一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体及其制备方法。


背景技术：

2.水凝胶是一种具有三维网状交联结构的高分子材料，通过将部分疏水基团和亲水残基引入水溶性高分子而形成，因具有性质柔软、能保持一定的形状、能吸收大量的水分、且生物相容性好的优点，水凝胶被广泛应用于支架涂层、细胞载体、组织工程以及药物载体等领域。
3.其中水凝胶作为药物载体时，现有的载药方式主要为直接将药物混合于水凝胶中进行负载，这种负载方式虽然制备方法简单易于操作，但是使用过程中，药物随着水凝胶的降解在短时间内直接释放，药效持续时间较短。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是：为了解决现有技术中水凝胶作为药物载体时，药效持续时间较短的问题，本发明提供一种可注射水凝胶微球载体的制备方法，该制备方法通过将醛基化脂质体与水凝胶通过席夫碱相结合，提高结构的稳定性，延长药物释放时间，解决了现有技术中水凝胶作为药物载体时药效持续时间较短的问题。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，包括如下步骤：
7.s1：通过逆向蒸发法制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液；
8.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
9.s3：将所述gelma水凝胶微球与所述醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液；
10.s4：室温下，于恒温摇床使所述混合液反应，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现所述醛基化巨噬细胞靶向脂质体和所述gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到巨噬细胞靶向水凝胶微球载体。
11.可选地，步骤s1包括：
12.s11：将磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和醛基磷脂溶解于有机溶剂中，得到反应溶液；
13.s12：使用旋转蒸发器除去所述反应溶液中的有机溶剂，得到胶体产品；
14.s13：向所述胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
15.s14：采用聚碳酸酯膜无菌过滤器对所述脂质体乳液进行过滤，得到醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液。
16.可选地，步骤s11中的原料还包括二氢辣椒素。
17.可选地，步骤s11中的有机溶剂为三氯甲烷。
18.可选地，步骤s11中二氢辣椒素、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、醛基磷脂以及有机溶剂的用量比值为(1-5)mg：(90-100)mg：(20-30)mg：(7-8)mg：(8-15)mg：5ml。
19.可选地，步骤s2包括：
20.s21：将肉豆蔻酸异丙酯与司盘80混合，得到第一溶液；
21.s22：将gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐在避光条件下溶解于去离子水中，得到第二溶液；
22.s23：以所述第一溶液作为油相，与同轴静电纺丝针头的外径相连；以所述第二溶液作为分散相，与所述同轴静电纺丝针头的内径相连；
23.s24：在50℃恒温条件下，分别以恒定速率将所述第一溶液与所述第二溶液推进所述同轴静电纺丝针头的外径和内径，以所述第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球；
24.s25：利用蓝光对所述水凝胶微球进行照射，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；
25.s26：吸去所述混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，得到gelma水凝胶微球水溶液；
26.s27：将所述gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥48-72小时，得到gelma水凝胶微球。
27.可选地，步骤s22中gelma的取代度为20％-50％。
28.可选地，步骤s21中肉豆蔻酸异丙酯与司盘80的体积比为9:1。
29.可选地，步骤s22中gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的质量比为9:1。
30.本发明的另一目的在于提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体，通过如上所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法进行制备。
31.本发明的有益效果是：
32.本发明提供的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，通过制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，使得脂质体表面带有醛基，进而能够使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体表面的醛基与gelma水凝胶微球表面的氨基通过席夫碱反应，进行接枝，从而使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体涂装于gelma水凝胶微球表面，提高脂质体与水凝胶微球之间的结合力；通过该方法制备的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的药物释放过程包括席夫碱健的破碎、水凝胶的降解和脂质体的破裂，从而有助于延长药物释放时间，增加药效持续时间。
