；透析时间为6～24h，优选为10～24h，更优选为18～24h。
16.本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制备得到的生物素化辣根过氧化物酶。
17.本发明同时提供了上述所述的生物素化辣根过氧化物酶在检测带有链霉亲和素的抗原及抗体中的应用。
18.本发明所涉及的辣根过氧化物酶主要来源于辣根植物，是一种分子量约为40kda的糖蛋白，含糖量约为18％。本发明的原理是利用高碘酸钠将蛋白糖基化的羟基氧化成醛基，然后利用生物素酰肼的酰肼基团与醛基形成永久性的席夫碱(schiff base)。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明采用生物素小分子与辣根过氧化物酶形成缀合物，辣根过氧化物酶反应完全，使得纯化方法简单易行；辣根过氧化物酶生物素化过程不影响辣根过氧化物酶酶活性，小分子物质偶联蛋白后，对蛋白活性几乎不影响，故产物活性保留率较高；生物素化的产物与链霉亲和素的定向结合能力强，能有效检测带有链霉亲和素的抗原及抗体；并且小分子物质几乎不存在非特异性结合，能有效降低检测底色，降低错检率。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为实施例1制备得到的生物素化hrp使用st3纯化柱纯化电泳图；
23.图2为实施例2制备得到的生物素化hrp应用于狭缝印迹实验显色中所得结果图。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
25.另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规
技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.以下实施例中，所采用的辣根过氧化物酶购自阿拉丁试剂平台，分子量约44kda，含糖量为约18％；所采用的生物素酰肼购自阿拉丁试剂平台。以下不再重复描述。
30.实施例1
31.生物素化辣根过氧化物酶的制备，步骤如下：
32.(1)取2mg(0.0455微摩尔)辣根过氧化物酶溶解于1ml 0.02mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入1ml 0.02mol/l naio4溶液，2℃避光反应2小时。
33.(2)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph 7.40)，在2℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析24h。
34.(3)取0.2ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml步骤(2)透析后的溶液，混匀，10℃反应2h。
35.(4)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph 7.40)，在2℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析24h，得到生物素化辣根过氧化物酶(生物素化hrp)。
36.实施例2
37.生物素化辣根过氧化物酶的制备，步骤如下：
38.(1)取2mg辣根过氧化物酶溶解于1ml 0.02mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入1ml 0.02mol/l naio4溶液，10℃避光反应2小时。
39.(2)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在4℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约16h。
40.(3)取0.4ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml上述透析后的溶液，混匀，15℃反应2h。
41.(4)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在4℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约16h。得到生物素化辣根过氧化物酶。
42.实施例3
43.生物素化辣根过氧化物酶的制备，步骤如下：
44.(1)取4mg辣根过氧化物酶溶解于3ml 0.02mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入1ml 0.02mol/l naio4溶液，10℃避光反应2小时。
45.(2)反应后的样品倒入3kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积300倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在10℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约20h。
46.(3)取0.1ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml上述透析后的溶液，混匀，20℃反应2h。
47.(4)反应后的样品倒入3kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积300倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在10℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约20h。得到生物素化辣根过氧化物酶。
48.实施例4
49.生物素化辣根过氧化物酶的制备，步骤如下：
50.(1)取4mg辣根过氧化物酶溶解于3.5ml 0.02mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入0.5ml 0.02mol/l naio4溶液，25℃避光反应4h。
51.(2)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在25℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约24h。
52.(3)取0.2ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml上述透析后的溶液，混匀，25℃反应4h。
53.(4)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.01mol/l pbs，ph7.40)，在25℃℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约24h。得到生物素化辣根过氧化物酶。
54.实施例5
55.(1)取4mg辣根过氧化物酶溶解于3.8ml 0.1mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入0.2ml 0.02mol/l naio4溶液，15℃避光反应2小时。
56.(2)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.1mol/l pbs，ph7.40)，在15℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约20h。
