一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法与流程

一种利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析领域，特别是涉及一种利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法。


背景技术：

2.重组新型冠状病毒疫苗(cho细胞)现行检验标准为鲎试剂检查法，给出的结果是阴或是阳，无法准确知道其中内毒素含量。另外，鲎被列为国家二级保护动物，2019年3月世界自然保护联盟(iucn)正式宣布中华鲎“濒危”。意味着内毒素检测试剂原料将受到严格管控。因此寻求替代测试方法迫在眉睫。
3.c因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组c因子是人工合成的c因子，它被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。重组c因子(recombinant factor c，rfc)法系依据内毒素浓度和其孵育终止时的荧光值之间的量化关系来测定内毒素含量。而目前，重组c因子法在鲎资源保护方面起到重要作用，但因为其试剂盒价格高，技术虽成熟但在未得到普遍应用，国内对其应用研究的少，对疫苗等内毒素检测鲜有报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法采用重组c因子法(rfc法)定量检测重组新型冠状病毒疫苗内毒素含量，相比现有利用鲎试剂检测内毒素的方法，特异性强、灵敏度高，且更准确更环保。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，包括以下步骤：
7.(1)用tris缓冲液稀释工作标准品cse至少四个浓度，建立标准曲线；
8.(2)用tris缓冲液稀释新型冠状病毒疫苗后加入微孔板，再加入反应混合液，37℃孵育，在0h和1h时在酶标仪读数；其中，所述反应混合液包括缓冲液、荧光底物和重组c因子；
9.(3)根据步骤(2)读出的数据，利用所建立的标准曲线计算出新型冠状病毒疫苗中细菌毒素的含量。
10.优选的是，所述方法还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为含5.0eu/ml的内毒素标准品。
11.优选的是，所述工作标准品的稀释浓度分别为50eu/ml、5eu/ml、0.5eu/ml以及0.05eu/ml。
12.优选的是，所述新型冠状病毒疫苗的稀释倍数为50-200倍。
13.优选的是，所述新型冠状病毒疫苗和所述反应混合液的体积比为1∶1。
14.优选的是，所述反应混合液中缓冲液、荧光底物和重组c因子的体积比为8∶1∶1。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.本发明采用重组c因子法定量检测重组新型冠状病毒疫苗(cho细胞)内毒素的方法，该方法通过选用tris缓冲液作为稀释剂，比细菌内毒素检测用水所需要的稀释倍数要少20倍(一般用重组c因子试剂盒检测细菌内毒素时，使用细菌内毒素检查用水需稀释1000倍)；另外，因受疫苗中铝佐剂的干扰，本发明在微孔板中提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白来对内毒素进行特异性结合，之后通过elisa的步骤去除干扰成分，可以实现特异性、高灵敏度的检测新型冠状病毒疫苗内毒素的目的。
17.本发明的方法实现了定量检测实际内毒素含量的目的，在确定了内毒素限值和稀释倍数后，可直接对待测供试品进行检测，无需再次进行试验来确定稀释倍数，作为鲎试剂的重组替代品，从生产工艺来说应比自然提取的鲎试剂生物变异更小，批间一致性更高，有利于检测方法的标准化，并且保护鲎资源。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为本发明利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素时微孔板布局示意图；
20.图2为本发明利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的原理图。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即
意指包含但不限于。
26.实施例1
27.(1)仪器的增益调节
28.调节增益值：tris缓冲液将配套的工作标准品(cse)溶解，置混旋仪上1400rpm充分混合10min以上，标的浓度为500eu/ml。然后用tris缓冲液稀释10倍、100倍(每步骤1min以上)，将5eu/ml的标准品液100μl加入微孔板上右下角的6个孔(f11-h12)，移去其他可拼拆的测试孔部分。置入酶标仪中，将微孔板(该微孔板提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白，来自法国hyglos gmbh公司试剂盒，货号609033)预热至37℃，并按比例配制反应混合液(560μl缓冲液∶70μl荧光底物∶70μl重组c因子，三种试剂均购自法国hyglos gmbh公司，货号609033)，向每孔中添加100μl。完成读数，并记录最优增益值。
29.增益值调节结果见表1。
30.表1调节增益值结果
[0031][0032]
(2)标准曲线的建立
[0033]