附图说明
33.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
34.图1是本发明实施例1制备的lip@pla的形貌及物理特征；
35.图2是动态光散射粒径分析仪检测的本发明实施例1制备的lip@pla的表面电荷；
36.图3是本发明实施例1制备的gelma水凝胶微球与glema@lip@pla的形貌及物理特征；
37.图4是本发明实施例1制备的lip@pla、gelma水凝胶微球与glema@lip@pla的物理表征；
38.图5是动态光散射粒径分析仪检测的本发明对比例1制备的lip的表面电荷；
39.图6是本发明中gelma@lip@pla微球的降解曲线；
40.图7是本发明应用实施例中pcdna3.1-akt在lip@pla和gelma@lip@pla微凝胶中的释放曲线。
具体实施方式
41.现在对本发明作进一步详细的说明。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于简化描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性，或隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定为“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
43.为解决现有技术中水凝胶作为药物载体时，药效持续时间较短的问题，本发明提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
44.s1：通过逆向蒸发法制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液；
45.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
46.s3：将gelma水凝胶微球与醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液；
47.s4：室温下，于恒温摇床使混合液反应，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现醛基化巨噬细胞靶向脂质体和gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到巨噬细胞靶向水凝胶微球载体。
48.本发明提供的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，通过制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，使得脂质体表面带有醛基，进而能够使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体表面的醛基与gelma水凝胶微球表面的氨基通过席夫碱反应，进行接枝，从而使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体涂装于gelma水凝胶微球表面，提高脂质体与水凝胶微球之间的结合力；通过该方法制备的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的药物释放过程包括席夫碱健的破碎、水凝胶的降解和脂质体的破裂，从而有助于延长药物释放时间，增加药效持续时间。
49.具体的，本发明优选步骤s1包括：
50.s11：将磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和醛基磷脂溶解于有机溶剂中，得到反应溶液；
51.s12：完全溶解后所得到的的反应溶液通过超声波进一步混合，其后使用旋转蒸发器除去反应溶液中的有机溶剂，得到胶体产品；
52.s13：向胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
53.s14：脂质体乳液经过超声波进一步均匀混合分散，其后采用聚碳酸酯膜无菌过滤器对脂质体乳液进行过滤，得到均匀的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液。
54.本发明优选步骤s14中采用450nm及220nm聚碳酸酯膜无菌过滤器进行过滤。
55.本发明提供的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，通过磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和醛基磷脂来制备具有醛基化的巨噬细胞靶向脂质体，一方面使得该脂质体能够通过醛基与水凝胶的氨基形成席夫碱来进行接枝，使得脂质体通过化学键连接于水凝胶的外侧，延长以水凝胶作为药物载体时药物的降解时间，另一方面使用含磷脂酰丝
氨酸脂质体模拟细胞凋亡后细胞膜破裂，诱导巨噬细胞主动识别、募集和吞噬，提高治疗效果。
56.本发明通过逆向蒸发法制备了醛基化巨噬细胞靶向脂质体，并研究了不同直径的脂质体具有不同的吞噬能力，研究表明，直径越大的醛基化巨噬细胞靶向脂质体，内吞作用越好。
