一种巴氏芽孢八叠球菌及其培养方法和应用

1.本发明涉及地质工程技术领域，具体涉及一种巴氏芽孢八叠球菌及其培养方法和应用。


背景技术：

2.碳酸盐岩矿物是浅海沉积物和大陆表生环境中最常见的矿物系列之一，碳酸盐岩在沉积和成岩过程中的次生变化对储层影响较大。例如：灰岩在白云岩化的过程中整体体积会变小，对储集区域做出了潜在的贡献(weber et al.2021)；沉积过程和次生变化为碳酸盐岩油气藏提供了较大的各类孔隙(ibrahem et al.2022)。但碳酸盐岩储集层发育极不均匀、部分油藏含硫量高等不利因素限制了碳酸盐岩油气藏的进一步勘探开发(g
ü
rgey et al.2002)。所以碳酸盐岩油气藏也一直是石油地质学家的研究热点。
3.石油地质学家一直坚信碳酸盐岩可以作为烃源岩的猜想是因为其作为储层和烃源岩的案例被发现(klemme&ulmishek 1991；liu et al.2006；zhu et al.2020)。人们也对碳酸盐岩生油过程也开展了研究。然而，现代碳酸盐岩储层的矿物中有机碳含量往往很低。目前主要存在以下几种原因：(1)成岩作用及后期的溶蚀作用使得碳酸盐岩中有机质损失，这个过程可能会导致碎屑岩中损失15-50％有机碳和碳酸盐岩中损失80-90％的有机碳(morad etal.1998)。(2)沉积过程有机质并不和碳酸盐岩一起沉积(hunt 1967)。(3)其中有机质达到成烃门限排出，排烃完成后，i型、ii型和iii型干酪根toc下降幅度分别为80％、50％和20％(daly and edman.1987)，有机碳含量高的碳酸盐岩经排烃过程后不利于有机质保存(xia.et al.2019)；(4)有机质在碳酸盐岩沉积的过程中发生转化(如流水作用、氧化作用和重结晶等)，但这个过程似乎对有机碳影响较小(tissot&welte.1978)。油藏地球化学家们往往不能以常规石油地质学思维理解碳酸盐岩储层，那些可以作为烃源岩评价的指标(镜质体反射率、有机质变质程度等)似乎对碳酸盐岩失去了作用(huo et al.2019)。这也造成我们对碳酸盐岩生油的认识仍然不是非常深入，限制了我国古老层系海相碳酸盐岩的勘探开发。
4.微生物诱导形成碳酸盐岩的历史可以追溯到元古界,如蓟县系的大规模微生物岩，叠层石、凝块石等。古老层系中有机质来源单一，特别是埃迪卡拉生命大爆发以前，从生物标志化合物中广泛被报道的霍烷也能证明这点，所以微生物诱导碳酸盐岩沉淀也成为目前新的研究热点。此外，微生物岩也成为我国海相碳酸盐岩的潜在成烃源岩，成为目前油气勘探的热点，微生物诱导的碳酸盐岩沉淀也被认为是解决古老层系中烃类来源问题的关键环节。
5.微生物岩的成岩模式几乎均为生物诱导矿化，生物诱导矿化是由环境中微生物活动引起化学改变导致菌体周围微环境产生过度饱和环境生成矿物质沉淀。目前已经报道的微生物矿化过程来看，产脲酶菌的诱导碳酸盐岩能力最强。同时由于其独特的胶结作用，目前产脲酶菌在地质工程、岩土工程领域也出现相应研究，如土体改良、裂缝密封、密封co2等。
6.目前，已经成功分离了很多种产脲酶菌并进行了应用研究，包括蜡质芽孢杆菌(bacillus cereus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sphaericus)和巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcina pasteurii)等。其中巴氏芽孢八叠球菌相同时间内脲酶产率最高，可达550u/ml(anbu et al.,2016)，
7.然而，目前的巴氏芽孢八叠球菌仍引进自国外，以购买自美国模式培养物集存库(american type culture collection)的菌株(atcc 11859)为主，例如肖瑶等(2021)、郝闪等(2021)和石英等(2022)。巴氏芽孢八叠球菌的研究相对较慢：2014年(tiwari et al)，巴氏芽孢八叠球菌的基因组序列才被初步报道，2018～2019年，其基因组序列又得到一定程度的完善和补充，同时国内也鲜见巴氏芽孢八叠球菌的筛选与研究工作。
8.因此，筛选并培养一种产脲酶的国内本土巴氏芽孢八叠球菌，避免外来物种入侵的风险，使其应用于地质工程、岩土工程领域，是本发明亟需解决的问题。


