多肽化合物及其医药用途的制作方法

多肽化合物及其医药用途
1.本公开要求申请日为2022年01月11日的中国专利申请202210026680.9的优先权，本公开引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
2.本公开属于医药领域，涉及一种多肽化合物、其制备方法、含有多肽化合物的药物组合物或试剂盒，以及其作为治疗剂的用途，特别是用于治疗和/或预假单胞菌感染或与假单胞菌感染相关疾病的受试者的用途，特别是铜绿假单胞菌感染或与铜绿假单胞菌感染相关疾病的受试者的用途。


背景技术：

3.细菌的抗药性在全世界成为一个普遍性的挑战。由于细菌利用多种机制产生抗药性，现有的抗生素在临床上疗效逐渐降低。世界卫生组织who列举了一系列的抗菌性较强的菌种，铜绿假单胞菌就是其中一种。
4.医源性肺炎，包括的医院获得性肺炎(habp)和呼吸机相关肺炎(vabp)是最常见的医院获得性感染，而铜绿假单胞菌是最常见的病原菌。
5.现在已有的治疗手段包括头孢菌素类，β-内酰胺酶抑制剂，氨基糖苷类，多黏菌素类等。然而铜绿假单胞菌具有高通透性以及有效的将药物转运出细胞外的机制，从而导致其容易产生抗药性。据统计从医院获得性肺炎患者分离出的铜绿假单胞菌菌株中，30％的为多重耐药菌株(mdr)。mdr-pa感染的患者约20万人/年，广泛耐药xdr-pa感染的患者约2.5万人/年。因此临床上对有效治疗铜绿假单胞菌感染的治疗药物有急切需求。
6.多黏菌素b是先有治疗铜绿假单胞菌感染常用抗生素。但是其毒性比较明显，包括肾毒性以及神经毒性。而且多粘菌素b对一系列革兰氏阴性菌有杀菌效果，并非特异性针对铜绿假单胞菌。
7.为了满足临床需求，仍需要开发毒性更小，且针对铜绿假单胞菌的特异性药物以满足医源性肺炎的治疗。


技术实现要素：

8.本公开提供一种化合物：
9.或其药学上可接受的盐：
10.其中，x1至x
14
各自独立地选自天然氨基酸、非天然的氨基酸、氨基酸类似物，其中，
11.表示x1与x
14
通过共价键或非共价键连接；
12.且表示x3与x9共价键或非共价键连接；；
13.x1为thr、thr，一些具体的实施方案中，选自dthr；
14.x2为trp、dtrp，一些具体的实施方案中，选自trp；
15.x8为trp、dtrp，一些具体的实施方案中，选自trp。
16.一些实施方案中，x1与x
14
共价连接，例如通过x1的α氨基与x
14
的α羧基之间的酰胺键连接。
17.一些实施方案中，x3与x9通过共价相互作用(例如链间键合)或通过静电相互作用(例如盐桥)连接。
18.一些实施方案中，x3与x9通过形成链间键连接；一些实施方案中，链间键用于稳定构象；一些实施方案中，链间键选自共价键合，包括但不限于二硫键、酰胺键、三唑。
19.一些实施方案中，x
12
为ser、dser，一些具体的实施方案中，选自ser。
20.一些实施方案中，x4、x5、x6、x7、x
10
、x
11
各自独立地选自正电荷氨基酸。
21.一些实施方案中，x4、x5、x6、x7、x
10
、x
11
各自独立地选自ala、dala、lys、dlys、arg、darg、his、dhis、orn、dorn、dab、ddab、harg、dharg、hlys、dhlys、dap、ddap、dbu、ddbu、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmearg、nmedarg、nmedab或nmeddab。
22.一些实施方案中，x
13
选自脂肪族非极性氨基酸。
23.一些实施方案中，x
13
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、lys、ser、gly、aib、dlys、dser、dgly、daib。
24.一些实施方案中，x
14
选自脂肪族非极性氨基酸、芳香族非极性氨基酸。
25.一些实施方案中，x
14
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、tle、dtle、his、dhis、phe、dphe、trp、dtrp、tyr、dtyr、thi、dthi、bip、dbip、nva、dnva、aib、daib、pip、dpip、hphe、dhphe、htrp、dhtrp、htyr、dhtyr、hhis、dhhis、1-nal、2-nal、dip、1-d
nal、2-d
nal、ddip。
26.一些实施方案中，x3与x9通过b1连接，如式ii所示：
[0027][0028]
其中，其中x1至x
14
如上文所定义；
[0029]
其中b1选自：
[0030]
*-ch
2-s-s-ch
2-**；
[0031]
*-ch
2-s-s-(ch2)
2-**；
[0032]
*-(ch2)
2-s-s-ch
2-**；
[0033]
*-(ch2)
2-s-s-(ch2)
2-**；
[0034]
*-ch
2-s-s-c(ch3)
2-**；
[0035]
*-c(ch3)
2-s-s-ch
2-**；
[0036]
*-c(ch3)
2-s-s-c(ch3)
2-**；
[0037]
*-(ch2)
2-s-s-c(ch3)
2-**；
[0038]
*-c(ch3)
2-s-s-(ch2)
2-**；
[0039]
*-ch
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-**；
[0040]
*-ch
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-**；
[0041]
*-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-**；
[0042]
*-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-**；
[0043]
*-ch
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-**；
[0044]
*-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-**；
[0045]
*-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-**；
[0046]
*-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-**；和
[0047]
*-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-**；其中，z为1、2、3、4或5；并且其中*和**分别表示x3和x9的主链氨基酸α-碳原子。
[0048]
一些实施方案中，z为1。
[0049]
一些实施方案中，x3与x9通过b1共价连接，其中b1包含二硫键(-s-s-)或亚甲基桥(-s-ch
2-s-)。
[0050]
一些实施方案中，x1与x
14
通过共价键如x1的α氨基与x
14
的α羧基之间的酰胺键连接。
[0051]
一些实施方案中，本公开提供式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0052][0053]
其中，
[0054]
x1为thr、thr，一些实施方案中，选自dthr；
[0055]
x2为trp、dtrp，一些实施方案中，选自trp；
[0056]
x4、x5、x6、x7、x
10
、x
11
各自独立地选自ala、dala、lys、dlys、arg、darg、his、dhis、orn、dorn、dab、ddab、harg、dharg、hlys、dhlys、dap、ddap、dbu、ddbu、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmearg、nmedarg、nmedab或nmeddab；
[0057]
x8为trp、dtrp，一些实施方案中，选自trp；
[0058]
x
12
为ser、dser，一些实施方案中，选自ser；
[0059]
x
13
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、lys、ser、gly、aib、dlys、dser、dgly、daib；
[0060]
x
14
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、tle、dtle、his、dhis、phe、dphe、trp、dtrp、tyr、dtyr、thi、dthi、bip、dbip、nva、dnva、aib、daib、pip、dpip、hphe、dhphe、htrp、dhtrp、htyr、dhtyr、hhis、dhhis、1-nal、2-nal、dip、1-d
nal、2-d
nal、ddip；
[0061]
x1与x
14
连接；
[0062]
r1、r2各自独立地选自键、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-s-、-o-、-nh-，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基任选被一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤素、羟基、氰基、氨基和硝基的取代基取代；
[0063]
r3、r4各自独立地选自键、-s-、-o-、-nh-；
[0064]
r5选自键、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、其中，l1和l2各自独立地选自键、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基；
[0065]
所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基任选被一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤素、羟基、氰基、氨基和硝基的取代基取代。
[0066]
一些实施方案中，式i所示的化合物或其药学上可接受的盐选自
[0067]
[0068][0069]
一些实施方案中，x1与x
14
共价连接。
[0070]
一些实施方案中，x1与x
14
通过x1的α氨基与x
14
的α羧基之间的酰胺键连接。
[0071]
一些实施方案中，x4选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab；优选各自独立地选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0072]
一些实施方案中，x5选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab；优选各自独立地选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0073]
一些实施方案中，x6选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab；优选各自独立地选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0074]
一些实施方案中，x7选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab；优选各自独立地选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0075]
一些实施方案中，x
4-x
5-x
6-x7选自：
[0076]
lys-lys-lys-lys、orn-orn-orn-orn、dab-dab-dab-dab、dab-orn-dab-dab、ddab-orn-dab-dab、dab-d