57.此外，本发明中的醛基化巨噬细胞靶向脂质体还可根据具体的治疗需求添加相应的药物；具体的，本发明步骤s11中的原料还包括二氢辣椒素(dhc)；即，上述步骤s11包括：将二氢辣椒素、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和醛基磷脂溶解于有机溶剂中，得到反应溶液。
58.通过引入dhc，使得脂质体对dhc进行包封，因此，dhc的释放主要取决于席夫碱的破碎、微凝胶的降解和脂质体的破裂，进一步提高缓释性能。
59.本发明进一步优选步骤s11中的有机溶剂为三氯甲烷。
60.为兼顾醛基化巨噬细胞靶向脂质体的内吞效果以及与水凝胶的反应性，本发明优选步骤s11中二氢辣椒素、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、醛基磷脂以及有机溶剂的用量比值为(1-5)mg：(90-100)mg：(20-30)mg：(7-8)mg：(8-15)mg：5ml。
61.本发明优选步骤s2包括：
62.s21：将肉豆蔻酸异丙酯与司盘80混合，得到第一溶液；
63.s22：将gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐在避光条件下溶解于去离子水中，得到第二溶液；
64.s23：以第一溶液作为油相，与同轴静电纺丝针头的外径相连；以第二溶液作为分散相，与同轴静电纺丝针头的内径相连；
65.s24：在50℃恒温条件下，分别以恒定速率将第一溶液与第二溶液推进同轴静电纺丝针头的外径和内径，以第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球；
66.s25：利用蓝光对水凝胶微球进行照射，促使水凝胶微球在第一溶液中固化并沉淀，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物。
67.s26：待gelma水凝胶微球在第一溶液中完全沉淀静置后，尽可能吸去混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液，使其与丙酮溶液充分混合后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，重复多次，得到gelma水凝胶微球水溶液；
68.s27：将gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥48-72小时，得到gelma水凝胶微球。
69.本发明优选同轴静电纺丝针头的内径与外径分别为31g和21g；并优选选用50ml注射器抽取第一溶液作为油相，用连接管连接21g同轴静电纺丝针头的外径管口；选用5ml注射器避光抽取第二溶液作为分散相，用连接管连接31g同轴静电纺丝针头的内径管口；再将50ml及5ml注射器分别连接微量注射泵，调节微量注射泵两相流速，在50℃恒温下，以恒定速率推进，分散相被油相切割，形成均一分散的水凝胶微球。
70.本发明通过微流控的方法，成功制备了gelma水凝胶微球；由于其良好的生物相容性、多孔结构和优异的细胞负载性能，gelma水凝胶及其微凝胶状态已被广泛应用于骨再生等研究领域。本发明以gelma水溶液作为分散相，肉豆蔻酸异丙酯和司盘80作为油相，通过固定速度下油相相对于分散相的切割，形成了均匀大小的gelma水凝胶微球；不同的速度影
响微凝胶是否能形成球体以及这些球体的大小，本发明优选分散相和油相的速度分别维持在平均15μl/min和500μl/min。
71.为兼顾成型性以及反应性，本发明优选步骤s22中gelma为低取代gelma，并具体优选gelma的取代度为20％-50％，进一步优选为30％，以便于使得gelma表面残留的氨基与上述制备的醛基化巨噬细胞靶向脂质体表面的醛基反应形成希夫碱，醛基化巨噬细胞靶向脂质体包覆在gelma水凝胶微球表面形成巨噬细胞靶向工程重编程微/纳米微球载体。此外，gelma水凝胶微球网络中的氧、氮元素与磷脂中的氮、磷、氧元素形成氢键并相互作用，进一步将脂质体锚定在微凝胶中，提高稳定性，增强缓释效果。
72.本发明优选步骤s21中肉豆蔻酸异丙酯与司盘80的体积比为9:1，步骤s22中gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的质量比为9:1。
73.本发明优选步骤s3具体包括：将gelma水凝胶微球与两倍体积的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液。
74.本发明的另一目的在于提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体，通过如上所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法进行制备。
75.本发明提供的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体，通过制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，使得脂质体表面带有醛基，进而能够使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体表面的醛基与gelma水凝胶微球表面的氨基通过席夫碱反应，进行接枝，从而使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体涂装于gelma水凝胶微球表面，提高脂质体与水凝胶微球之间的结合力；通过该方法制备的水凝胶微球载体的药物释放过程包括席夫碱健的破碎、水凝胶的降解和脂质体的破裂，从而有助于延长药物释放时间，增加药效持续时间。