技术实现要素：

9.本发明提供的一种巴氏芽孢八叠球菌及其应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
10.为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
11.第一方面，本发明提供了一种巴氏芽孢八叠球菌，所述巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcina sp.)cugb-0004-1，已于2023年03月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，菌种保藏号为cgmcc no.26799
12.第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的巴氏芽孢八叠球菌的培养方法，将溶解巴氏芽孢八叠球菌菌株的菌液转移至固体平板培养基上并均匀涂布，然后置于30℃恒温培养箱中培养24～48h，待长出成单个菌落后再转移至液体培养基传代培养；所述固体培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，琼脂20g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min；所述液体培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min。
13.第三方面，本发明提供了一种含有第一方面所述的巴氏芽孢八叠球菌的微生物菌剂。
14.第四方面，本发明提供了一种生物制剂，包括第一方面所述的巴氏芽孢八叠球菌及辅料；或第三方面所述的微生物菌剂及辅料。
15.进一步的，所述辅料包括尿素、麸皮和氯化钙。
16.在本发明的较佳实施方式中，所述辅料中，所述麸皮过60-80目筛，所述尿素、麸皮和氯化钙的重量比为尿素：细麸皮：氯化钙＝1:0.2-0.5:2。
17.在本发明的另一较佳实施方式中，所述巴氏芽孢八叠球菌和所述辅料的重量比为0.2-1：12。
18.第五方面，本发明提供了如第一方面所述的巴氏芽孢八叠球菌、第三方面所述的微生物菌剂或者第四方面所述的生物制剂在油气勘探、岩土工程、地质工程和环境工程中的应用。
19.进一步的，通过所述巴氏芽孢八叠球菌促进含有有机质方解石的沉积。
20.在本发明的较佳实施方式中，将所述巴氏芽孢八叠球菌施用于培养液或土壤或混凝土中，所述巴氏芽孢八叠球菌用量不低于1
×
108cfu/株/次，施用频率为每周1-3次。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22.(1)本发明的巴氏芽孢八叠球菌cugb-0004-1具有很好的产脲酶的能力，同时，该菌株在含有机质方解石沉积具有较好的效果，在研究地质历史时期海相碳酸盐岩的有机质沉积和转化问题具有关键作用。
23.(2)本发明的巴氏芽孢八叠球菌cugb-0004-1在开展地质工程应用时，与天然矿物界面粘结性能较好，同时菌剂粘度相较化学胶结剂极低，具有很好的通过能力，适宜大规模应用；
24.(3)本发明使用的细麸皮为我国主要农作物的副产物，生产量大，价格便宜，是廉价营养物的适宜代替营养物质，具有制备方法简单的特点。
25.(3))本发明的巴氏芽孢八叠球菌作为兼性厌氧菌种，在生产和应用时，还能够开展环境修复，达到可持续发展的目的，与ca
2+
沉淀类似，可以将各类废水中的阳离子吸附并以碳酸盐矿物的形式沉淀，对环境修复和重金属污水的治理具有积极意义。
26.(4)本发明的巴氏芽孢八叠球菌为中国本土筛选，大规模应用时无需考虑国外购买细菌造成的外来物种入侵。
附图说明
27.图1为本发明的巴氏芽孢八叠球菌的系统发育树；
28.图2为本发明的巴氏芽孢八叠球菌的凝胶电泳图；
29.图3为本发明中细麸皮的外观图；
30.图4为本发明中巴氏芽孢八叠球菌培养时单菌落照片；
31.图5为本发明中巴氏芽孢八叠球菌以酵母提取物作为营养物的生长曲线图；
32.图6为本发明中巴氏芽孢八叠球菌以细麸皮作为营养物的生长曲线图；
33.图7为本发明中巴氏芽孢八叠球菌菌剂与对照组的方解石产率对比图；
34.图8为本发明中巴氏芽孢八叠球菌诱导方解石形貌图。
具体实施方式
35.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
36.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
37.实施例1
38.本发明提供了一种巴氏芽孢八叠球菌，所述巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcina sp.)cugb-0004-1，已于2023年03月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，菌种保藏号为cgmcc no.26799
39.本发明的巴氏芽孢八叠球菌(代号：cugb-0004-1)具有极强的产脲酶作用。具有独特的环保胶结作用，具有较高的沉淀效率和适用性，能够产生脲酶来加速尿素的分解。分解产物可以与微生物环境中的ca
2+
结合，从而形成具有胶结性质的caco3沉淀。