将已经溶解并充分混合的工作标准品(cse)，用tris缓冲液连续稀释至标的值50eu/ml、5eu/ml、0.5eu/ml、0.05eu/ml，按图1将每个稀释度的2个重复加入微孔板左上角的8个孔(a01-d02)，从而建立覆盖4个浓度稀释度的标准曲线，得标准曲线方程和r。
[0034]
(3)干扰实验及内毒素检测
[0035]
该疫苗企业标准规定内毒素限值为：每1ml含内毒素的量应小于10eu。
[0036]
供试品溶液的制备：取三批重组新型冠状病毒疫苗(cho细胞)，分别用tris缓冲液稀释50倍、100倍、200倍。
[0037]
供试品阳性对照溶液(ppc)的制备：配制含上述供试品浓度并含细菌内毒素浓度5.0eu/ml的溶液。
[0038]
取上述溶液按100μl/孔按图1加样(g01-h06)。按图1将4个重复的tris缓冲液加入微孔板标准曲线下的4个孔(e01-f02)，作为阴性对照。在每个样品中选择靠外的2个孔加入供试品阳性对照溶液。
[0039]
完成加样后，向所有的反应孔(去除可拼拆部分)中加入20μl的结合缓冲液(10mm ph7.2pbs溶液)，用盖箔密封后放入37℃以450rpm连续摇动混合90分钟以上。小心取出后撕开盖箔，快速翻转微孔板并将液体甩出至水槽中。再向每孔加入150μl的洗脱缓冲液(0.15m ph7.4的pbst溶液)，重复三次完成洗涤。
[0040]
在酶标仪上运行样品检测流程，将微孔板预热至37℃，并按比例配制反应混合液(4800μl缓冲液∶600μl荧光底物(sub)∶600μl重组c因子)，向每孔中添加100μl。60分钟后完成读数，干扰实验及检测结果见表2，检测原理见图2。
[0041]
每个浓度供试品的内毒素浓度＝两孔实测的平均值*稀释倍数
[0042]
表2rfc法干扰实验及检测结果
[0043][0044]
表2结果表明：三批供试品在50倍以上稀释时均无干扰，细菌内毒素计算值均符合质量标准要求。由于本次实验标准曲线的最低值为0.05eu/ml，故检测低于0.05时，只能给予小于0.05的结果，从上表可以看出，三批样品里所含内毒素是小于2.5eu/ml的，低于限值10eu/ml。
[0045]
现行检验标准是采用鲎试剂凝胶法检查内毒素，但不能定量检测出具体内毒素含量，且鲎被列为国家二级保护动物，传统鲎试剂的方法逐步会被替代。发明人2022年度做了微量鲎试剂动态显色法，减少了鲎试剂的使用量，但并没有真正意义上不使用鲎试剂。能定量检测，但精密度不及rfc法。而通过上述实施例可以看出，本发明采用重组c因子利用光度法进行定量，得到精确定量的检测结果，并通过计算机化软件进行电子记录的保存，更好地符合制药行业的数据可靠性要求。作为鲎试剂的重组替代品，从生产工艺来说应比自然提取的鲎试剂生物变异更小，批间一致性更高，有利于检测方法的标准化，且更环保。综上所述，本发明在进行重组新型冠状病毒疫苗(cho细胞)质量检定时，重组c因子法是可靠而精准的检测法。从检测流程和结果上更符合国际的通识，且完全不使用鲎试剂，对我国鲎资源的保护具有积极的帮助。
[0046]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种利用重组c因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用tris缓冲液稀释工作标准品cse至少四个浓度，建立标准曲线；(2)用tris缓冲液稀释新型冠状病毒疫苗后加入微孔板，再加入反应混合液，37℃孵育，在0h和1h时在酶标仪读数；其中，所述反应混合液包括缓冲液、荧光底物和重组c因子；(3)根据步骤(2)读出的数据，利用所建立的标准曲线计算出新型冠状病毒疫苗中细菌毒素的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为含5.0eu/ml的内毒素标准品。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工作标准品的稀释浓度分别为50eu/ml、5eu/ml、0.5eu/ml以及0.05eu/ml。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗的稀释倍数为50-200倍。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗和所述反应混合液的体积比为1∶1。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应混合液中缓冲液、荧光底物和重组c因子的体积比为8∶1∶1。

技术总结
本发明公开了一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，属于药物分析领域。本发明采用重组C因子法定量检测重组新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，通过选用Tris缓冲液作为稀释剂，相比细菌内毒素检测水作为稀释剂，大大减少了稀释倍数；另外，因受疫苗中铝佐剂的干扰，该方法采用欧洲药典提到的特异性结合的方法，即在微孔板中提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白来对内毒素进行特异性结合，之后通过ELISA的步骤去除干扰成分，实现了定量检测新型冠状病毒疫苗内毒素，并且具有特异性强、灵敏度高，以及更准确更环保的优势。以及更准确更环保的优势。以及更准确更环保的优势。


技术研发人员：刘骅 丁震 孙备 阚家义 许雷鸣 方芳
受保护的技术使用者：安徽省食品药品检验研究院（安徽国家农副加工食品质量监督检验中心）
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/20