一种重组流感病毒血凝素蛋白的分离纯化方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种简便分离纯化重组流感病毒血凝素蛋白(rha)的方法。


背景技术：

2.流感是一种高度传染性的急性病毒性呼吸道疾病(vaccine,2006,24,2176-2185)，流感常见的临床表现有：鼻塞、咳嗽、头痛、咽喉痛、食欲减退、肌肉酸痛等全身性不适，重症病例可引发呼吸衰竭或多脏器功能衰竭而导致死亡。因此，防治人类和动物感染流感病毒是一个重大挑战。
3.流感病毒是一种单股负链的rna病毒，属于正粘病毒科。分为a、b、c、d四种类型(virology 2011,414,51
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62)。血凝素抗原和神经氨酸酶抗原是主要的两种表面抗原。其中血凝素(hemagglutinin,ha)蛋白是流感病毒的主要保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体及保护性抗体。但流感病毒会通过抗原漂移和抗原漂变两种机制(handb.exp.pharm.2009,189,111
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154.)突变。抗原漂移主要是由于病毒的快速进化和rna聚合酶中缺乏校对机制发生点突变导致氨基酸序列的改变；而抗原移位是由于两种不同病毒的基因段发生变化，形成一种具有两种病毒特征的新病毒亚型。导致疫苗与毒株不匹配的现象，疫苗的有效性会降低，现有的流感疫苗接种保护率仅为40～60％；因此，每年的流感病毒疫苗需要更新。目前流感疫苗种类主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗及重组疫苗。重组疫苗因其不涉及活病毒且疫苗效果佳的优势，成为近几年研究的热点趋势。多种重组流感血凝素(rha)疫苗已被开发用于流感的预防，而其分离纯化面临着巨大挑战。
4.蛋白质提取和纯化程序占生产成本的最大比例；传统的纯化方法需要离子、疏水、鳌合树脂、亲和、凝胶过滤层析等其中多步柱层析结合使用。流感rha是一种膜蛋白，具有高度疏水性和/或两亲性，(biochem cell biol.2016,94,507-527)，而且膜蛋白的纯化需要借助表面活性剂将其从细胞膜环境中释放出来，在不存在表面活性剂的条件下膜蛋白会沉淀或变性(biochim biophys acta.2004,1666:105-17)；再加上膜蛋白在翻译完成后需要整合到细胞膜环境中，而细胞膜在细胞中占比较低，因而膜蛋白在细胞内的含量也较低(methods mol biol.2010,601:49-66.)。这都给流感rha的分离纯化带来了困难。wang k等人利用uno sphere q/sp-sepharose fast flow离子交换色谱柱纯化利用昆虫杆状病毒表达体系表达的来自a/new caledonia/20/99(h1n1)毒株的rha，其中q柱为非结合方式主要吸附杂蛋白，sp柱则以结合方式吸附rha，通过洗脱sp柱得到的蛋白，然后再利用羟基磷灰石hx-i色谱柱纯化rha提取物，再利用超滤除去小分子蛋白杂质，利用三步柱层析，将rha从发酵液提纯到95％的纯度，但总收率较低，只有57％(vaccine.2006,24:2176-85.)；且hx
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色谱柱单步损失较大(27％)。因不同表达体系表达的rha，无论是病毒种类，还是rha的表达量，还是杂质组成和含量均有较大的差异，该方法尚不能确定能够分离其他rha。
5.盐析萃取技术是以有机试剂做萃取剂、盐做盐析剂，在二者的综合作用下从水相中萃取疏水性和亲水性目标物质的一种分离方法。已广泛应用于大宗发酵产品、生物工程
产品、中草药、蛋白质和天然产物中有效成分及金属和其络合物的分离提取中。盐析萃取技术有很多优点：溶剂的成本与传统高聚物相比较低、溶剂粘度小，传质和分相速度快，减轻了相乳化现象，溶剂挥发度大，旋转蒸发得到被分离物质同时回收溶剂，适合大规模工业化生产。
6.中国发明专利cn102070714b采用乙醇18％(w/w)/磷酸氢二钾20％(w/w)体系放大实验，0.01-73l规模的平均回收率为100.4％、菌体的平均去除率达到99％，还可以去除87.2％的多糖；中国发明专利cn103288953a采用20％磷酸氢二钾(w/w)-14％乙醇(w/w)、ph 7.0盐析萃取体系直接从猪血浆中萃取igg与白蛋白后，盐析萃取能明显去除部分杂质蛋白，葡萄糖的去除率达51.82％，再偶联柱层析，可得到高纯度白蛋白和igg，白蛋白和igg样品经非还原sds-page分析均显现单一条带，光密度扫描显示纯度大于99％。然而因为白蛋白、igg与流感rha的结构和性质差异很大，从白蛋白和igg摸索得到的盐析萃取条件无法用于流感rha的分离纯化。