40.co(nh2)2+3h2o
‑→
2nh
4+
+hco
3-+oh
‑ (1)
41.hco
3-+h2o+oh-→
co
32-+2h2o (2)
42.ca
2+
+co3
2-→
caco3(s) (3)
43.实施例2
44.1、巴氏芽孢八叠球菌的筛选：
45.用无菌采样袋在距地面深处15厘米处取样，用无菌取样袋采集200g潮湿的方解石沉积区的土壤样品，迅速转移至实验室开展筛选。利用产脲酶菌代谢过程中环境ph的增大引起酚红溶液变红进行选择性筛选。制备筛选培养基：酵母提取物3g/l，nacl 5g/l。尿素20g/l(灭菌后加)，0.2％酚红溶液4ml/l，琼脂20g/l。高压灭菌后消毒后进行菌种筛选。
46.筛选步骤：
47.培养基在115℃下高压灭菌30分钟。在无菌台上冷却至环境温度，随后倒入培养皿中。采用稀释涂布法，将收集的土壤按三个浓度梯度(即10-6
、10-7
和10-8
)稀释到准备好的培养基平板上，然后在30℃的恒温培养箱中培养。当菌落在平板上生长时，挑出周围有培养基变红的单个菌落。上述步骤重复数次，直到分离出不含杂菌的单一菌株，如图4所示。
48.2、巴氏芽孢八叠球菌的dna提取：
49.1)取2ml离心管，加入200μl预处理液和少许玻璃珠，然后加入适量菌样品，放入研磨仪中研磨至充分。
50.2)加入20μl proteinase k，加入200μl裂解液，充分颠倒混匀，70℃放置10min。
51.3)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，短离心以去除管盖内壁液滴。
52.4)过吸附柱，洗涤液洗1次，漂洗液洗2次。
53.5)吸附柱室温放置3～5分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
54.6)将吸附转入一个新离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加50～100μl ddh2o，室温放置3～5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
55.3、pcr产物检测及纯化：
56.3μl pcr产物进行1.0％的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状，如图2所示。
57.pcr产物纯化按照磁珠纯化标准操作流程操作，利用磁珠能够吸附或者释放带电荷物质的原理，在高盐低ph溶液吸附dna，在低盐高ph溶液释放dna，从而达到分离提纯dna产物的目的。
58.测序及鉴定在六合华大公司完成，测序结果进行ncbi-blast比对后鉴定其为巴氏芽孢八叠球菌，进化树如图1所示。
59.4、巴氏芽孢八叠球菌的短期保存方法：
60.经过纯化后的巴氏芽孢八叠球菌采用平板划线法接种至培养基中，在35℃恒温培
养箱中培养48h，待菌落长出后密封可在4℃条件下短期保存。
61.5、巴氏芽孢八叠球菌的复壮培养方法：
62.从冻干管中复壮，向冻干管加入一定量去离子水，待菌株溶解后将菌液全部转移至固体平板并均匀涂布，置于30℃恒温培养箱中培养24～48h，待长出成单个菌落后即认为活化成功，再转移至液体培养基传代3次后恢复活力，即可进行后续试验。其中，固体培养基：酵母提取物10g，nacl 5g，琼脂20g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min；液体培养基中无琼脂，为酵母提取物6g，nacl 5g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min。
63.实施例3：对经过培养后的巴氏芽孢八叠球菌数量进行测定。
64.通过测试菌液吸光度(比浊法)来表示，吸光度是根据菌悬液的透光量间接地测定微生物的数量，微生物悬浊液浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度(吸光度)成正比。采用以下公式可以计算菌液浓度：
65.y＝8.59
×
107z
1.3627 (4)
66.式中：
67.z—od
600
值；
68.y—细胞浓度(cells m/l)。
69.当od
600
值介于0.2-2.8之间时该公式可适应。
70.本实验采用分光光度计来检测波长600nm时菌液的吸光度，所测值用od
600
表示。液体培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min，生长曲线如图5所示，24h内达到稳定期，od
600
为1.0-1.1之间。
71.实施例4：巴氏芽孢八叠球菌菌剂的生长特征。
72.采用ph计监测该株巴氏芽孢八叠球菌在细麸皮和尿素中的代谢情况。其中，细麸皮为小麦加工副产物，过60-80目筛，如图3所示。采用紫外分光光度对巴氏芽孢八叠球菌的生长和代谢进行监测，如图6所示。实验组所用基础培养基：细麸皮3g/l、尿素20g/l，nacl 5g，去离子水1000ml，尿素待冷却至室温后添加；对照组所用基础培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，去离子水1000ml。实验组和对照组中，巴氏芽孢八叠球菌接种量5％，摇床转速100r/min，115℃高压灭菌30min，其中，对照组实验结果如图5所示，实验组实验结果如图6所示。