76.本发明基于骨免疫微环境在骨缺损及骨再生修复机制中的重要作用，以及巨噬细胞在其中起的关键作用，提供了一款可以注射的专注于巨噬细胞相关免疫调控的微球，在起局部支撑作用的同时，可以通过调控巨噬细胞及骨免疫微环境，对关键基因进行重编程，以期通过保守治疗的方式，促进骨缺损后的骨再生。本发明首先利用破裂细胞膜主要成分磷脂酰丝氨酸、胆固醇、磷脂酰胆碱及醛基磷脂，构建了靶向巨噬细胞的脂质体；其次，通过微流控技术制备了gelma水凝胶微球，一种优异生物相容性及利于细胞粘附长入的高分子材料，并以此作为基础载体，利用其表面残留的氨基，与巨噬细胞靶向脂质体通过席夫碱反应，进行接枝，以达到在微球表面“涂装”稳定的巨噬细胞靶向脂质体的涂层的作用。本发明通过对最终制备的靶向巨噬细胞微/纳米水凝胶微球载体的表征及理化特性进行了充分的分析，结果证实了该微/纳米结构的多孔及稳定结构，对本发明的设计初衷及反应途径提供了良好的理论证据，也为后续细胞和动物实验提供基础。
77.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
78.实施例1
79.本实施例提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，包括如下步骤：
80.s1：醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液的制备：
81.s11：称取磷脂酰胆碱(96mg)、磷脂酰丝氨酸(24mg)、胆固醇(7.2mg)和醛基磷脂(10.8mg)，溶解于5ml三氯甲烷中，得到反应溶液；
82.s12：完全溶解后所得到的溶液通过超声波进一步混合，其后使用旋转蒸发器除去
有机溶剂，得到胶体产品；
83.s13：向得到的胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
84.s14：脂质体乳液经过超声波进一步均匀分散，其后采用450nm及220nm聚碳酸酯膜无菌过滤器进行过滤，得到均匀的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，记为lip@pla。
85.参见图1-图2所示，对本实施例制备的lip@pla进行检测；其中图1(a)为本实施例制备的lip@pla的透射电镜图，图1(b)为本实施例制备的lip@pla的扫描电子显微照片，图1(c)为本实施例制备的lip@pla的尺寸分布。
86.通过tem，可以观察到lip@pla脂质体为典型磷脂双分子层结构(图1a)；在lip@pla脂质体进行冻干后，通过扫描电镜进行了观察，冻干的lip@pla脂质体形状不均匀，彼此之间没有明显的边界；由于磷脂酰胆碱的油性，冻干lip@pla脂质体很难保持均匀的晶体状颗粒状态(图1b)；动态光散射粒径分析仪检测结果表明，lip@pla脂质体的平均表面电荷为-30.92mv；而lip@pla脂质体的平均粒径为235.66nm；
87.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
88.s21：取肉豆蔻酸异丙酯90ml与司盘80液体10ml，以9:1比例混合，缓慢搅拌形成均匀一致的液体，得到第一溶液；
89.s22：称取低取代gelma(30％取代度)粉末450mg，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐50mg，避光条件下溶解于5ml去离子水中，并于60℃水浴中震荡10分钟，加速溶解，直至形成均匀一致液体，得到第二溶液；
90.s23：选用50ml注射器抽取第一溶液作为油相，用连接管连接21g同轴静电纺丝外径管口；选用5ml避光注射器抽取第二溶液作为分散相，用连接管连接31g同轴静电纺丝内径管口；
91.s24：将50ml及5ml注射器分别连接微量注射泵，调节微量注射泵两相流速，在50℃恒温下，以恒定速率推进，将第一溶液与第二溶液推进同轴静电纺丝针头的外径和内径，分散相被油相切割，以第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球形成均一分散水凝胶微球；其中第一溶液和第二溶液的平均速度分别维持在500μl/min和15μl/min；
92.s25：收集得到的水凝胶微球，利用蓝光对水凝胶微球进行照射，促使水凝胶微球在第一溶液中固化并沉淀，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；
93.s26：待gelma水凝胶微球在第一溶液中完全沉淀静置后，尽可能吸去混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液，使其与丙酮溶液充分混合后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，重复多次，得到gelma水凝胶微球水溶液，并用显微镜进行观察并拍照；
94.s27：将gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥60小时，得到gelma水凝胶微球，并用sem电镜进行观察；
95.s3：将gelma水凝胶微球与两倍体积的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液；
96.s4：室温下，于恒温摇床使混合液反应24小时，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现醛基化巨噬细胞靶向脂质体和gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到水凝胶微球载体，记为glema@lip@pla。