7.在给定温度下，当表面活性剂浓度达到一定值，表面活性剂单体自发聚集成胶束，并逐步聚集成不溶于水，两相溶液，称为浊点萃取，主要利用表面活性剂溶液的增溶和分相实现溶质的富集与分离；近几年来广泛应用于金属离子(anal chim acta.2023apr 22；1251:340992)、生物大分子、临床药物检测、食品中农兽药残留、有毒污染物及中药成分分离分析。无机盐会影响表面活性剂的成相，缩短分相时间，然而和盐析萃取不同，浊点萃取不添加有机溶剂，使用的无机盐主要是一价盐nacl、kcl或惰性盐，而盐析萃取需要添加有机溶剂才能成相，一般使用二价盐，如硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钠等，nacl，kcl等一价盐或惰性盐在盐析萃取中作用不大。有文章报道基于triton x-114的浊点萃取对甜菜根膜蛋白进行连续相分离(anal biochem,2009,387:280-286)；malen等(proteomics,2008,8,1859-1870)对牛型分枝杆菌培养物去细胞碎片上清中的疏水性膜和膜蛋白进行初步分离：tani等利用triton x-114经初步热分离后，单次两相分离，从大肠杆菌中分离出丙酮酸氧化酶，收集含有95％酶的富表面活性剂相，超离心进一步纯化，纯化后的酶被回收为颗粒，收率为52％，纯化因子为13.6(trac trends in analytical chemistry,1995,14(5):213-7.)。但目前尚没有关于浊点萃取或者含有表面活性剂的双液相体系分离纯化流感rha的报道。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明的目的是提供一种具有蛋白含量高，收率高，易于规模化，且应用广泛，绿色的rha蛋白的分离纯化方法，本发明使用由表面活性剂、有机溶剂和无机盐形成的盐析体系对rha萃取，同时实现了蛋白浓缩和杂质去除，盐析萃取后的rha经离子交换层析法和凝胶层析进一步纯化，可得到纯rha。而传统纯化方法，除了离子交换层析和凝胶层析以外，还需要经过羟基磷灰石层析才能获得rha，本发明提供的方法具有操作简单、收率高、低成本、rha纯度高的特点。
9.本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
10.一种重组流感病毒血凝素蛋白的分离纯化方法，主要包括以下步骤：
11.(1)将表达重组流感病毒血凝素蛋白(rha)的宿主中加入含有表面活性剂的缓冲溶液溶解膜蛋白，离心，获得含rha蛋白的上清液；
12.(2)向步骤(1)得到的含rha的蛋白上清液中添加可溶性无机盐及有机溶剂并搅拌
均匀，溶液分相，上相为富含rha蛋白的萃取相悬浊液；
13.(3)将萃取相悬浊液离心获得蛋白沉淀，并用含表面活性剂的缓冲液溶解，再次离心，获得含有rha蛋白的溶液；
14.(4)将步骤(3)得到的含有rha蛋白的溶液上样至依次串联的阴离子层析柱和阳离子层析柱，其中阴离子层析柱去除杂质，rha蛋白与阳离子层析柱的交换介质特异性结合，再通过提高盐浓度将rha蛋白从阳离子层析柱上洗脱下来，得到含有rha蛋白的溶液；
15.(5)将步骤(4)得到的含有rha蛋白的溶液超滤浓缩，上样至凝胶过滤层析柱中进一步纯化，得到纯化的rha蛋白。
16.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的表面活性剂为triton x-114、np-9中的一种或两种，浓度为0.5％～2.0wt％。
17.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的宿主中的表达系统为昆虫杆状病毒表达系统、细菌表达系统、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。
18.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的溶解膜蛋白的具体过程为搅拌1～20h。
19.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中离心的条件为于2000～10000rpm下离心5～30min。