orn-dab-dab、dab-orn-d
dab-dab、dab-orn-dab-d
dab、dab-dab-orn-dab、ddab-dab-orn-dab、dab-d
dab-orn-dab、dab-dab-d
orn-dab、dab-dab-orn-d
dab。
[0077]
一些实施方案中，x
10
选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab。
[0078]
一些实施方案中，x
10
选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0079]
一些实施方案中，x
10
选自lys、orn、dab。
[0080]
一些实施方案中，x
11
选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab、hlys、dhlys、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmedab或nmeddab。
[0081]
一些实施方案中，x
11
选自lys、dlys、orn、dorn、dab、ddab。
[0082]
一些实施方案中，x
11
选自lys、orn、dab。
[0083]
一些实施方案中，x
11
选自dab。
[0084]
一些实施方案中，x
10-x
11
选自：
[0085]
lys-dab、dab-dab、dab-lys或lys-lys。
[0086]
一些实施方案中，x
13
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle。
[0087]
一些实施方案中，x
13
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、val、dval。
[0088]
一些实施方案中，x
13
选自ala、dala、abu、dabu。
[0089]
一些实施方案中，x
14
选自abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、val、dval、phe、dphe、tle、dtle、nle、dnle、cha、dcha、nva、dnva、hile、dhile、hleu、dhleu、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、hphe、dhphe。
[0090]
一些实施方案中，x
14
选自ile、dile、leu、dleu、val、dval、nle、dnle、nva、dnva。
[0091]
一些实施方案中，x
14
选自ile、dile。
[0092]
一些实施方案中，x
13-x
14
选自：
[0093]
ala-ile、dala-ile、abu-ile、dabu-ile、ala-d
ile、dala-d
ile、abu-d
ile、dabu-d
ile、ile-ile、dile-ile、ile-d
ile、dile-d
ile、leu-ile、dleu-ile、leu-d
ile、dleu-d
ile、val-ile、dval-ile、val-d
ile、dval-d
ile。
[0094]
一些实施方案中，r1选自键、c
1-c6亚烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚炔基，所述c
1-c6亚烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚炔基任选被一个或多个选自羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤素、氰基、氨基和硝基的取代基取代；
[0095]
一些实施方案中，r1选自c
1-c6亚烷基，所述c
1-c6亚烷基任选被一个或多个c
1-c6烷基取代。
[0096]
一些实施方案中，r1选自键、-ch
2-、-ch(ch3)-、-c(ch3)
2-、-ch
2-ch
2-、-ch(ch3)-ch
2-、-c(ch3)
2-ch
2-、-(ch2)
3-、-(ch2)
4-。
[0097]
一些实施方案中，r2选自键、c
1-c6亚烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚炔基，所述c
1-c6亚烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚炔基任选被一个或多个选自羟基、c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤素、氰基、氨基和硝基的取代基取代。
[0098]
一些实施方案中，r2选自选自c
1-c6亚烷基，所述c
1-c6亚烷基任选被一个或多个c
1-c6烷基取代。
[0099]
一些实施方案中，r2选自键、-ch
2-、-ch(ch3)-、-c(ch3)
2-、-ch
2-ch
2-、-ch(ch3)-ch
2-、-c(ch3)
2-ch
2-、-(ch2)
3-、-(ch2)
4-。
[0100]
一些实施方案中，r3选自键、-s-。
[0101]
一些实施方案中，r4选自键、-s-。
[0102]
一些实施方案中，r5选自键、
[0103]
其中，l1和l2各自独立地选自键、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基；
[0104]
所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基任选被一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤素、羟基、氰基、氨基和硝基的取代基取代。
[0105]
一些实施方案中，l1和l2各自独立地选自键、c
1-c6亚烷基亚烷基，所述c
1-c6亚烷基任选被一个或多个c1-c6烷基取代。
[0106]
一些实施方案中，l1选自键、-ch
2-、-ch(ch3)-、-c(ch3)
2-、-ch
2-ch
2-、-ch(ch3)-ch
2-、-c(ch3)
2-ch
2-、-(ch2)
3-、-(ch2)
4-。
[0107]
一些实施方案中，l2选自键、-ch
2-、-ch(ch3)-、-c(ch3)
2-、-ch
2-ch
2-、-ch(ch3)-ch
2-、-c(ch3)
2-ch
2-、-(ch2)
3-、-(ch2)
4-。
[0108]
一些实施方案中，-r
1-r
3-r
5-r
4-r
2-选自：
[0109]-ch
2-s-s-ch
2-；
[0110]-ch
2-s-s-(ch2)
2-；
[0111]-(ch2)
2-s-s-ch
2-；
[0112]-(ch2)
2-s-s-(ch2)
2-；
[0113]-ch
2-s-s-c(ch3)
2-；
[0114]-c(ch3)
2-s-s-ch
2-；
[0115]-c(ch3)
2-s-s-c(ch3)
2-；
[0116]-(ch2)
2-s-s-c(ch3)
2-；
[0117]-c(ch3)
2-s-s-(ch2)
2-；
[0118]-ch
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-；
[0119]-ch
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-；
[0120]-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-；
[0121]-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-；
[0122]-ch
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-；
[0123]-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-ch
2-；
[0124]-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-；
[0125]-(ch2)
2-s-(ch2)
z-s-c(ch3)
2-；和
[0126]-c(ch3)
2-s-(ch2)
z-s-(ch2)
2-；其中，z为1、2、3、4或5。
[0127]
一些实施方案中，-r
1-r
3-r
5-r
4-r
2-选自：
[0128][0129]
一些实施方案中，-r
1-r
3-r
5-r
4-r
2-选自：
[0130]
[0131]
[0133]
[0134][0135]
一些实施方案中，本公开提供化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
[0136]
99.99％的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述的药物组合物含有0.1％-99.9％的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述的药物组合物含有0.5％-99.5％的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述的药物组合物含有1％-99％的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述的药物组合物含有2％-98％的药学上可接受的赋形剂。
[0142]
本公开提供了前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物，用于抑制微生物的生长或杀灭微生物；在某些实施方案中，所述微生物为假单胞菌，假单胞菌，包括(但不限于)荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)；在某些实施方案中，所述微生物为铜绿假单胞菌。
[0143]
本公开前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物，对铜绿假单胞菌具有高度选择性。
[0144]
本公开提供了前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物，用于具有抗生素活性的药物活性物质。
[0145]
本公开提供了前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物，用于在受试者中治疗和/或预防感染；在某些实施方案中，所述感染与铜绿假单胞菌感染相关；在某些实施方案中，所述感染选自医院感染、导管相关和非导管相关的感染、尿路感染、血流感染、呼吸机相关性肺炎(vap)、呼吸机相关性细菌性肺炎(vabp)、医院获得性肺炎(hap)、医院获得性细菌性肺炎(habp)、医疗保健相关性肺炎(hcap)、囊性纤维化、肺气肿、哮喘、肺炎、流行性腹泻、坏死性小肠结肠炎、盲肠炎、胃肠炎、胰腺炎、角膜炎、眼内炎、耳炎、脑脓肿、脑膜炎、脑炎、骨软骨炎、心包炎、附睾炎、前列腺炎、尿道炎、脓毒症、手术伤口、创伤性伤口、烧伤。
[0146]
本公开提供了一种产品，其含有前述化合物或其药学上可接受的盐，用作杀菌剂、消毒剂或防腐剂。
[0147]
本公开提供了一种抑制微生物的生长或杀灭微生物的方法，包括给与前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物；在某些实施方案中，所述微生物为假单胞菌，假单胞菌，包括(但不限于)荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)；在某些实施方案中，所述微生物为铜绿假单胞菌。
[0148]