97.参见图3所示，对gelma水凝胶微球与glema@lip@pla进行检测；其中图3(a)为油相中单分散的gelma水凝胶微球及其粒径分布；图3(b)为gelma水凝胶微球的扫描电子显微图
像；图3(c)为glema@lip@pla的扫描电子显微图像。
98.从图3(b)与图3(c)看出，冻干后的gelma水凝胶微球呈现多孔结构，通过席夫碱，表面残留醛基的巨噬细胞靶向脂质体lip@pla被接枝于gelma水凝胶微球，使其表面形成了脂质体涂层，从而形成了较浅的多孔结构。
99.本发明通过希夫碱键将脂质体接枝固定在gelma水凝胶微球上，增加了微凝胶脂质体的负载，也为微环境中负载的缓释提供了依据。
100.为了验证成功接枝，参见图4所示，其中图4(a)为lip@pla,gelma和gelma@lip@pla的x射线光电子能谱，图4(b)为lip@pla,gelma和gelma@lip@pla的傅里叶变换红外光谱；本发明首先进行了x射线光电子能谱检测，碳峰(c 284.8ev)、氮峰(n 400.0ev)、氧峰(o 532.0ev)和磷峰(p 133.0ev)的x射线光电子能谱表明，gelma和gelma@lip@pla均含有c、n和o，其中lip@pla组的n含量(1.53％)显著低于其他两组(分别为17.77％和7.21％)。另外，gelma组未观察到磷峰，而lip@pla和gelma@lip@pla组有磷峰，提示有希夫碱组合；接着，我们利用傅里叶变换红外光谱研究了脂质体及gelma微球表面结构化学键的变化。与gelma@lip@pla相比，gelma在3307.75cm-1
有明显的nh2带，lip@pla在3012.92cm-1
、3333.54cm-1
和3387.86cm-1
有明显的nh2带；gelma@lip@pla没有表现出典型的nh2带，引入含有卵磷脂的dspe-peg-cho后，在1739.76cm-1
处观察到一条c＝o带，在gelma@lip@pla中在1633.23cm-1
处出现一条-c＝n-带，表明形成了-c＝n-键；证实lip@pla通过形成席夫碱稳定地接枝在gelma微凝胶支架表面。
101.实施例2
102.本实施例与实施例1的区别为，步骤s22中gelma粉末的取代度为20％。
103.本实施例中的检测过程及检测结果参见实施例1中相关内容。
104.实施例3
105.本实施例与实施例1的区别为，步骤s22中gelma粉末的取代度为50％。
106.本实施例中的检测过程及检测结果参见实施例1中相关内容。
107.实施例4
108.本实施例提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，包括如下步骤：
109.s1：醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液的制备：
110.s11：称取dhc(3mg)、磷脂酰胆碱(96mg)、磷脂酰丝氨酸(24mg)、胆固醇(7.2mg)和醛基磷脂(10.8mg)，溶解于5ml三氯甲烷中，得到反应溶液；
111.s12：完全溶解后所得到的溶液通过超声波进一步混合，其后使用旋转蒸发器除去有机溶剂，得到胶体产品；
112.s13：向得到的胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
113.s14：脂质体乳液经过超声波进一步均匀分散，其后采用450nm及220nm聚碳酸酯膜无菌过滤器进行过滤，得到均匀的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，记为负载dhc的lip@pla；
114.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
115.s21：取肉豆蔻酸异丙酯90ml与司盘80液体10ml，以9:1比例混合，缓慢搅拌形成均匀一致的液体，得到第一溶液；
116.s22：称取低取代gelma(30％取代度)粉末450mg，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷
酸锂盐50mg，避光条件下溶解于5ml去离子水中，并于60℃水浴中震荡10分钟，加速溶解，直至形成均匀一致液体，得到第二溶液；
117.s23：选用50ml注射器抽取第一溶液作为油相，用连接管连接21g同轴静电纺丝外径管口；选用5ml避光注射器抽取第二溶液作为分散相，用连接管连接31g同轴静电纺丝内径管口；
118.s24：将50ml及5ml注射器分别连接微量注射泵，调节微量注射泵两相流速，在50℃恒温下，以恒定速率推进，将第一溶液与第二溶液推进同轴静电纺丝针头的外径和内径，分散相被油相切割，以第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球形成均一分散水凝胶微球；其中第一溶液和第二溶液的平均速度分别维持在500μl/min和15μl/min；
119.s25：收集得到的水凝胶微球，利用蓝光对水凝胶微球进行照射，促使水凝胶微球在第一溶液中固化并沉淀，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；
120.s26：待gelma水凝胶微球在第一溶液中完全沉淀静置后，尽可能吸去混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液，使其与丙酮溶液充分混合后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，重复多次，得到gelma水凝胶微球水溶液，并用显微镜进行观察并拍照；