20.基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述含rha的蛋白上清液的ph值范围为5.0～8.0，优选5.5～7.0；无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾中的一种或两种，浓度为5wt％～45wt％，优选15wt％～40wt％；有机溶剂为1.4-丁二醇、乙二醇、1，3-丙二醇、乙醇、叔丁醇和乙酸乙酯中的一种或两种，浓度为1wt％～20wt％，优选1wt％～10wt％；萃取时间2～8h，萃取温度4～30℃。
21.基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中离心的条件为于2000～10000rpm离心10～90min。
22.基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)所述的表面活性剂为triton x-114、np-9中的一种或两种，浓度为0.01～1wt％，缓冲液含有1～5mmol/l edta，1～10％丙三醇，ph 5.5～7.5。
23.基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中上样液含有5～25mmol/l磷酸钠、1～5mmol/l edta、1～10％丙三醇、0.01～1％表面活性剂，ph 5.5～6.0；洗脱液含有5～25mmol/l磷酸钠、30～500mmol/l nacl、1～5mmol/l edta、1～10％丙三醇、0.01～1％表面活性剂，ph 6.5～7.2。
24.基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中阴离子层析柱为unosphere-q离子柱，阳离子层析柱为sp-sepharose fast flow。
25.基于上述技术方案，进一步地，步骤(5)中超滤浓缩滤膜的截留分子量为30kda。
26.基于上述技术方案，进一步地，步骤(5)所述的凝胶过滤层析柱具体为geldex75pg或geldex 200pg，洗脱液为含0.001～0.01％ tween的pbs缓冲液。
27.本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
28.本发明提供一种简便的含跨膜区流感rha的纯化方法，流感rha溶液经过含有表面活性剂、有机溶剂和无机盐的盐析萃取体系萃取、离子交换层析及凝胶过滤层析等步骤纯化后，可以得到纯度高、杂质低的流感rha蛋白，流感rha的电泳纯度大于95％，色素比值较
低，纯化活性收率不低于70％，优于传统方法；同时上述盐析萃取的流感rha具有稳定性高，蛋白活性损失率小的优点；本发明解决了流感血凝素rha蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、收率低、纯度差、杂质含量高的问题，具有较为广泛的应用前景。
附图说明
29.图1为不同ph对rha活性的影响。
30.图2为不同种类表面活性剂对rha活性的影响。
31.图3为不同种类盐析萃取体系对rha分配的影响。
32.图4为1.3-丙二醇/硫酸铵体系的优化，其中，a：硫酸铵浓度对rha分配的影响；b：1.3-丙二醇浓度对rha分配的影响。
33.图5为乙二醇/硫酸铵体系的优化，其中，a：硫酸铵浓度的影响；b：乙二醇浓度对rha分配的影响。
34.图6为萃取时间对rha活性的影响，其中，a：25％硫酸铵/6％1.3-丙二醇体系；b：38％硫酸铵/5％乙二醇体系。
35.图7为萃取温度对rha活性的影响，其中，a：25％硫酸铵/6％1.3-丙二醇体系；b：38％硫酸铵/5％乙二醇。
36.图8为萃取后rha的稳定性分析(以上清为100％收率)。
37.图9为盐析萃取偶联柱层析纯化rha，其中，a：离子交换层析，b：凝胶过滤层析。
38.图10为传统柱层析纯化rha，其中，a：离子交换层析,b：hx
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层析；c：凝胶过滤层析。
39.图11为本发明的分离纯化方法与传统柱层析纯化的rha色素水平对比。
具体实施方式
40.下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
41.实施例中的rha重组蛋白由本课题组构建表达，采用类似wangk的方式，利用昆虫杆状病毒表达体系表达的来自a/california/07/2009毒株的重组蛋白(.vaccine.2006mar 15；24(12):2176-85.)。
42.1.本发明使用的材料：