本公开提供了一种治疗和/或预防感染的方法，包括给与受试者前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物；在某些实施方案中，所述感染与铜绿假单胞菌感染相关；在某些实施方案中，所述感染选自医院感染、导管相关和非导管相关的感染、尿路感染、血流感染、呼吸机相关性肺炎(vap)、呼吸机相关性细菌性肺炎(vabp)、医院获得性肺炎(hap)、医院获得性细菌性肺炎(habp)、医疗保健相关性肺炎(hcap)、囊性纤维化、肺气肿、哮喘、肺炎、流行性腹泻、坏死性小肠结肠炎、盲肠炎、胃肠炎、胰腺炎、角膜炎、眼内炎、耳炎、脑脓肿、脑膜炎、脑炎、骨软骨炎、心包炎、附睾炎、前列腺炎、尿道炎、脓毒症、手术伤口、创伤性伤口、烧伤。
[0149]
本公开提供了前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物物在制备用于抑制微生物的生长或杀灭微生物的药物中的用途；在某些实施方案中，所述微生物为假
单胞菌，假单胞菌，包括(但不限于)荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)；在某些实施方案中，所述微生物为铜绿假单胞菌。
[0150]
本公开提供了前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物物在制备用于治疗和/或预防感染的药物中的用途；在某些实施方案中，所述感染与铜绿假单胞菌感染相关；在某些实施方案中，所述感染选自医院感染、导管相关和非导管相关的感染、尿路感染、血流感染、呼吸机相关性肺炎(vap)、呼吸机相关性细菌性肺炎(vabp)、医院获得性肺炎(hap)、医院获得性细菌性肺炎(habp)、医疗保健相关性肺炎(hcap)、囊性纤维化、肺气肿、哮喘、肺炎、流行性腹泻、坏死性小肠结肠炎、盲肠炎、胃肠炎、胰腺炎、角膜炎、眼内炎、耳炎、脑脓肿、脑膜炎、脑炎、骨软骨炎、心包炎、附睾炎、前列腺炎、尿道炎、脓毒症、手术伤口、创伤性伤口、烧伤。
[0151]
本公开治疗和/或预防方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、患者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
[0152]
本公开还提供了一种前述化合物或其药学上可接受的盐或前述药物组合物的方法，所述方法包括：链前体肽链合成、切割；线性前体骨链环化与分子内二硫键形成，肽的纯化制备。
[0153]
一些实施方案中，包括以下步骤：
[0154]
步骤1：2-(丁基氨基)乙硫醇linker耦连：
[0155]
步骤2：直链前体肽链合成：
[0156]
步骤3：直链前体肽链切割：
[0157]
步骤4：c端硫脂功能基团的形成；
[0158]
步骤5：线性前体骨链环化与分子内二硫键形成；
[0159]
步骤6：肽的纯化制备；
[0160]
步骤7：检测与表征方法。
[0161]
本公开中所述化合物可药用盐选自无机盐或有机盐，本公开所述化合物可与酸性或碱性物质反应成相应盐。
[0162]“与酸性化合物反应而生成相应的盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于：甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。可通过本领域已知的方法制备这些盐。
[0163]“与碱性化合物反应而生成相应的盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于：伯胺、仲胺、叔胺、取代的胺、环状胺；例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇
胺、乙二胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。可通过本领域已知的方法制备这些盐。
[0164]
另一方面，本公开提供一种化合物：
[0165]
x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14
，或其药学上可接受的盐：
[0166]
其中，x1至x
14
各自独立地选自天然氨基酸、非天然的氨基酸、氨基酸类似物，其中，
[0167]
x1为thr、thr，一些具体的实施方案中，选自dthr；
[0168]
x2为trp、dtrp，一些具体的实施方案中，选自trp；
[0169]
x8为trp、dtrp，一些具体的实施方案中，选自trp。
[0170]
一些实施方案中，x3与x9选自能通过共价相互作用形成链间键的天然氨基酸、非天然的氨基酸、氨基酸类似物；一些实施方案中，链间键选自共价键合，包括但不限于二硫键、酰胺键、三唑。
[0171]
一些实施方案中，x3与x9选自半胱氨酸、半胱氨酸类似物。
[0172]
一些实施方案中，x3与x9通过形成链间键连接；一些实施方案中，链间键用于稳定构象；一些实施方案中，
[0173]
一些实施方案中，x
12
为ser、dser，一些具体的实施方案中，选自ser。
[0174]
一些实施方案中，x4、x5、x6、x7、x
10
、x
11
各自独立地选自正电荷氨基酸。
[0175]
一些实施方案中，x4、x5、x6、x7、x
10
、x
11
各自独立地选自ala、dala、lys、dlys、arg、darg、his、dhis、om、dorn、dab、ddab、harg、dharg、hlys、dhlys、dap、ddap、dbu、ddbu、aclys、daclys、nmelys、nmedlys、nmearg、nmedarg、nmedab或nmeddab。
[0176]
一些实施方案中，x
13
选自脂肪族非极性氨基酸。
[0177]
一些实施方案中，x
13
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、lys、ser、gly、aib、dlys、dser、dgly、daib。
[0178]
一些实施方案中，x
14
选自脂肪族非极性氨基酸、芳香族非极性氨基酸。
[0179]
一些实施方案中，x
14
选自ala、dala、abu、dabu、ile、dile、leu、dleu、met、dmet、val、dval、tbua、dtbua、tbug、dtbug、cha、dcha、nle、dnle、hala、dhala、hile、dhile、hleu、dhleu、hmet、dhmet、hval、dhval、hcha、dhcha、hnle、dhnle、tle、dtle、his、dhis、phe、dphe、trp、dtrp、tyr、dtyr、thi、dthi、bip、dbip、nva、dnva、aib、daib、pip、dpip、hphe、dhphe、htrp、dhtrp、htyr、dhtyr、hhis、dhhis、1-nal、2-nal、dip、1-d
nal、2-d
nal、ddip。
[0180]
一些实施方案中，化合物选自：
[0181]
t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-a-i；
[0182]
t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-abu-i；
[0183]
t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-d
abu-i；
[0184]
t-w-c-dab-orn-d
dab-dab-w-c-dab-dab-s-a-i；
[0185]
t-w-c-dab-orn-d
dab-dab-w-c-dab-dab-s-abu-i。
[0186]
另一方面，本公开还涉及本公开化合物在储存、运输、体内代谢过程中，不稳定化学键断裂后获得的产物，不稳定化学键包括但不限于二硫键、二硫键、酰胺键、三唑。
[0187]
另一方面，在不指明构型的情况下，本公开化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本公开设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(r)-和(s)-对映体、非对映异构体、(d)-异构体、(l)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本公开的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。除非另有说明，所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本公开的范围之内。
[0188]
另外，本公开的化合物和中间体还可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含于本公开的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指可经由低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移的互变，如酮-烯醇及亚胺-烯胺、内酰胺-内酰亚胺异构化。内酰胺-内酰亚胺平衡实例是在如下所示的a和b之间。
[0189][0190]
本公开中的所有化合物可以被画成a型或b型。所有的互变异构形式在本公开的范围内。化合物的命名不排除任何互变异构体。
[0191]
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。在不指明构型的情况下，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
[0192]
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(r)-和(s)-异构体以及d和l异构体。如果想得到本公开某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
[0193]
本公开还包括一些与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本公开化合物。可结合到本公开化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
31
p、
32
p、
35
s、
18
f、
123
i、
125
i和
36
cl等。
[0194]
除另有说明，当一个位置被特别地指定为氘(d)时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即，至少10％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘、至少2000倍的丰度的氘、至少3000倍的丰度的氘、至少4000倍的丰度的氘、至少5000倍的丰度的氘、至少6000倍的丰度的氘或更高丰度的氘。本公开还包括各种氘化形式的式i化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原
乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0204]
术语“烷氧基”指-o-(烷基)和-o-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。同理，“炔氧基”、“烯氧基”、“环烷氧基”、“杂环烷氧基”、“环烯氧基”的定义如上述“烷氧基”定义。
[0205]
术语“烯基”指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少一个碳-碳双键，并且具有2-10个碳原子。在这样的基团中可以存在多达5个碳-碳双键。例如，“c
2-c