121.s27：将gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥60小时，得到gelma水凝胶微球，并用sem电镜进行观察；
122.s3：将gelma水凝胶微球与两倍体积的负载dhc的lip@pla混合，得到混合液；
123.s4：室温下，于恒温摇床使混合液反应24小时，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现醛基化巨噬细胞靶向脂质体和gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到负载dhc的水凝胶微球载体，记为负载dhc的glema@lip@pla。
124.本实施例中的检测过程及检测结果参见实施例1中相关内容。
125.对比例1
126.本对比例提供一种水凝胶微球载体的制备方法，包括如下步骤：
127.s1：脂质体乳悬液的制备：
128.s11：称取磷脂酰胆碱(160mg)和胆固醇(40mg)，溶解于5ml三氯甲烷中，得到反应溶液；
129.s12：完全溶解后所得到的溶液通过超声波进一步混合，其后使用旋转蒸发器除去有机溶剂，得到胶体产品；
130.s13：向得到的胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
131.s14：脂质体乳液经过超声波进一步均匀分散，其后采用450nm及220nm聚碳酸酯膜无菌过滤器进行过滤，得到均匀的脂质体乳悬液，记为lip。
132.参见图5所示，对本对比例制备的lip进行检测；动态光散射粒径分析仪检测结果表明，lip脂质体的平均表面电荷为-2.09mv，lip脂质体的粒径大小为103.1
±
20.62nm；
133.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
134.s21：取肉豆蔻酸异丙酯90ml与司盘80液体10ml，以9:1比例混合，缓慢搅拌形成均匀一致的液体，得到第一溶液；
135.s22：称取低取代gelma(30％取代度)粉末450mg，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐50mg，避光条件下溶解于5ml去离子水中，并于60℃水浴中震荡10分钟，加速溶解，直至形成均匀一致液体，得到第二溶液；
136.s23：选用50ml注射器抽取第一溶液作为油相，用连接管连接21g同轴静电纺丝外径管口；选用5ml避光注射器抽取第二溶液作为分散相，用连接管连接31g同轴静电纺丝内径管口；
137.s24：将50ml及5ml注射器分别连接微量注射泵，调节微量注射泵两相流速，在50℃恒温下，以恒定速率推进，将第一溶液与第二溶液推进同轴静电纺丝针头的外径和内径，分散相被油相切割，以第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球形成均一分散水凝胶微球；其中第一溶液和第二溶液的平均速度分别维持在500μl/min和15μl/min；
138.s25：收集得到的水凝胶微球，利用蓝光对水凝胶微球进行照射，促使水凝胶微球在第一溶液中固化并沉淀，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；
139.s26：待gelma水凝胶微球在第一溶液中完全沉淀静置后，尽可能吸去混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液，使其与丙酮溶液充分混合后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，重复多次，得到gelma水凝胶微球水溶液，并用显微镜进行观察并拍照；
140.s27：将gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥60小时，得到gelma水凝胶微球，并用sem电镜进行观察；
141.s3：将gelma水凝胶微球与两倍体积的lip脂质体乳悬液混合，得到混合液；
142.s4：室温下，于恒温摇床使混合液反应24小时，得到水凝胶微球载体，记为glema@lip。
143.参照实施例1中为验证成功接枝所做的检测，通过检测发现，本对比例中gelma与普通脂质体混合后，未检测到典型的-c＝n-带，表面无席夫碱产生。
144.为研究水凝胶微球载体的降解性能和药物释放动力学，以评估其作为药物传递载体的适用性，参见图6所示，本发明为了模拟在体内的逐渐降解过程，gelma@lip@pla微凝胶在含胶原酶(2u/ml)的pbs中37℃孵育4周，gelma@lip@pla微凝胶的残余质量随时间的增加而减小；降解是一个缓慢的过程，有利于延长药物释放。
145.本发明进一步提供如下应用实施例：
146.应用实施例1
147.s1：醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液的制备：
148.s11：称取磷脂酰胆碱(96mg)、磷脂酰丝氨酸(24mg)、胆固醇(7.2mg)和醛基磷脂(10.8mg)，溶解于5ml三氯甲烷中，得到反应溶液；
149.s12：完全溶解后所得到的溶液通过超声波进一步混合，其后使用旋转蒸发器除去有机溶剂，得到胶体产品；
150.s13：向得到的胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；
151.s14：脂质体乳液经过超声波进一步均匀分散，其后采用450nm及220nm聚碳酸酯膜无菌过滤器进行过滤，得到均匀的醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液，记为lip@pla；