43.1,3-丙二醇、乙二醇等有机溶剂购自上海阿拉丁及麦克林生物科技有限公司；硫酸铵、磷酸氢二钾等无机盐购自国药集团化学试剂有限公司；山羊抗人igg购自上海泽叶生物科技有限公司；bca蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。
44.2.本发明使用的分析方法：
45.1)rha浓度分析
46.bca工作液配制。根据样品数量，按50体积的bca reagent a加1体积的bca reagent b(50：1)配制适量的bca工作液，充分混匀。
47.a.标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表数据加入试剂：
48.表1bca法测定蛋白浓度的标准曲线
49.孔号01234567蛋白标准(μl)01248121620去离子水(μl)2019181612840bca工作液(μl)200200200200200200200200对应的蛋白含量(μg)01248121620
50.b.样品准备：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20μl样品，加入200μl bca工作液。
51.d.振荡混匀后，37℃放置20～30min。
52.e.用酶标仪测定a
562 nm
处的吸收值，以不含bsa的吸光值为空白对照。
53.f.以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
54.g.根据测定的吸光值，在标准曲线上即可计算出样品的蛋白含量。
55.h.计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20μl，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
56.以bsa standard(1mg/ml)为标准蛋白，绘制了bca法测定蛋白浓度的标准曲线，y＝0.0473x+0.0996，r2值为：0.9997。
57.2)rha活性分析
58.(1)包板：将盐析萃取后的上相用含0.01％ np-9、20mmol/l na3po4、1mmol/l edta、5％丙三醇、ph 5.89的缓冲液还原至盐析萃取前所添加蛋白上清的体积，因为蛋白溶液中所含的表面活性剂及高纯度无机盐和有机溶剂可能影响样品的光吸收，因此将萃取后各分相及蛋白上清用上述缓冲液稀释不同的梯度包板，50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1200倍、1600倍、2000倍；每孔加入100μl，3个平行组，一组空白对照，一组阴性对照，4℃过夜孵育，且以纯度较高的rha蛋白作为标准品作标准曲线；
59.(2)封闭：将步骤(1)中孔中的包被液排掉，然后每孔加入200μl 5％脱脂奶粉溶液，放于37℃恒温培养箱封闭1h；
60.(3)加一抗32d6：用5％脱脂奶粉溶液将1mg/ml的32d6抗体稀释2500倍使用，将步骤(2)中孔中的溶液排干，然后每孔加入100μl的抗体，阴性对照组加入无关抗体，37℃孵育1h；
61.(4)洗板：用pbst(136mm nacl、2.7mm kcl、10mm na2hpo4·
12h2o、1.8mm kh2po4溶解定容至1l，再加入500μl吐温20)溶液洗3次；
62.(5)加二抗(山羊抗人igg-hrp)：将步骤(4)的96孔板排干，用5％脱脂奶粉溶液将二抗稀释3000倍使用，每孔加100μl的二抗，37℃孵育1h；
63.(6)洗板：用pbst溶液洗涤5次；
64.(7)显色：每孔加入70μl tmb显色液，显色时间10min；
65.(8)终止：每孔加入70μl 2m h2so4终止液，5min内测a
450nm
的吸收值。
66.绘制elisa法测定蛋白活性浓度的标准曲线，线性方程为：y＝146.42x+0.075,r2值为：0.999。根据测定的吸光值，在标准曲线上即可计算出样品的蛋白活性，再根据以下公式计算出盐析萃取后rha活性收率。
67.盐析萃取的活性收率(％)＝(萃取相活性
×
稀释倍数
×
体积)/(蛋白上清原液活性
×
稀释倍数
×
体积)
×
100％
68.3)rha纯度分析：
69.采用10％的还原sds-page分析蛋白纯度，上样量8μl，考马斯亮蓝染色后，经imagej软件分析。
70.4)rha色素水平分析：
71.将采用两种不同纯化工艺纯化的rha蛋白，浓缩至相同浓度，在230～700nm波长下进行全波长扫描，由280，350，400，450，500nm的吸光率，计算a350/a280、a400/a280、a450/a280和a500/a280的比值，确定色素水平。
