一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌A的方法与流程

一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法
技术领域
1.本发明涉及药用植物活性成分的提取技术领域，具体涉及一种从火把花根药材中分离提取雷公藤对醌a的方法。


背景技术：

2.火把花根是卫矛科雷公藤属植物昆明山海棠(tripterygium hypoglaucum(levl.)hutch)去皮的干燥根芯。全年可采挖，除去杂质，去根皮，破碎，干燥。味苦、温；有毒。归脾、肾经。具有祛风除湿，舒筋活络，清热解毒的功效，主要用于风湿痹症(类风湿性关节炎、风湿性关节炎)，慢性肾炎，红斑狼疮，跌打损伤，皮肤瘙痒等。
3.雷公藤对醌a是火把花根中活性成分之一，相关研究表明：雷公藤对醌a具有较好的抗炎、调节免疫等生理活性，能够对白介素-1(il-1)的释放有显著抑制活性。白介素1(il-1)是一种被广泛存在于动物体内的细胞因子，主要存在形式为：il-1α和il-1β，它能够调节免疫反应、炎症反应和其他生理活动，是一种重要的活性物质。它是一种多功能的细胞因子，可以促进细胞的分化和增殖，影响免疫反应，调节机体的代谢，抗病毒和肿瘤，并参与机体的其他重要的生理活动。il-1的含量过高，则会导致机体免疫功能异常，容易诱发关节炎、肝炎、肾炎等疾病，甚至有发生肿瘤的可能。由火把花根药材水提醇沉制成的火把花根片对与类风湿关节炎、红斑狼疮、肾病等免疫性疾病具有良好的治疗效果，其中活性成分之一的雷公藤对醌a对白介素-1(il-1)的释放有显著抑制活性。目前关于雷公藤对醌a的提取纯化还暂未报道，为了得到高纯度的雷公藤对醌a对其药理活性进行研究，有必要开发一种简单、快速、高效的雷公藤对醌a的提取方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从火把花根药材提取雷公藤对醌a的方法，该方法提取效率高，所得到的雷公藤对醌a的纯度高(99.72％)，为雷公藤对醌a的对照品制备和生产提供基础。
5.为实现上述目的，本发明包括以下步骤：
6.步骤s10：将10kg火把花根药材粉碎，过50～60目药筛，得到火把花根药材粗粉，加入其10～30倍质量的75％～90％乙醇溶液，65～95℃加热回流提取2～5h，提取2～3次，过滤得到火把花根提取液；
7.步骤s20：对步骤s10中火把花根提取液减压浓缩处理至无醇味，回收乙醇溶液后，得到火把花根浓缩液；
8.步骤s30：将火把花根浓缩液分别用等体积的石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取三次，分别合并石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取层，减压回收相应溶剂，得到火把花根石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取物；
9.步骤s40：将步骤s30中火把花根二氯甲烷萃取物上反相中压c18柱层析进行富集，以30％～80％乙腈梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行hplc检测合并浓
缩，雷公藤对醌a被富集到lf04中；
10.步骤s50：将步骤s40中得到的流分lf04进行反相高压c18柱层析制备纯化，以50％～60％的乙腈水梯度洗脱，收集含有雷公藤对醌a的流分，浓缩、冻干获得雷公藤对醌a。
11.所得雷公藤对醌a的结构式如下：
[0012][0013]
雷公藤对醌a(triptoquinonea)，molecular formula：c
20h24
o4；hr-esi-ms m/z329.1738[m+h]
+
；1hnmr(chloroform-d,500mhz)δh 6.37(1h,s)，2.99(1h,hept,j＝6.9hz)，2.81～2.72(2h,m)，2.62～2.41(2h,m)，2.44～2.33(1h,m)，2.25～2.18(2h,m)，2.10(3h,s)，1.53～1.39(2h,m)，1.17(3h,s)，1.11(3h,d,j＝6.9hz)，1.10(3h,d,j＝6.9hz)；13c nmr(125mhz,chloroform-d)δc 187.97，187.74，174.31，153.35，148.83，147.84，142.63，131.94，124.84，47.46，36.70，31.97，26.54，25.31，24.69，21.52，21.48，19.30，18.85，18.5。
[0014]
进一步，步骤s10加入90％的乙醇量为10倍，加热回流提取条件如下：提取温度为80～85℃；回流提取时间为2～3h；提取次数2次。
[0015]
进一步，步骤s40中所用的反相中压c18硅胶为100～200目。
[0016]
进一步，取少量得到的雷公藤对醌a样品，以甲醇溶解后配制成约0.5mg/ml的溶液，采用hplc高效液相色谱法进行检测。
[0017]
进一步，采用的hplc高效液相色谱法其色谱条件为，色谱柱：agilent extend-c
18
,4.6x250mm,5μm；流动相：水(a)-乙腈(b)梯度洗脱(0～25min，70％a～20％a；25～26.1min，20％a～0％a；26.1～30min，0％a)；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：260nm；进样量：10μl。
[0018]
本发明的有益效果在于：本制备方法为首次对雷公藤对醌a进行回流提取，并使用hplc技术对流分成分进行跟踪，中高压色谱分离技术，该方法提取效率高，节约试剂，所得雷公藤对醌a纯度高。
附图说明
[0019]
图1为雷公藤对醌a的hplc色谱图；
[0020]
图2为雷公藤对醌a的ms1谱图；
[0021]
图3为雷公藤对醌b的1h-nmr谱图(测试频率为125mhz，测试溶剂为cdcl3)；
[0022]
图4为雷公藤对醌b的
13
c-nmr谱图(测试频率为125mhz，测试溶剂为cdcl3)；
[0023]
图5为雷公藤对醌a分离纯化过程图；
具体实施方式
[0024]
一种从火把花根药材提取雷公藤对醌a的方法，本发明包括以下实施例：
[0025]