152.取1ml离心管，加入100μl opti-mem；
153.将pcdna3.1-akt：lip@pla按照1:2.5比例，加入到溶液中，轻微摇晃后，混合物在25℃保持30min，得到负载pcdna3.1-akt的lip@pla；
154.按照实施例4中所述的方法制备负载dhc的lip@pla；
155.将负载pcdna3.1-akt的lip@pla与负载dhc的lip@pla等体积比例混合形成混合脂质体混悬液；
156.s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；
157.s21：取肉豆蔻酸异丙酯90ml与司盘80液体10ml，以9:1比例混合，缓慢搅拌形成均匀一致的液体，得到第一溶液；
158.s22：称取低取代gelma(30％取代度)粉末450mg，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐50mg，避光条件下溶解于5ml去离子水中，并于60℃水浴中震荡10分钟，加速溶解，直至形成均匀一致液体，得到第二溶液；
159.s23：选用50ml注射器抽取第一溶液作为油相，用连接管连接21g同轴静电纺丝外径管口；选用5ml避光注射器抽取第二溶液作为分散相，用连接管连接31g同轴静电纺丝内径管口；
160.s24：将50ml及5ml注射器分别连接微量注射泵，调节微量注射泵两相流速，在50℃恒温下，以恒定速率推进，将第一溶液与第二溶液推进同轴静电纺丝针头的外径和内径，分散相被油相切割，以第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球形成均一分散水凝胶微球；其中第一溶液和第二溶液的平均速度分别维持在500μl/min和15μl/min；
161.s25：收集得到的水凝胶微球，利用蓝光对水凝胶微球进行照射，促使水凝胶微球在第一溶液中固化并沉淀，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；
162.s26：待gelma水凝胶微球在第一溶液中完全沉淀静置后，尽可能吸去混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液，使其与丙酮溶液充分混合后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，重复多次，得到gelma水凝胶微球水溶液，并用显微镜进行观察并拍照；
163.s27：将gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥60小时，得到gelma水凝胶微球，并用sem电镜进行观察；
164.s3：将gelma水凝胶微球与两倍体积的混合脂质体混悬液混合，得到混合液；
165.s4：室温下，于恒温摇床使混合液反应24小时，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现醛基化巨噬细胞靶向脂质体和gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到水凝胶微球载体，记为负载dhc和pcdna3.1-akt的glema@lip@pla。
166.参见图7所示，与gelma@lip@pla组相比，lip@pla加载pcdna3.1-akt表现出快速释放行为，并且在第一周几乎完全释放。相比之下，gelma@lip@pla加载pcdna3.1-akt微凝胶表现出较慢的释放持续超过三周。这些结果表明，gelma@lip@pla微凝胶在降解期间表现出pcdna3.1-akt的持续释放，为药物浓度依赖的给药平台提供了一个有吸引力的选择。
167.本发明中主要材料与试剂见表1所示：
168.表1
[0169][0170][0171]
本发明中的表征方法如下：
[0172]
透射电镜(tem)：吸取2μl脂质体，滴到铜网上，25℃室温下干燥4小时。其后铜网样品在120kv电压下，使用透射电镜观察脂质体的表面形貌。
[0173]
物理特性(表面电荷及粒径分布)：吸取2ml脂质体乳悬液，通过动态光散射粒度分析仪检测，评估不同脂质体的物理特性。
[0174]
扫描电镜(sem)：吸取1ml脂质体乳悬液，-80℃冰箱冷冻24小时，其后利用真空冷冻干燥机进行冻干。其后利用导电胶将脂质体样品粘贴于sem的样品台上。使用离子溅射镀膜仪对样品进行表面喷金处理。在10kv加速电压下，使用sem观察冻干后的脂质体的形态并拍摄图片。
[0175]
傅里叶变换红外光谱分析(ftir)：将lip@pla冻干后的样品，以重量1：100的比例，分别加入溴化钾进行混合，然后使用研钵均匀研磨，压片机加压成薄片备用。使用atr-ftir扫描上述加压成型的样品。扫描参数设置为：扫描次数：128次；分辨率：4cm-1；扫描范围：400～4000cm-1。将所得数据使用origin软件绘制成曲线，分析不同组别化学键的异同。
[0176]
x射线光电子能谱仪分析(xps)：利用x射线光电子能谱技术对lip@pla冻干后的样品进行元素分析，所得数据使用origin软件绘制成曲线，分析不同组元素与化学键的区别。
[0177]
体外释放速率检测：lip@pla样品放置在含有10ml pbs的50ml离心管中。所有离心管置于37℃恒温振动筛中，循环120次/分钟。在第1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25和30天收集