72.以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。
73.实施例1ph对rha活性的影响
74.将将发酵液高速离心获得细胞沉淀，再用含1％ np-9的表面活性剂的缓冲液(20mm na3po4、1mm edta，5％丙三醇，ph 5.89)溶解细胞沉淀，搅拌2～10h；再高速离心获得蛋白上清，用酸碱调至不同的ph值，考察范围为5.0～7.5；结果如图1所示，以ph 6.0时的蛋白活性为100％，考察不同ph值对蛋白活性的影响，根据结果显示，rha蛋白在该ph范围内均有活性，蛋白活性先增高后降低，当ph值为6.0时活性最高。
75.实施例2表面活性剂种类对rha萃取的影响
76.将发酵液高速离心获得细胞沉淀，再分别用含1.876％ triton x-114或1％np-9的表面活性剂的缓冲液(20mm na3po4、1mm edta，5％丙三醇，ph 5.89)溶解细胞沉淀，搅拌2～10h；再高速离心获得蛋白上清。然后向含不同表面活性剂的蛋白上清中加入20％硫酸铵/5％1.3-丙二醇，经盐析萃取后形成两相，用各自不添加盐与有机溶剂的蛋白上清为阳性对照，测定不同种类表面活性剂对萃取相中的rha蛋白活性的影响，结果如图2所示，根据结果显示，在每种表面活性剂下，rha蛋白的活性收率均大于74％，蛋白活性收率和纯化倍数相差不大。
77.实施例3不同盐析萃取体系对rha活性收率的影响
78.向蛋白上清(1％ np-9)中加入20％的无机盐，完全溶解后，调节ph至6.0，再加入5％有机溶剂，充分搅拌均匀后4℃静置2h分相，然后测定在不同盐析萃取体系下rha蛋白的活性收率及纯化倍数，结果图如3所示。
79.由图3结果可得，rha蛋白在不同盐析萃取下均有活性，活性收率均大于15％，纯化倍数1.0倍，而在硫酸铵/二元醇体系下，rha蛋白活性收率较高，其中无机盐包括：硫酸铵、磷酸氢二钾；有机溶剂包括：1.4-丁二醇、乙二醇、1.3-丙二醇、乙醇、叔丁醇、乙酸乙酯等。
80.实施例4 1.3-丙二醇/硫酸铵体系萃取rha
81.具体是实验过程参考实施例3，结果如图4a所示，在含1％ np-9的蛋白上清中添加20～30％硫酸铵范围内，加入25％时的硫酸铵时蛋白萃取效果最佳，再通过加入不同1.3-丙二醇的浓度1％～10％，计算分相后萃取相目的蛋白的活性收率及纯化倍数，结果如图4b所示，随着1.3-丙二醇浓度得提高，rha蛋白的活性收率及纯化倍数先增高后降低，当1.3-丙二醇浓度为6％时，rha蛋白活性收率最高，收率达100.4％，纯化倍数在2.9倍。
82.实施例5乙二醇/硫酸铵体系萃取rha
83.向含1％ np-9的蛋白上清中加入14％～50％的硫酸铵，搅拌至完全溶解后，调ph至6.0，再加入5％的乙二醇，搅拌均匀，静置2h分相，计算萃取相中rha蛋白的活性收率及纯化倍数。结果如图5a所示，在不同质量分数的硫酸铵/乙二醇体系下，rha蛋白活性收率均大
于60％，纯化倍数也高于1.5倍，且活性收率与纯化倍数具有相同的趋势，均是随着硫酸铵浓度的提高先增高后降低，当硫酸铵质量分数为38％时，rha蛋白的活性收率与纯化倍数最高。活性收率达到97％，纯化倍数2.4倍。
84.向含1％ np-9的蛋白上清中加入38％的硫酸铵，溶解后调ph至6.0，再分别加入不同浓度的乙二醇1％～20％，搅拌均匀，静置2h分相，计算萃取相中rha蛋白的活性收率及纯化倍数。结果如图5b所示，当乙二醇浓度为5％时，rha蛋白的活性收率及纯化倍数最高，活性收率达98％以上，而在其他浓度下，rha蛋白活性收率及纯化倍数相差不大，活性收率均为60％左右。
85.实施例6萃取时间对rha蛋白活性收率的影响
86.向含1％ np-9的蛋白上清中分别使用38％硫酸铵/5％乙二醇和25％硫酸铵/6％1.3-丙二醇两种盐析萃取体系萃取分相，分别静置时间为2h，4h，6h，8h，10h，20h，观察萃取时间对rha蛋白活性收率的影响；结果如图6所示，2～8h内，萃取时间对两种体系的rha活性收率及纯化倍数影响不大，10h后，蛋白的活性收率及纯化倍数略有下降。
87.实施例7萃取温度对rha蛋白回收率的影响
88.用实施例6中的两种盐析萃取体系，分别萃取含1％ np-9的蛋白上清，然后分别于4～30℃温度范围内静置2h分相，结果如图7所示，4～30℃下，温度对两种盐析萃取体系下rha收率的影响不大，本实验可在常温下操作。
89.实施例8萃取后rha的稳定性分析