6”烯基被定义为具有2-6个碳原子的烯基。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。烯基的直链、支链或环状部分可以含有双键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
[0206]
术语“炔基”指直链或支链的烃基，其含有2-10个碳原子并且含有至少一个碳-碳三键。可以存在多达5个碳-碳三键。因此，“c
2-c6炔基”表示具有2-6个碳原子的烯基。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。炔基的直链、支链部分可以含有正常化合价所允许的三键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
[0207]
术语“环烷基”或“碳环”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至7个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。环烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，优选一个或多个以下基团，独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
[0208]
所述环烷基环可以稠合于芳基或杂芳基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
[0209]
术语“杂环烷基”或“杂环”或“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含3至7个环原子。单环杂环烷基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环烷基包括螺环、稠环和桥环的杂环烷基。“杂环烷基”非限制性实例包括：
[0210][0211]
等等。
[0212]
所述杂环烷基环可以稠合于芳基或杂芳基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环烷基，其非限制性实例包括：
[0213]
等。
[0214]
杂环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
[0215]
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享
毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至12元，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环烷基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
[0216][0217]
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
[0218]
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为6至12元，更优选为5元或6元。例如。其非限制性实例包括：咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基(oxazolyl)、异噁唑基(isoxazolyl)、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基、三唑基、吲唑基、苯并咪唑基、等。
[0219]
所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环烷基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
[0220][0221]
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
2-6
烯氧基、c
2-6
炔氧基、c
3-6
环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、c
3-8
环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
[0222]
在化学部分的名称上的词头“亚
‑”
是指任何二价、含碳物质，包括但不限于亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚环基和亚杂环基。当化学可行时，到二价部分上的两个连接可以发生在相同原子或不同原子上。
[0223]“亚烷基”则表示烷烃分子中去除2个氢原子后余下的部分，包括1至20个碳原子的直链和支链亚基团。含有1至6个碳原子的亚烷基，非限制性实施例包括亚甲基(-ch
2-)、亚
乙基(如-ch2ch
2-或-ch(ch3)-)、亚丙基(如-ch2ch2ch
2-或-ch(ch2ch3)-)、亚丁基(如-ch2ch2ch2ch
2-)。亚烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，优选一个或多个以下基团，独立地选自卤素、氘、羟基、硝基、氰基或氨基。本公开部分结构以键线式表示，例如表示表示表示
[0224]
术语“亚烯基”是指通过从母体烯的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生的具有两个一价基团中心的烯。亚烯基的非限制性实例包括但不限于-ch＝ch-、-ch＝chch
2-、-ch＝chch2ch
2-、-ch2ch＝chch
2-等。亚烯基可被取代或未被取代。当被取代时，取代基优选为独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基磺基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷基硫基、杂环烷硫基及-nr9r
10
中的一个或多个、优选一个至五个，更优选一个至三个取代基。
[0225]
术语“亚炔基”是指通过从母体炔的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生的具有两个一价基团中心的炔基。典型的亚炔基包括、但不限于乙炔基(-c≡c-)、亚炔丙基(-ch2c≡c-)和1-亚戊炔基(-ch2ch2ch2c≡c-)。
[0226]
术语“亚芳基”是指通过从母体芳基的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生的具有两个一价基团中心的芳基。
[0227]
术语“亚杂芳基”是指如上述所定义的杂芳基，其具有从母体杂芳基的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子或从一个碳原子上除去氢和从一个氮原子上除去氢衍生的两个一价基团中心。
[0228]
术语“亚杂烷基”是指如本文所定义的亚烷基，其中一个或多个碳原子被氧、硫或氮原子替代。
[0229]
术语“亚环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃从形式上消除两个氢原子所形成的基团，其包括3至20个碳原子，优选包括3至12个碳原子，更优选单环亚环烷基环包含3至10个碳原子，最优选3至6个碳原子。单环亚环烷基的非限制性实施例包含亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、1，2-亚环丙基、1，3-亚环丁基、1，4-亚环己基等。多环亚环烷基包括亚螺环、亚稠环和亚桥环的亚环烷基。
[0230]
术语“亚杂环烷基”是指由杂环基与单一环碳上的两个取代基形成的二价基团。
[0231]
术语“羟基”指-oh基团。
[0232]
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0233]
术语“卤代烷基”指被卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0234]
术语“卤代烷氧基”是指如本公开所定义的任选被一个或多个卤原子取代的烷氧基。
[0235]
术语“氰基”指-cn。
[0236]
术语“硝基”指-no2。
[0237]
术语“氧代”指＝o基团，例如，碳原子与氧原子通过双键连接，其中形成酮或醛基。
[0238]
术语“氨基”指-nh2。
[0239]
术语“羧基”指-c(o)oh。
[0240]
术语“醛基”指-cho。
[0241]
术语“取代的”表示指定原子(通常是碳、氧和氮原子)上的任何一个或多个氢原子被本文所限定的任何基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物。取代基的非限制性示例包括c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素(例如，f、cl、br、i)。当取代基是酮或氧代(即，＝o)时，则原子上有两个(2个)氢被替代。
[0242]“被一个或多个
……
取代”是指可以被单个或多个取代基取代。当被多个取代基取代时，可以是复数个相同取代基，也可以是一个或复数个不同取代基的组合。
[0243]
术语“连接”，当表示两个分子之间的联系时，指两个分子通过共价键连接或者两个分子经由非共价键(例如，氢键或离子键)关联。连接包括直接连接和间接连接。术语“直接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团在没有任何间插原子或原子基团的情况下连接。术语“间接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团通过中间基团、化合物或分子(例如，连接基团)连接。
[0244]“连接”涵盖氨基酸残基通过共价键合的连接，包括但不限于酰胺键、二硫键键合；亚甲基键合(也称为亚甲基桥连接)、硫醚键连接、氢键键合和静电结合。
[0245]
本公开中表示共价键或非共价键连接，例如中x1和x
14
通过共价键或非共价键连接，包括但不限于氢键、离子键、酰胺键、亚甲基键合、硫醚键。当两个氨基酸被称为共价键合时，是指两个相应氨基酸的侧链中的官能团已经反应形成共价键。在氨基酸侧链之间形成共价键时，该化合物可成为环化的。如果化合物已经是环状的，它可能会变成双环的。
[0246]
术语“有效量”或“有效剂量”指指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶基因、靶mrna或靶蛋白相关病症的发病率或改善所述病症的一个或更多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶基因、靶mrna或靶蛋白相关病症的进展。
[0247]
术语“对象”、“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用，包括人类或者非人类动物，
例如哺乳动物，例如人或猴。
[0248]
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0249]
术语“可药用赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于任何已经被美国食品和药物管理局批准对于人类或家畜动物使用可接受的任何助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
[0250]
当本公开中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
[0251]
术语“α-氨基酸”或简称为“氨基酸”指含有结合到被称为α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d-和l-异构体以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文特别地指出，本文所用的术语氨基酸包括氨基酸类似物。