释放的溶液，保存于-20℃，重新添加到新鲜10ml pbs中，并使用酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒进行评估。根据初始磷脂含量绘制累积释放曲线。
[0178]
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

技术特征：
1.一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：通过逆向蒸发法制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液；s2：通过微流控技术制备gelma水凝胶微球；s3：将所述gelma水凝胶微球与所述醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液；s4：室温下，于恒温摇床使所述混合液反应，通过醛基及氨基反应形成席夫碱，实现所述醛基化巨噬细胞靶向脂质体和所述gelma水凝胶微球的接枝，形成表面涂层，得到巨噬细胞靶向水凝胶微球载体。2.如权利要求1所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s1包括：s11：将磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和醛基磷脂溶解于有机溶剂中，得到反应溶液；s12：使用旋转蒸发器除去所述反应溶液中的有机溶剂，得到胶体产品；s13：向所述胶体产品中加入去离子水进行水化，得到脂质体乳液；s14：采用聚碳酸酯膜无菌过滤器对所述脂质体乳液进行过滤，得到醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液。3.如权利要求2所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s11中的原料还包括二氢辣椒素。4.如权利要求2所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s11中的有机溶剂为三氯甲烷。5.如权利要求3所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s11中二氢辣椒素、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、醛基磷脂以及有机溶剂的用量比值为(1-5)mg：(90-100)mg：(20-30)mg：(7-8)mg：(8-15)mg：5ml。6.如权利要求1所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s2包括：s21：将肉豆蔻酸异丙酯与司盘80混合，得到第一溶液；s22：将gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐在避光条件下溶解于去离子水中，得到第二溶液；s23：以所述第一溶液作为油相，与同轴静电纺丝针头的外径相连；以所述第二溶液作为分散相，与所述同轴静电纺丝针头的内径相连；s24：在50℃恒温条件下，分别以恒定速率将所述第一溶液与所述第二溶液推进所述同轴静电纺丝针头的外径和内径，以所述第一溶液为收集溶液，得到水凝胶微球；s25：利用蓝光对所述水凝胶微球进行照射，得到沉淀有gelma水凝胶微球和第一溶液的混合物；s26：吸去所述混合物中的第一溶液，加入丙酮溶液后，再加入去离子水，洗去丙酮及残存的第一溶液，得到gelma水凝胶微球水溶液；s27：将所述gelma水凝胶微球水溶液在-80℃条件下冷冻24小时，利用真空冷冻干燥机冻干燥48-72小时，得到gelma水凝胶微球。7.如权利要求6所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤
s22中gelma的取代度为20％-50％。8.如权利要求6所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s21中肉豆蔻酸异丙酯与司盘80的体积比为9:1。9.如权利要求6所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，其特征在于，步骤s22中gelma与苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的质量比为9:1。10.一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体，其特征在于，通过如权利要求1-9任一项所述的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法进行制备。

技术总结
本发明提供一种巨噬细胞靶向水凝胶微球载体及其制备方法，涉及生物医学技术领域；制备方法包括如下步骤：通过逆向蒸发法制备醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液；通过微流控技术制备加入光交联剂的Gelma水凝胶微球；将Gelma水凝胶微球在蓝光交联后，与醛基化巨噬细胞靶向脂质体乳悬液混合，得到混合液；室温下，于恒温摇床使混合液反应，得到水凝胶微球载体。本发明提供的巨噬细胞靶向水凝胶微球载体的制备方法，使得脂质体表面带有醛基，进而能够使得醛基化巨噬细胞靶向脂质体表面的醛基与Gelma水凝胶微球表面的氨基通过席夫碱反应，进行接枝，提高脂质体与水凝胶微球之间的结合力，有助于延长药物释放时间，增加药效持续时间。间。间。


技术研发人员：周鑫叠
受保护的技术使用者：常州市第二人民医院
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/7/20