73.由图6可知，本发明的巴氏芽孢八叠球菌菌剂在细麸皮和尿素中代谢达到稳定期时间约为28h，而对照组实验结果24h内达到稳定期，巴氏芽孢八叠球菌菌剂在细麸皮中大量产生脲酶时间晚于对照组，有利于实际应用和保存。
74.实施例5：巴氏芽孢八叠球菌对含有有机质方解石的沉积效果。
75.将巴氏芽孢八叠球菌施用于培养液或土壤或混凝土中，控制巴氏芽孢八叠球菌用量不低于1
×
108cfu/株/次，施用频率为每周2次。以土壤为例，土壤在实验前经过灭菌和酸洗脱杂，以每周两次的频率施用菌剂，每200g土壤次施用菌剂50ml，2周共施用菌剂400ml，开展三次实验取平均值；另做对照实验，对照组与实验组相比较，不含巴氏芽孢八叠球菌，其他成分及含量均相同，施用方式也相同。实验结束后取对照组和实验组土壤样品各5g，酸洗记录质量改变，m1-m2即为方解石质量，(m1-m2)/m1即为方解石产率。
76.实验结果:本发明的巴氏芽孢八叠球菌菌剂方解石产率为9.4％，较对照组提升1％，与对照组相比成本更低，产率更高，如图7所示。开展观察巴氏芽孢八叠球菌对含有有
机质方解石的沉积效果，结果如图8所示。
77.从图8中可知，较多的含有有机质方解石的沉积在一起，表明巴氏芽孢八叠球菌对含有有机质方解石的沉积效果较好。
78.以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种巴氏芽孢八叠球菌，其特征在于：所述巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcina sp.)cugb-0004-1，已于2023年3月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，菌种保藏号为cgmcc no.26799。2.一种如权利要求1所述的巴氏芽孢八叠球菌的培养方法，其特征在于：将溶解巴氏芽孢八叠球菌菌株的菌液转移至固体平板培养基上并均匀涂布，然后置于30℃恒温培养箱中培养24～48h，待长出成单个菌落后再转移至液体培养基传代培养；所述固体培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，琼脂20g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min；所述液体培养基：酵母提取物6g，nacl 5g，去离子水1000ml，115℃高压灭菌30min。3.含有权利要求1所述的巴氏芽孢八叠球菌的微生物菌剂。4.一种生物制剂，其特征在于：包括权利要求1所述的巴氏芽孢八叠球菌及辅料；或权利要求3所述的微生物菌剂及辅料。5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：所述辅料包括尿素、麸皮和氯化钙。6.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于：所述辅料中，所述麸皮过60-80目筛，所述尿素、麸皮和氯化钙的重量比为尿素：细麸皮：氯化钙＝1:0.2-0.5:2。7.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：所述巴氏芽孢八叠球菌和所述辅料的重量比为0.2-1：12。8.如权利要求1所述的巴氏芽孢八叠球菌、权利要求3所述的微生物菌剂或者权利要求4-7任一项所述的生物制剂在油气勘探、岩土工程、地质工程和环境工程中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：通过所述巴氏芽孢八叠球菌促进含有有机质方解石的沉积。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述巴氏芽孢八叠球菌施用于培养液或土壤或混凝土中，所述巴氏芽孢八叠球菌用量不低于1
×
108cfu/株/次，施用频率为每周1-3次。

技术总结
本发明公开了一种巴氏芽孢八叠球菌及其培养方法和应用，涉及地质工程领域。所述巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcinasp.)CUGB-0004-1，已于2023年03月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，菌种保藏号为CGMCC NO.26799。本发明的巴氏芽孢八叠球菌CUGB-0004-1具有很好的产脲酶的能力，该菌株在含有机质方解石沉积具有较好的效果，在研究地质历史时期海相碳酸盐岩的有机质沉积和转化问题具有关键作用，在开展地质工程应用时，与天然矿物界面粘结性能较好，同时菌剂粘度相较化学胶结剂极低，具有很好的通过能力，适宜大规模应用，且对环境修复和重金属污水的治理具有积极意义，本发明的巴氏芽孢八叠球菌为中国本土筛选，大规模应用时无需考虑国外购买细菌造成的外来物种入侵。的外来物种入侵。的外来物种入侵。


技术研发人员：钟鸣 黄海平
受保护的技术使用者：中国地质大学（北京）
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/21