[0252]
术语“天然氨基酸”指自然界合成的肽中通常发现的20种氨基酸中的任一种，已知单字母缩写为a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v。本公开的氨基酸序列含有二十种氨基酸的标准单字母或三字母代码，除非明确说明，否则本公开中所有氨基酸残基优选构型为l-型。
[0253]
非天然的氨基酸是指天然存在的或化学合成的非蛋白原(non-proteinogenic)(即非蛋白编码)的氨基酸。实例包括但不限于：β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核氨基酸、二氨基酸、d-氨基酸和n-甲基氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸可以是取代的或未取代的。取代的氨基酸或取代基可以是卤代芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸；疏水性侧链上的卤代脂肪族修饰或芳香族修饰；或脂肪族修饰或芳香族修饰。
[0254]
术语“氨基酸类似物”指其结构上类似于氨基酸，且在大环化合物的形成中可代替氨基酸的分子。除了在氨基和羧基之间包括一个或多个额外的亚甲基(例如，α-氨基β-羧酸)或氨基或羧基被类似的反应基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)以外，氨基酸类似物包括，但不限于在结构上与如本公开所定义的氨基酸相同的化合物。
[0255]
术语“氨基酸侧链”指连接到氨基酸中的α-碳上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其它非天然存在的氨基酸侧链，例如，那些自然发生的(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的(例如，α，α二取代的氨基酸)的氨基酸侧链。
[0256]
术语“残基”是指通过消除羧基的羟基和α氨基的一个氢而由相应的α-氨基酸衍生的基团。
[0257]
本公开化合物的氨基酸包括编码氨基酸以及非编码氨基酸。编码氨基酸由iupac定义(第3aa-1部分的第一个表格)：www.chem.qmul.ac.uk/iupac/aminoacid/aa1n2.html#aa1，它给出了20种编码氨基酸的结构、俗名、系统名称、单字母和三字母符号。氨基酸结构的中心部分由三字母代码或单字母代码(例如ala或a、lys或k)表示，并且假定为l-构型，否
则用“d”具体表示d构型(例如dala、dlys)。
[0258]
当在本公开上下文中使用时，以下其它氨基酸缩写具有以下含义：
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263][0264]
当本公开中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
[0265]
实施例
[0266]
本公开提供的多肽化合物及其衍生物采用固相合成的方法合成其直链前体，在液相中利用分子内native chemical litation进行环化。合成载体为2-chlorotrityl chloride树脂。合成过程中，首先将2-chlorotrityl chloride树脂在二氯甲烷(dcm)中充分溶胀，然后耦连2-(丁基氨基)乙硫醇linker。耦连后用甲醇进行capping。该固相载体与活化后氨基酸衍生物重复缩合
→
洗涤
→
去保护fmoc
→
洗涤
→
下一轮氨基酸缩合的操作以达到所要合成的多肽链长度，最后用三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)的混合溶液与树脂反应将多肽从固相载体上裂解下来，再由冷冻甲基叔丁基醚沉降后得到直链前体的固体粗品。粗品近一步进行c端硫脂化，然后在中性溶液中进行环化和二硫键氧化得到多肽粗品。多肽粗品在0.1％三氟乙酸的乙腈/水的体系由c-18反相制备色谱柱纯化分离后得到多肽及其衍生物的纯品。
[0267]
实验试剂
[0268]
[0269][0270]
实施例1. 0002-0027-0037化合物的制备
[0271][0272]
步骤1：2-(丁基氨基)乙硫醇linker耦连
[0273]
将220mg(0.2mmol)2-chlorotrityl chloride树脂在dcm中充分溶胀1h。加入0.12mmol 2-(丁基氨基)乙硫醇在室温反应2h。反应完成后加入dcm：甲醇：diea(85:10:5，v:v:v)室温10min进行capping。反应后用dcm洗树脂3次，dmf洗3次。
[0274]
步骤2：直链前体肽链合成
[0275]
0002-0027-0037的直链前体序列c-k-dab-s-a-i-t-w-c-k-k-k-k-w
[0276]
依照0027-0037的直链前体序列按照从羧基端到氨基端的顺序合成。每一个耦连周期进行如下：
[0277]
·
20％哌啶/dmf(20％v/v，10ml)进行fmoc-去保护两次，每次10min。
[0278]
·
dmf冲洗树脂6-8次直到中性ph。
[0279]
·
用dmf溶解2mmol fmoc-aa,2mmol 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)和3mmol 4-甲基吗啉(nmm),加入树脂室温反应1h。
[0280]
·
下一个氨基酸耦连之前用dmf冲洗树脂4-6次。
[0281]
直链多肽合成后用dmf冲洗树脂3次，ipa 2次和mtbe 3次。树脂在真空中抽干。
[0282]
步骤3：直链前体肽链切割
[0283]
将新鲜配制的切割鸡尾酒(10ml)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)加入到步骤2所得树脂中，在室温下振荡反应3小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷mtbe沉淀得到粗品。用mtbe洗涤粗品3次，放入真空中抽干。
[0284]
步骤4：c端硫脂功能基团的形成
[0285]
将步骤3得到的粗品溶解到0.1％三氟乙酸水溶液中，浓度为3～4mg/ml。将溶液放置40℃水浴中24小时进行c端s-to-n酰基转移从而形成硫脂基团。
[0286]
步骤5：线性前体骨链环化与分子内二硫键形成
[0287]
将步骤4反应溶液1:1(v：v)逐滴稀释到2mm还原型谷胱甘肽，50mm碳酸氢铵水溶液中。室温震荡24h。反应结束后加入2.5％(v：v)乙酸。
[0288]
步骤6：多肽的纯化制备
[0289]
经过0.22um膜过滤后用waters prep150 lc反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为a(0.1％三氟乙酸，10％乙腈，水溶液)和b(0.1％三氟乙酸，90％乙腈，水溶液)。其中，色谱柱为x-select obd c-18(waters)反相色谱柱，纯化过程中色谱仪检测波长设定为230nm，流速为15ml/min，梯度为10-25％乙腈in 50min。收集产物相关馏分，uplc鉴定纯度后将》95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。
[0290]
步骤7：检测与表征方法
[0291]
将步骤6的多肽纯品通过分析性高效液相色谱和液相色谱/质谱联用确定纯度及化合物骨链环化以及二硫键形成。
[0292]
实施例2. 0002-0027-0039化合物的制备：
[0293][0294]
步骤1：2-(丁基氨基)乙硫醇linker耦连
[0295]
将220mg(0.2mmol)2-chlorotrityl chloride树脂在dcm中充分溶胀1h。加入0.12mmol 2-(丁基氨基)乙硫醇在室温反应2h。反应完成后加入dcm：甲醇：diea(85:10:5，v:v:v)室温10min进行capping。反应后用dcm洗树脂3次，dmf洗3次。
[0296]
步骤2：直链前体肽链合成
[0297]
0002-0027-0039的直链前体序列：c-k-dab-s-abu-i-t-w-c-k-k-k-k-w
[0298]
依照0027-0039的直链前体序列按照从羧基端到氨基端的顺序合成。每一个耦连周期进行如下：
[0299]
·
20％哌啶/dmf(20％v/v，10ml)进行fmoc-去保护两次，每次10min.
[0300]
·
dmf冲洗树脂6-8次直到中性ph.
[0301]
·
用dmf溶解2mmol fmoc-aa,2mmol 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)和3mmol 4-甲基吗啉(nmm),加入树脂室温反应1h。
[0302]
·
下一个氨基酸耦连之前用dmf冲洗树脂4-6次。
[0303]
直链多肽合成后用dmf冲洗树脂3次，ipa2次和mtbe 3次。树脂在真空中抽干。
[0304]
步骤3：直链前体肽链切割
[0305]
将新鲜配制的切割鸡尾酒(10ml)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)加入到步骤2所得树脂中，在室温下振荡反应3小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷mtbe沉淀得到粗品。用mtbe洗涤粗品3次，放入真空中抽干。
[0306]
步骤4：c端硫脂功能基团的形成
[0307]
将步骤3得到的粗品溶解到0.1％三氟乙酸水溶液中，浓度为3～4mg/ml.将溶液放置40℃水浴中24小时进行c端s-to-n酰基转移从而形成硫脂基团。
[0308]
步骤5：线性前体骨链环化与分子内二硫键形成
[0309]
将步骤4反应溶液1:1(v：v)逐滴稀释到2mm还原型谷胱甘肽，50mm碳酸氢铵水溶液中。室温震荡24h。反应结束后加入2.5％(v：v)乙酸。
[0310]
步骤6：多肽的纯化制备
[0311]
经过0.22um膜过滤后用waters prep150 lc反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为a(0.1％三氟乙酸，10％乙腈，水溶液)和b(0.1％三氟乙酸，90％乙腈，水溶液)。其中，色谱柱为x-select obd c-18(waters)反相色谱柱，纯化过程中色谱仪检测波长设定为230nm，流速为15ml/min，梯度为10-25％乙腈in 50min。收集产物相关馏分，uplc鉴定纯度后将》95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。
[0312]
步骤7：检测与表征方法
[0313]
将多肽纯品通过分析性高效液相色谱和液相色谱/质谱联用确定纯度及化合物骨链环化以及二硫键形成。
[0314]
实施例3. 0027-0040化合物的制备：
[0315][0316]
步骤1：2-(丁基氨基)乙硫醇linker耦连
[0317]
将220mg(0.2mmol)2-chlorotrityl chloride树脂在dcm中充分溶胀1h。加入0.12mmol 2-(丁基氨基)乙硫醇在室温反应2h。反应完成后加入dcm：甲醇：diea(85:10:5，v:v:v)室温10min进行capping。反应后用dcm洗树脂3次，dmf洗3次。
[0318]
步骤2：直链前体肽链合成
[0319]
直链前体序列c-k-dab-s-d
abu-i-t-w-c-k-k-k-k-w
[0320]
依照0002-0027-0040的直链前体序列按照从羧基端到氨基端的顺序合成。每一个耦连周期进行如下：
[0321]
·
20％哌啶/dmf(20％v/v，10ml)进行fmoc-去保护两次，每次10min.