57.(3)取0.05ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml上述透析后的溶液，混匀，15℃反应6h。
58.(4)反应后的样品倒入7kd透析袋中，用封口夹夹住透析袋两侧，用约为样品体积200倍的透析液(0.1mol/l pbs，ph7.40)，在15℃条件下，用磁力搅拌器搅拌透析约20h。得到生物素化辣根过氧化物酶。
59.实施例6
60.(1)取4mg辣根过氧化物酶溶解于3.9ml 0.1mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 5.50)，加入0.1ml 0.02mol/l naio4溶液，15℃避光反应2小时。
61.(2)反应后的样品倒入3kd超滤管中，每支加入1ml反应液，共两支，10000rpm，10℃超滤，至超滤管内样品约100μl时，加入900μl 0.1mol/lpbs，ph7.40，继续同条件超滤至100μl，加入900μl 0.1mol/l pbs，ph7.40，混匀，将样品从超滤管取出，待用。
62.(3)取0.2ml生物素酰肼溶液(0.05mol/l)，加入1.8ml上述超滤后的溶液，混匀，15℃反应6h。
63.(4)反应后的样品倒入3kd超滤管中，每支加入1ml反应液，共两支，10000rpm，10℃超滤，至超滤管内样品约100μl时，加入900μl 0.1mol/lpbs，ph7.40，继续同条件超滤至100μl，加入900μl 0.1mol/l pbs，ph7.40，混匀，将样品从超滤管取出，得到生物素化辣根过氧化物酶。
64.对比例1
65.同实施例1，区别在于，仅进行步骤(1)～(2)的操作。即，仅对辣根过氧化物酶进行氧化处理，不进行生物素化处理，得到仅氧化处理的hrp。
66.效果验证
67.1.生物素化hrp进行st3填料纯化，st3填料能特异性结合生物素，并部分可以被d-生物素竞争性洗脱。并将纯化收集样品进行sds-page检测，具体步骤如下：
68.(1)取st3填料1ml，装入纯化柱中，纯水冲洗3ml，0.01mol/l pbs，ph7.40冲洗纯化柱3ml，待上样。
69.(2)取实施例1制备得到的生物素化hrp 2ml，上样至处理完的st3纯化柱，收集流穿样品2ml，用0.01mol/l pbs，ph7.40平衡纯化柱3ml，收集平衡样品3ml。
70.(3)用50mmol/l d-生物素水溶液、ph8.00洗脱纯化柱3ml，收集洗脱样品3ml。
71.(4)往纯化柱中加入1ml 0.01mol/l pbs，ph7.40，与填料混匀后取样。
72.(5)将流穿样品，平衡样品，洗脱样品，填料样品各40微升，分别加入20微升3x还原loading buffer后沸水浴3分钟，采用12％ sds-page后用考马斯亮蓝染色，观察条带，如图1，其中，1为分子量mark，2为纯化前样品，3为纯化流穿样品，4为纯化平衡样品，5为1m氯化钠溶液洗脱样品，6为50mm d-生物素洗脱样品，6为纯化后填料样品(st3纯化柱能特异性结合生物素)。
73.由图1可以看出，生物素化hrp实验产物能与st3纯化柱结合，说明hrp成功与生物素偶联，并具备与链霉亲和素定向结合的能力。
74.实施例2～6制备得到的生物素化hrp使用st3纯化柱纯化电泳图与实施例1的生物素化hrp的电泳图基本一致。
75.2.生物素化hrp进行狭缝免疫印记是将链霉亲和素类产品固定于硝酸纤维素膜上，然后用生物素化的hrp进行孵育，使生物素与链霉亲和素结合。再将膜置于含有二氨基联苯胺(dab)与双氧水的染色液中，因hrp能将dab中的氢供给h2o2使无色的dab在酶处形成红褐色的沉淀。具体步骤如下：
76.(1)取一张nc膜，使用狭缝转印仪将链霉亲和素转印至nc膜，蛋白量分别为1μg，0.5μg，0.2μg，0.1μg，0.05μg。
77.(2)将实施例1、2所得生物素化hrp产品用100mm tris-hcl，150mm nacl，0.05％tween-20，ph7.50，1：2000稀释，将(1)中nc膜放入稀释的生物素化hrp溶液中，孵育25℃孵育1小时。
78.(3)将膜转入新配的dab显色液(5mgdab溶于10ml 0.1m ph7.50tris-hcl中，加15ul 30％ h2o2)中，25℃下避光显色5～10分钟，待斑点出现后可显色液，用超纯水冲洗nc膜3-5次，终止显色，拍照记录，见图2。
79.采用上述相同方法，对市面上其他hrp缀合物(利用-nhs(琥珀酰亚胺基)与辣根过氧化物酶的氨基定向偶联制备的生物素化hrp)以及本发明采用的辣根过氧化物酶原料(记为hrp)和对比例1得到的仅氧化处理的hrp进行狭缝免疫印记实验，结果如图2。
80.图2结果说明本方法制备的生物素化hrp偶联成功，并且具有活性，且对比市面上其他hrp缀合物，效果更佳。
81.采用上述相同方法对实施例3～6制备得到的生物素化hrp进行狭缝免疫印记实验，所得结果与实施例1和2的生物素化hrp的结果基本一致。
82.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠，所述辣根过氧化物酶与所述氧化剂的摩尔比为1∶(2～500)。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化在避光环境中进行，温度为2～25℃，时间为1～6h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶与所述生物素酰肼的摩尔比为1∶(10～500)。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为10～25℃，时间为2～24h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化在缓冲液体系中进行；所述缓冲液体系为5～100mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲液。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化和所述偶联反应后均还包括纯化的操作。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化方法为透析或超滤。9.一种根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的生物素化辣根过氧化物酶。10.权利要求9所述的生物素化辣根过氧化物酶在检测带有链霉亲和素的抗原及抗体中的应用。

技术总结
本发明公开了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，属于生物医药技术领域。所述制备方法包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。本发明采用生物素小分子与辣根过氧化物酶形成缀合物，辣根过氧化物酶反应完全，使得纯化方法简单；辣根过氧化物酶生物素化过程不影响辣根过氧化物酶酶活性，小分子物质偶联蛋白后，对蛋白活性几乎不影响，产物活性保留率较高；生物素化的产物与链霉亲和素的定向结合能力强，能有效检测带有链霉亲和素的抗原及抗体；并且小分子物质几乎不存在非特异性结合，能有效降低检测底色，降低错检率。错检率。错检率。


技术研发人员：钱永常 钟达 来灿钢 林定
受保护的技术使用者：杭州纽龙生物科技有限公司
技术研发日：2022.12.31
技术公布日：2023/7/19