90.取含1％ np-9的蛋白上清，38％硫酸铵/5％乙二醇和25％硫酸铵/6％1.3-丙二醇两种盐析萃取体系萃取后的上相，在常温下放置5h后，测定rha蛋白的活性收率，以上清收率为100％，结果如图8所示，与上清收率相比，此两种盐析萃取体系下萃取后的上相中rha蛋白的活性收率均为100％左右，而38％硫酸铵/5％乙二醇体系中，rha活性收率比上清中的高20％左右，说明rha蛋白在盐析萃取上相中较稳定。
91.实施例9盐析萃取技术偶联柱层析对rha蛋白的纯化
92.(1)盐析萃取固液分离处理
93.向含1％ np-9的蛋白上清中，加入25％硫酸铵，待盐溶解后，用ph计将蛋白溶液调至ph 6.0，再加入6％1.3-丙二醇，充分搅拌，冰浴静置2小时后，形成两相分相，其中萃取相含有流感rha悬浊液，与萃余相分离。
94.(2)样品预处理
95.将步骤(1)中萃取相冷冻高速离心(8000rpm,10min)得到蛋白沉淀，用含1mmol/l edta、5％丙三醇、0.03％ np-9表面活性剂、ph 5.89的缓冲液搅拌溶解，再高速离心(8000rpm，30min)，获得蛋白上清液。
96.(3)离子交换层析
97.将步骤(2)中得到的蛋白上清液，用0.22μm的滤膜抽滤以防止堵塞离子柱，使蛋白上清液流入离子交换层析柱，本实验采用unosphere-q/sp-sepharose fast flow离子柱串联，首先流入unosphere-q离子柱(bio-rad,hercules,ca,ф1.6cmx10cm，20ml)，流穿液然后流入sp-sepharose fast flow离子柱(ge/amersham/pharmacia,piscataway,nj,ф1.6cmx10cm,20ml)，离子柱事先用含20mmol/l磷酸钠、1mmol/l edta、5％丙三醇、0.01％ np-9，ph 5.89的缓冲液平衡柱子，unosphere-q离子交换层析能有效去除部分杂质的作用，
流感rha蛋白特异性与sp离子交换柱结合；再通过提高盐浓度将目的蛋白从sp离子交换层析洗脱下来，洗脱液采用20mmol/l磷酸钠、150mmol/l nacl、1mmol/ledta、5％丙三醇、0.03％ np-9，ph 7.02的缓冲液等度洗脱，层析过程中流速5ml/min。
98.(4)凝胶过滤层析
99.将步骤(3)中洗脱出的目的蛋白用30kda的超滤管浓缩至500μl，通过loop环进样，采用凝胶色谱柱(geldex 200pg,22-44μm,高交联度琼脂糖)，并用0.005％吐温/pbs溶液洗脱，层析过程中流速0.5ml/min，获得纯化的流感rha蛋白，记为纯化蛋白-1，结果如图9所示。
100.对比例1传统柱层析纯化蛋白
101.与盐析萃取偶联柱层析不同，传统柱层析在实施例1中大量表达蛋白后，直接用1％ np-9溶解膜蛋白后，用冷冻离心机高速离心获得蛋白上清后，直接上样unosphere-q/sp-sepharose fast flow离子交换层析柱，流程同实施例9步骤(3)步骤。
102.将离子交换层析步骤洗脱出的目的蛋白浓缩换液，用含40mm na3po4，0.05％吐温-20，5％甘油，ph 7.2的缓冲液换液，蛋白上样至hx
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(bio-rad,hercules,ca,ф1.0cmx4.6cm,3.6ml)柱，通过提高磷酸盐浓度洗脱液来洗脱rha蛋白，洗脱液为500mm na3po4，0.05％吐温-20，5％甘油，ph 7.20，目的蛋白在50％平衡液+50％洗脱液时洗脱出来。再用缓冲液(10mm磷酸钠，150mm nacl，0.01％吐温-20，ph 7.22)的30kda mwco超滤管进一步纯化和浓缩。
103.再用凝胶过滤层析纯化，步骤同实施例9步骤(4)，得到纯化的流感rha蛋白，记为纯化蛋白-2，结果如图10所示。
104.实施例10本发明方法和传统方法纯化后rha的对比分析
[0105]ⅰ.纯度对比：
[0106]
经imagej软件分析实施例9获得的纯化蛋白-1，其纯度为97％，而对比例1中获得的纯化蛋白-2，其纯度为75％。
[0107]ⅱ.色素水平对比
[0108]
结果如图11所示，实施例9获得的纯化蛋白-1的a350/a280、a400/a280、a450/a280和a500/a280分别为0.081、0.021、0.017和0.016；对比例1中获得的纯化蛋白-2的a350/a280、a400/a280、a450/a280和a500/a280分别为0.089、0.027、0.022和0.020；本发明的分离纯化方法得到的纯化蛋白-1的rha的色素水平更低。
[0109]ⅲ.活性收率对比
[0110]
经elisa测定实施例9获得的纯化蛋白-1的活性收率为72％，而对比例1中获得的纯化蛋白-2的活性收率为15％。

技术特征：