[0322]
·
dmf冲洗树脂6-8次直到中性ph.
[0323]
·
用dmf溶解2mmol fmoc-aa,2mmol 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)和3mmol 4-甲基吗啉(nmm),加入树脂室温反应1h。
[0324]
·
下一个氨基酸耦连之前用dmf冲洗树脂4-6次。
[0325]
直链多肽合成后用dmf冲洗树脂3次，ipa2次和mtbe 3次。树脂在真空中抽干。
[0326]
步骤3：直链前体肽链切割
[0327]
将新鲜配制的切割鸡尾酒(10ml)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)加入到步骤2所得树脂中，在室温下振荡反应3小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷mtbe沉淀得到粗品。用mtbe洗涤粗品3次，放入真空中抽干。
[0328]
步骤4：c端硫脂功能基团的形成
[0329]
将步骤3得到的粗品溶解到0.1％三氟乙酸水溶液中，浓度为3～4mg/ml.将溶液放置40℃水浴中24小时进行c端s-to-n酰基转移从而形成硫脂基团。。
[0330]
步骤5：线性前体骨链环化与分子内二硫键形成
[0331]
将步骤4反应溶液1:1(v：v)逐滴稀释到2mm还原型谷胱甘肽，50mm碳酸氢铵水溶液中。室温震荡24h。反应结束后加入2.5％(v：v)乙酸。
[0332]
步骤6：多肽的纯化制备
[0333]
经过0.22um膜过滤后用waters prep150 lc反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为a(0.1％三氟乙酸，10％乙腈，水溶液)和b(0.1％三氟乙酸，90％乙腈，水溶液)。其中，色谱柱为x-select obd c-18(waters)反相色谱柱，纯化过程中色谱仪检测波长设定为230nm，流速为15ml/min，梯度为10-25％乙腈in 50min。收集产物相关馏分，uplc鉴定纯度后将》95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。
[0334]
步骤7：检测与表征方法
[0335]
将步骤6的多肽纯品通过分析性高效液相色谱和液相色谱/质谱联用确定纯度及化合物骨链环化以及二硫键形成
[0336]
实施例4. 0002-0027-0047化合物的制备：
[0337][0338]
步骤1：2-(丁基氨基)乙硫醇linker耦连
[0339]
将220mg(0.2mmol)2-chlorotrityl chloride树脂在dcm中充分溶胀1h。加入0.12mmol 2-(丁基氨基)乙硫醇在室温反应2h。反应完成后加入dcm：甲醇：diea(85:10:5，v:v:v)室温10min进行capping。反应后用dcm洗树脂3次，dmf洗3次。
[0340]
步骤2：直链前体肽链合成
[0341]
0002-0027-0047的直链前体序列c-dab-dab-s-a-i-t-w-c-dab-orn-d
dab
–
dab-w
[0342]
依照0002-0027-0047的直链前体序列按照从羧基端到氨基端的顺序合成。每一个耦连周期进行如下：
[0343]
·
20％哌啶/dmf(20％v/v，10ml)进行fmoc-去保护两次，每次10min.
[0344]
·
dmf冲洗树脂6-8次直到中性ph.
[0345]
·
用dmf溶解2mmol fmoc-aa,2mmol 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)和3mmol 4-甲基吗啉(nmm),加入树脂室温反应1h。
[0346]
·
下一个氨基酸耦连之前用dmf冲洗树脂4-6次。
[0347]
直链多肽合成后用dmf冲洗树脂3次，ipa2次和mtbe 3次。树脂在真空中抽干。
[0348]
步骤3：直链前体肽链切割
[0349]
将新鲜配制的切割鸡尾酒(10ml)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)加入到步骤2所得树脂中，在室温下振荡反应3小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷mtbe沉淀得到粗品。用mtbe洗涤粗品3次，放入真空中抽干。
[0350]
步骤4：c端硫脂功能基团的形成
[0351]
将步骤3得到的粗品溶解到0.1％三氟乙酸水溶液中，浓度为3～4mg/ml.将溶液放置40℃水浴中24小时进行c端s-to-n酰基转移从而形成硫脂基团。。
[0352]
步骤5：线性前体骨链环化与分子内二硫键形成
[0353]
将步骤4反应溶液1:1(v：v)逐滴稀释到2mm还原型谷胱甘肽，50mm碳酸氢铵水溶液中。室温震荡24h。反应结束后加入2.5％(v：v)乙酸。
[0354]
步骤6：多肽的纯化制备
[0355]
经过0.22um膜过滤后用waters prep150 lc反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为a(0.1％三氟乙酸，10％乙腈，水溶液)和b(0.1％三氟乙酸，90％乙腈，水溶液)。其中，色谱柱为x-select obd c-18(waters)反相色谱柱，纯化过程中色谱仪检测波长设定为230nm，流速为15ml/min，梯度为10-25％乙腈in 50min。收集产物相关馏分，uplc鉴定纯度后将》95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。
[0356]
步骤7：检测与表征方法
[0357]
将步骤6的多肽纯品通过分析性高效液相色谱和液相色谱/质谱联用确定纯度及化合物骨链环化以及二硫键形成。
[0358]
实施例5.制备化合物
[0359]
参考实施例1-4，制备0002-0027-0052:
[0360][0361]
参考实施例1-4，制备如下化合物。所有化合物(seq id no.1至seq id no.9)均为骨链环化(即首尾氨基酸环化)，seq id no.1至seq id no.6序列中含cys与cys(c与c)均形成分子内二硫键(cys-cys，c-c)：
[0362]
0002-0027(seq id no.1)：t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-a-s-k-l；
[0363]
0002-0027-0037(seq id no.2)：t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-a-i；
[0364]
0002-0027-0039(seq id no.3)：t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-abu-i；
[0365]
0002-0027-0040(seq id no.4)：t-w-c-k-k-k-k-w-c-k-dab-s-d
abu-i；
[0366]
0002-0027-0047(seq id no.5)：t-w-c-dab-orn-d
dab-dab-w-c-dab-dab-s-a-i；
[0367]
0002-0027-0048(seq id no.6)：t-w-c-dab-orn-d
dab-dab-w-c-dab-dab-s-abu-i；
[0368]
[0369][0370]
实施例6.分子最低抑菌浓度mic功能测试
[0371]
本公开通过测定分子对两种铜绿假单胞菌(p.aeruginosa atcc27853及p.aeruginosa pao-1)及一种大肠杆菌(e.coli atcc25922)的最低抑菌浓度mic(minimal inhibitory concentrations)来确定化合物抗菌活性。
[0372]
用于最小抑菌浓度测试的细菌冻存于-80℃低温冰箱，使用时提前2天复苏。用无菌接种环刮取少许冻存的液菌在tsa固体培养基平皿上划线接种，放入普通培养箱中35
±
2℃培养20小时左右。用无菌接种环从上述培养皿中挑取5-10个形态相似的菌落，再次划线接种于相应固体培养基平皿上。随后放入普通培养箱中35
±
2℃培养20小时左右。从固体培养皿中挑取5-10个细菌单菌落重悬于500μl的无菌生理盐水(0.9％ nacl)中，再用分光光度计调节od600至～0.15。使用平衡至室温的1.02x camhb(含0.02％ bsa)将细菌稀释300倍达到接种浓度～2x 105cfu/ml。
[0373]
备选多肽用dmso溶解成3.2mg/ml备用液，依次用dmso进行两倍梯度稀释，11个稀释度。转移2μl的多肽化合物到试验板的相应孔中，加入98μl以上备好的细菌接种物至试验板中。化合物的最高检测浓度为64μg/ml。试验板放入离心机800rpm离心30秒，再在振板机上400rpm振1分钟混匀后放入普通培养箱中35
±
2℃培养20小时。将试验板置于读板设备上，调节反射镜观察记录每个孔中细菌生长情况。同时用qcount系统对每块试验板拍照，用spectramax plus 384读取每个孔中细菌的od600值。
[0374]
实施例7.化合物筛选
[0375]