实施例1：将10kg火把花根药材粉碎，过50目药筛，得到火把花根药材粉末，加入100l浓度为90％乙醇溶液，75℃加热回流提取2h，提取3次，过滤得到火把花根提取液；将火把花根提取液进行减压浓缩处理至无醇味，分别以等体积的石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取三次，分别合并石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取层，减压回收相应溶剂，得到火把花根石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取物，得到火把花根二氯甲烷萃取物。
[0026]
实施例2：将10kg火把花根药材粉碎，过60目药筛，得到火把花根药材粉末，加入120l浓度为75％乙醇溶液，85℃加热回流提取2h，提取3次，过滤得到火把花根提取液；将火把花根提取液进行减压浓缩处理至无醇味，分别以等体积的石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取三次，分别合并石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取层，减压回收相应溶剂，得到火把花根石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取物，得到火把花根二氯甲烷萃取物。
[0027]
实施例3：将10kg火把花根药材粉碎，过60目药筛，得到火把花根药材粉末，加入200l浓度为85％乙醇溶液，90℃加热回流提取2h，提取3次，过滤得到火把花根提取液；将火把花根提取液进行减压浓缩处理至无醇味，分别以等体积的石油醚、二氯甲烷和正丁醇进行萃取三次，分别合并石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取层，减压回收相应溶剂，得到火把花根石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取物，得到火把花根二氯甲烷萃取物。
[0028]
取得到的火把花根二氯甲烷萃取物上反相中压c18柱层析进行富集，以30％、40％、50％、60％的乙腈水体系梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行hplc检测合并浓缩，雷公藤对醌a被富集到lf04流分中(约60％乙腈水)；
[0029]
对lf04流分进行反相高压c18柱层析制备纯化，以50％～60％的乙腈水梯度洗脱，收集含有雷公藤对醌a的流分，浓缩、冻干获得雷公藤对醌a；最后将获得的雷公藤对醌a采用hplc进行分析(分析条件如下表1、2)。
[0030]
表1.色谱分析条件
[0031][0032]
表2.质谱分析条件
[0033][0034][0035]
本发明的有益效果在于：本制备方法为首次对雷公藤对醌a进行提取分离纯化，并使用hplc技术对流分成分进行跟踪，中高压色谱分离技术，该方法提取效率高，所得雷公藤对醌a纯度较高(99.72％)，为后续研究其药理活性以及免疫新药的开发奠定基础。
[0036]
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法，步骤包括如下：步骤s10：将10kg火把花根药材粉碎，过50～60目药筛，得到火把花根药材粗粉，加入其10～30倍质量的75％～90％乙醇溶液，65～95℃加热回流提取2～5h，提取2～3次，过滤得到火把花根提取液；步骤s20：对步骤s10中火把花根提取液减压浓缩处理至无醇味，回收乙醇溶液后，得到火把花根浓缩液；步骤s30：将火把花根浓缩液分别用等体积的石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取三次，分别合并石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取层，减压回收相应溶剂，得到火把花根石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取物；步骤s40：将步骤s30中火把花根二氯甲烷萃取物上反相中压c18柱层析进行富集，以30％～80％乙腈梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行hplc检测合并浓缩，雷公藤对醌a被富集到lf04中；步骤s50：将步骤s40中得到的流分lf04进行反相高压c18柱层析制备纯化，以50％～60％的乙腈水梯度洗脱，收集含有雷公藤对醌a的流分，浓缩、冻干获得雷公藤对醌a。2.如权利要求1所述一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法，其特征在于：所述步骤s10加入90％的乙醇量为10倍，加热回流提取条件如下：提取温度为80～85℃；回流提取时间为2～3h；提取次数2次。3.如权利要求1或2所述一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法，其特征在于：所述步骤s40中所用的反相中压c18硅胶为100～200目。4.如权利要求1所述一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法，其特征在于：取少量得到的雷公藤对醌a样品，以甲醇溶解后配制成约0.5mg/ml的溶液，采用hplc高效液相色谱法进行检测。5.如权利要求4所述一种从火把花根药材中提取雷公藤对醌a的方法，其特征在于：采用的hplc高效液相色谱法其色谱条件为，色谱柱：agilent extend-c
18
,4.6x250mm,5μm；流动相：水(a)-乙腈(b)梯度洗脱(0～25min，70％a～20％a；25～26.1min，20％a～0％a；26.1～30min，0％a)；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：260nm；进样量：10μl。

技术总结
本发明涉及药用植物活性成分的提取技术领域，具体公开一种从火把花根药材中分离提取雷公藤对醌A的方法，该方法以火把花根药材为原料，经粉碎，回流提取，萃取，反相中压C18柱层析、反相高压C18柱层析等步骤得到雷公藤对醌A单体。本方法简单、快速，具有较高的社会经济价值，得到的雷公藤对醌A纯度高(99.72％)，为后续研究其药理活性以及免疫新药的开发奠定基础。础。础。


技术研发人员：王江瑞 柳雨影 曾钦 王学政 赵建权
受保护的技术使用者：重庆市药研院制药有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/20