1.一种重组流感病毒血凝素蛋白的分离纯化方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)将表达重组流感病毒血凝素蛋白(rha)的宿主中加入含有表面活性剂的缓冲溶液溶解膜蛋白，离心，获得含rha蛋白的上清液；(2)向步骤(1)得到的含rha的蛋白上清液中添加可溶性无机盐及有机溶剂并搅拌均匀，溶液分相，上相为富含rha蛋白的萃取相悬浊液；(3)将萃取相悬浊液离心获得蛋白沉淀，并用含表面活性剂的缓冲液溶解，再次离心，获得含有rha蛋白的溶液；(4)将步骤(3)得到的含有rha蛋白的溶液上样至依次串联的阴离子层析柱和阳离子层析柱，其中阴离子层析柱去除杂质，rha蛋白与阳离子层析柱的交换介质特异性结合，再通过提高盐浓度将rha蛋白从阳离子层析柱上洗脱下来，得到含有rha蛋白的溶液；(5)将步骤(4)得到的含有rha蛋白的溶液超滤浓缩，上样至凝胶过滤层析柱中进一步纯化，得到纯化的rha蛋白。2.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的表面活性剂为triton x-114、np-9中的一种或两种，浓度为0.5％～2.0wt％。3.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的宿主中的表达系统为昆虫杆状病毒表达系统、细菌表达系统、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。4.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述含rha的蛋白上清液的ph值范围为5.0～8.0，优选5.5～7.0；无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾中的一种或两种，浓度为5wt％～45wt％，优选15wt％～40wt％；有机溶剂为1.4-丁二醇、乙二醇、1，3-丙二醇、乙醇、叔丁醇和乙酸乙酯中的一种或两种，浓度为1wt％～20wt％，优选1wt％～10wt％；萃取时间2～8h，萃取温度4～30℃。5.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中离心的条件为于2000～10000rpm离心10～90min。6.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的表面活性剂为triton x-114、np-9中的一种或两种，浓度为0.01～1wt％，缓冲液含有1～5mmol/l edta，1～10％丙三醇，ph 5.5～7.5。7.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中上样液含有5～25mmol/l磷酸钠、1～5mmol/l edta、1～10％丙三醇、0.01～1％表面活性剂，ph 5.5～6.0；洗脱液含有5～25mmol/l磷酸钠、30～500mmol/l nacl、1～5mmol/ledta、1～10％丙三醇、0.01～1％表面活性剂，ph 6.5～7.2。8.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中阴离子层析柱为unosphere-q离子柱，阳离子层析柱为sp-sepharose fast flow。9.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(5)中超滤浓缩滤膜的截留分子量为30kda。10.权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(5)所述的凝胶过滤层析柱具体为geldex 75pg或geldex 200pg，洗脱液为含0.001～0.01％tween的pbs缓冲液。

技术总结
本发明公开一种重组流感病毒血凝素蛋白的分离纯化方法，属于生物工程技术梁宇，本发明将昆虫杆状病毒表达载体系统表达的rHA溶液经过含有表面活性剂、有机溶剂和无机盐的盐析萃取体系、再经过离子交换层析与凝胶过滤层析等步骤纯化后，可以得到电泳纯度大于95％，活性回收率70％以上的纯rHA，纯化后的rHA具有色素比值较低，稳定性高的优点；与传统柱层析纯化相比，本发明解决了传统柱层析分离纯化中分离步骤繁琐，收率低、纯度低的问题，在实际生产中具有较好的应用前景。中具有较好的应用前景。中具有较好的应用前景。


技术研发人员：董悦生 张瑞 修志龙
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/7/21