本实施例通过分子最低抑菌浓度mic筛选多肽化合物，mic测定方法参见实施例6。第一轮筛选，选定二硫键位置为c3-c9；第二轮筛选，进行ala筛选和13、14位初步筛选；第三轮筛选，筛选14位氨基酸；第1314位氨基酸；14位氨基酸；第四轮筛选，筛选10-13位氨基酸；第五轮筛选，筛选第13位氨基酸；第六轮筛选，进行非天然氨基酸改造，最终获得高活性化合物：0002-0027、0002-0027-0037、0002-0027-0039、0002-0027-0040、0002-0027-0047、0002-0027-0048、0002-0027-0049、0002-0027-0050、0002-0027-0052。
[0376]
实施例8.高活性化合物活性评价
[0377]
针对部分活性高的化合物进行铜绿假单胞菌(p.aeruginosa atcc27853)及大肠
杆菌(e.coli atcc25922)mic测试，mic测定方法参见实施例6，结果见表2：
[0378]
表2：化合物针对p.aeruginosa atcc27853和e.coli atcc25922的mic(μg/ml)
[0379][0380]
此外，还验证了针对铜绿假单胞菌(p.aeruginosa pao-1)的mic(μg/ml)，0002-0027-0037为0.25μg/ml；0002-0027-0039为0.25μg/ml；0002-0027-0040为0.5μg/ml；阳性药物polymyxin b为0.5μg/ml。
[0381]
实施例9.化合物与铜绿假单胞菌lptd/e亲和力测试spr实验
[0382]
步骤1：lptd/e复合体的克隆与表达
[0383]
将lptd基因与lpte基因分别插入大肠杆菌表达载体pet28b(+)和pacycduet-1中，并将两种载体共转到bl21感受态细胞中，在含有35ug/ml氯霉素和50ug/ml卡那霉素的双抗性lb平板中37℃过夜培养。从双抗性平板中挑取单克隆接种于100ml含有35ug/ml氯霉素和50ug/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm,过夜培养活化菌株。当活化菌株培养至平台期，以1：100比例接种于4.5l含以上两种抗生素的lb液体培养基中，37℃，200rpm,摇至od600值0.6-0.8，添加0.5m iptg进行诱导表达，24℃，诱导表达5h,离心收集菌体。
[0384]
步骤2：lptd/e复合体纯化
[0385]
将来自4.5l表达的细菌细胞重悬在150ml的1x pbs(ph7.4)中，压力破碎，然后100,000g 4℃离心60min收集细菌总膜。将总膜在含有1％(w/v)月桂酰基肌氨酸钠的1x pbs 4度孵育60min以选择性地溶解掉细菌内膜，然后100,000g 4度离心60min收集细菌外膜。将外膜在含有1％(w/v)ldao的20mm tris(ph 8.0)，300mm nacl缓冲液中4度孵育60min以提取lptdehis复合体，然后100,000g 4度离心45min收集上清。在上清中加入咪唑使其终浓度为10mm，与含有1％ ldao，10mm咪唑的20mm tris(ph 8.0)，300mm nacl缓冲液平衡后的ni-nta beads孵育1h，然后将beads用含有1％ ldao，10mm咪唑的20mm tris(ph 8.0)，300mm nacl缓冲液洗5个柱体积，再用含有0.2％ ldao，20mm咪唑的20mm tris(ph 8.0)，150mm nacl缓冲液洗10个柱体积。接着用含有1％(w/v)og的20mm tris(ph 8.0)，150mm nacl缓冲液进行20个柱体积的去垢剂交换，再用含有1％ og，200mm咪唑的20mm tris(ph 8.0)，150mm nacl将lptdehis复合体从beads上洗脱下来。最后通过分子筛的方式用superdex 200increase 10/300gl柱子将所需要的lptdehis复合体在含有1％ og的1x pbs
中精纯出来用于spr结合研究。
[0386]
步骤3：多肽化合物与lptd/e复合体亲和力测定
[0387]
亲和力的测定采用的是表面等离子共振(spr)的方法，本实验中进行检测的仪器是biacore t200(ge healthcare)，实验过程中使用的反应缓冲液为含有1％og(w/v)的pbs溶液。首先将ni溶液以流速10ul/min流过nta芯片表面60s,然后将纯化的lptd/e复合体蛋白稀释至160nm,流速10ul/min流过nta芯片表面600s，直到捕获水平达到3000ru左右。根据化合物亲和力的不同，用1％og的pbs三倍稀释成五个不同浓度梯度(如6.17nm，18.5nm，55.5nm，166.7nm，500nm)，并以20μl/min的流速流过一侧流动室，另一侧流动室则以相同流速流过缓冲液作为对照基线，持续100s用于记录化合物与复合体蛋白的结合相；接下来的200s换成反应缓冲液用于记录解离相。每一个化合物的亲和力反应进行结束均需要用350mm edta溶液进行再生，即将捕获的分子从芯片表面洗掉以用于下一个亲和力反应。结合解离动态曲线则通过biacore t200 evaluation software(ge healthcare)进行拟合分析，并可得到结合速率常数k
on
、解离速率常数k
off
并计算出平衡解离常数kd(k
off
/k
on
)。结果见表3如下：
[0388]
表3：化合物与lptd/e复合体亲和力
[0389]
多肽编号kd(m)0002-0027-00373.49e-080002-0027-00391.11e-08
[0390]
实施例10.细胞毒性实验
[0391]
本公开通过测定分子对hela细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)和cos-7细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)来确定备选多肽对细胞的毒性。使用wst-8还原试验法来测定(cell counting kit,sigma)。
[0392]
将hela细胞和cos-7细胞分别以7x103/孔，4.5x103/孔铺于96孔板中，置于5％co2,37℃培养箱中孵育过夜。次日，弃上清，加入以新鲜培养基配置的备选多肽，浓度分别为100，50，25，12，5，0μm,每个样品做三次重复，与细胞在37℃,5％co2培养箱中继续孵育48小时。然后用磷酸盐缓冲盐液(pbs)清洗一次。随后加入100μl/孔10％wst-8试剂，在37℃下孵育1.5小时。用spectramax m5读取每个孔在535nm处的荧光强度(fl535，激发在485nm)。polymyxin b作为阳性对照。生长百分比的计算如下:(fl535肽-fl535空孔)/(fl535细胞-fl535空孔)x100％，以多肽浓度及生长百分比做曲线。实验结果见图1。结果说明，本公开化合物没有明显毒副作用。
[0393]
实施例11.溶血性实验
[0394]
测试了备选多肽对人红细胞(hrbc)的溶血活性。新鲜的hrbc从人外周血中获得，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,pbs)稀释洗涤三次，以离心力2000g离心10分钟，最终将红细胞浓度稀释约为0.9x10
9 cells/ml。将浓度为500，250，100，50，25，10，2μg/ml的多肽与20％v/v的hrbc在37℃孵育1小时。分别以hrbc与pbs，0.1％ triton x-100水溶液孵育后的读值作为0％和100％溶血率对照，polymyxin b作为阳性对照。孵育1小时后，以离心力2000g离心10分钟，收集上清用pbs稀释20倍后用spectramax m5测定样品在540nm的od值。溶血率计算如下:(od540多肽/od 540triton x-100)x100％。实验结果见图2。结果说明，本公开化合物相对于阳性药物polymyxin b，溶血副作用显著降低。
[0395]
实施例12.血浆稳定性
[0396]
研究多肽0002-0027-0037，0002-0027-0039，0002-0027-0040在小鼠和人血浆的稳定性。将4μl1 mg/ml多肽溶液分别与796μl肝素钠抗凝的人血浆和cd-1小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)血浆在37℃，300rpm震荡孵育，分别在0min，5min，15min，30min，1h，2h，3h取50μl样品，加入含内标的甲醇终止反应，涡旋混匀2min后，在4℃条件下4500rpm离心15min。取上清用超纯水稀释并进行lc-ms/ms检测。血浆中剩余多肽百分比计算公式为：剩余多肽百分比(％)＝孵育不同时间的多肽-内标峰面积比/0min的多肽-内标峰面积比
×
100。实验结果见表4，在人血浆中，稳定性依次为0002-0027-0040》0002-0027-0039≈0002-0027-0037；在cd-1小鼠血浆中，稳定性依次为0002-0027-0040≈0002-0027-0039》0002-0027-0037。
[0397]
表4多肽血浆稳定性
[0398][0399][0400]
实施例13.多肽化合物肾匀浆稳定性
[0401]
研究多肽0002-0027-0037，0002-0027-0047在小鼠肾脏匀浆中的稳定性。分别取500μlcd-1小鼠肾匀浆液至1.5mlep管中，37℃300rpm预孵育15min，各取1μl5mg/ml多肽工作溶液到上述1.5mlep管中，快速轻轻振荡，涡匀，分别在0、5、15、30、45、60min取80μl，加入含内标的甲醇终止液，涡旋振荡1min，4℃条件下，4500rpm离心15min，取上清用甲醇1:1稀释，lc-ms/ms进样分析。肾脏匀浆中剩余多肽百分比计算公式为：剩余多肽百分比(％)＝孵育不同时间的多肽-内标峰面积比/0min的多肽-内标峰面积比x100。
[0402]
实验结果见图3和表5。在cd-1小鼠肾脏匀浆中，稳定性依次为：0002-0027-0047》0002-0027-0037。
[0403]
表5多肽肾匀浆稳定性
[0404][0405]
实施例14.多肽化合物小鼠体内pk实验
[0406]
cd-1小鼠27只，雄性，体重30～40g，购自维通利华实验动物技术有限公司。饲养期间自由摄取饲料和水，实验室环境适应性饲养不小于3天，12/12小时光/暗周期调节，温度16-26℃，相对湿度40-70％。实验开始前一天，对cd-1小鼠进行编号，随机分为0002-0027-0037组、0002-0027-0039组，每组采用交叉采血的方式，每个时间点3只小鼠，每组共9只。实验当天，0002-0027-0037组、0002-0027-0039组分别静脉注射多肽0002-0027-0037、0002-0027-0039，给药剂量为1mg/kg，静脉注射体积为10ml/kg。
[0407]
给药后采血时间点为5min，15min，30min，1h，2h，3h，4h，5h，7h。每次取全血0.1ml置于肝素钠抗凝管中，在4℃条件下2000g离心10min，取血浆置于ep管中，-80℃保存。
[0408]
用lc-ms/ms方法检测血浆中的血药浓度，用pksolver软件计算受试多肽的t
1/2
及其主要参数。所得主要药动学参数见表6，cd-1小鼠静脉注射给予受试多肽后，0002-0027-0037与0002-0027-0039在小鼠体内的代谢较快，组织分布较少，血浆暴露量较多。
[0409]
表6多肽化合物在小鼠体内的主要药动学参数
[0410] 0002-0027-00370002-0027-0039剂量(mg/kg)11t
1/2
(h)0.130.14t
max
(h)0.0830.083c
max
(ng/ml)2043.31930.0c0(ng/ml)4161.93325.0auc
0-t
(ng/ml*h)555.0544.2auc
0-inf_obs
(ng/ml*h)592.1593.7vz_obs(ml/kg)312.3344.2cl_obs(ml/h/kg)1688.81684.2
[0411]
实施例15.肝微粒体代谢稳定性
[0412]
研究多肽在小鼠肝微粒体中的稳定性。分别取500μlcd-1小鼠肝微粒体液至1.5ml ep管中，37℃300rpm预孵育15min，各取1μl的5mg/ml多肽工作溶液到上述1.5ml ep管中，快速轻轻振荡，涡匀，分别在0、5、15、30、45、60min取80μl，加入含内标的甲醇终止液，涡旋振荡1min，4℃条件下，4500rpm离心15min，取上清用甲醇1:1稀释，lc-ms/ms进样分析。肾脏匀浆中剩余多肽百分比计算公式为：剩余多肽百分比(％)＝孵育不同时间的多肽-内标峰面积比/0min的多肽-内标峰面积比x100。其中，0027-0049代表实施例5中0002-0027-0049、0027-0050代表实施例5中0002-0027-0050、0027-0047代表实施例5中0002-0027-0047、0027-0052代表实施例5中0002-0027-0052。
[0413]
结果如图4所示，0027-0052(即实施例5中0002-0027-0052)稳定性提高。
[0414]
实施例16.pd实验
[0415]
实验选用cd-i雌性小鼠，6-8周龄，体重27～29g，spf级别，来自上海灵畅。实验分组为：溶媒对照组，阳性化合物对照组，备选多肽组，每组五只小鼠。定义感染当天为day 0，于day-4(150mg/kg)和day-1(100mg/kg)通过腹腔注射环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠；于day 0通过鼻腔滴注的方式接种最佳浓度的菌液(1x106cfu)构建肺部感染模型。计感染时间为-2h，在感染后的2h(给药为0h)皮下注射给药。备选多肽组分别以16、8、4、2和1mg/kg的剂量皮下注射给小鼠，阳性化合物对照组以2mg/kg的剂量皮下给药，溶媒对照组为pbs,5ml/kg
皮下注射。每隔6小时给药一次。给药24h后，处死小鼠，无菌收集各组小鼠肺部，匀浆，均匀涂布于琼脂板上，观察并记录菌落个数。ed50使用graphpad prism非线性曲线拟合。
[0416]
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

技术特征：
1.一种如式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：其中，x1选自thr、
d
thr，优选自
d
thr；x2选自trp、
d
trp，优选自trp；x4、x5、x6、x7各自独立地选自lys、
d
lys、orn、
d
orn、dab或
d
dab；x8选自trp、
d
trp，优选自trp；x
10
选自lys、orn、dab；x
11
选自lys、orn、dab，优选自dab；x
12
选自ser、
d
ser，优选自ser；x
13
选自ala、
d
ala、abu或
d
abu；x
14
选自ile或
d
ile；-r
1-r
3-r
5-r
4-r
2-选自：
表示x1与x
14
通过共价键或非共价键连接。2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，x1与x
14
共价连接，优选通过x1的α氨基与x
14
的α羧基之间的酰胺键连接。3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，x
4-x
5-x
6-x7选自：lys-lys-lys-lys，或，orn-orn-orn-orn，或，dab-dab-dab-dab，或，dab-orn-dab-dab，或，
d
dab-orn-dab-dab，或，dab-d
orn-dab-dab，或，dab-orn-d
dab-dab，或，dab-orn-dab-d
dab，或，dab-dab-orn-dab，或，
d
dab-dab-orn-dab，或，dab-d
dab-orn-dab，或，dab-dab-d
orn-dab，或，dab-dab-orn-d
dab。4.如权利要求1至3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，x
10-x
11
选自：lys-dab，或，dab-dab，或，dab-lys，或，lys-lys。5.如权利要求1至4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，x
13-x
14
选自：ala-ile，或，
d
ala-ile，或，abu-ile，或，
d
abu-ile，或，ala-d
ile，或，
d
ala-d
ile，或，abu-d
ile，或，
d
abu-d
ile，或，ile-ile，或，
d
ile-ile，或，
ile-d
ile，或，
d
ile-d
ile，或，leu-ile，或，
d
leu-ile，或，leu-d
ile，或，
d
leu-d
ile，或，val-ile，或，
d
val-ile或，val-d
ile，或，
d
val-d
ile。6.如权利要求1至5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自seq id no.1至seq id no.9任一项。7.如权利要求1至6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
8.如权利要求1至7任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
9.一种药物组合物，其含有权利要求1至8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.一种产品，其含有权利要求1至8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，用作杀菌剂、消毒剂或防腐剂。11.权利要求1至8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备用于抑制微生物的生长或杀灭微生物的药物中的用途；优选的，所述微生物为假单胞菌；更优选的，述微生物为铜绿假单胞菌。12.权利要求1至8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防感染的药物中的用途；优选地，所述感染与铜绿假单胞菌感染相关。13.一种制备权利要求1至8任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：直链前体肽链合成、切割；线性前体骨链环化与分子内二硫键形成，可选地，包括肽的纯化。

技术总结
本公开涉及多肽化合物及其医药用途。具体地，涉及多肽化合物及其用于治疗和/或预防假单胞菌感染相关疾病，特别是铜绿假单胞菌感染相关疾病的医药用途。相关疾病的医药用途。


技术研发人员：李义龙 吴方舟 王雷 崔妍
受保护的技术使用者：北京拓界生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/7/19