一种初级和前体miRNA的检测方法

一种初级和前体mirna的检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种初级和前体mirna的检测方法。


背景技术：

2.mirna是大小约18～24nt大小的非编码rna，占总rna样本质量的0.01％。在许多生物过程中起着关键的调节作用，包括早期细胞的发育、再生、增殖、凋亡和造血等。其选择性表达引起的细胞生物过程调控失常或紊乱与许多疾病相关。大量研究表明mirna的异常表达参与了人类遗传疾病、免疫系统疾病、肿瘤发生和神经退行性疾病等多种疾病的发生和发展，并且部分mirna已成为针对特定疾病诊疗的特异性靶标。
3.成熟的mirnas由较长的初级转录产物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生。初级mirna(pri-mirnas)由基因组经过rna聚合酶ii转录生成,通常有几百到上千个碱基，带有5’帽子和3’polya尾巴，以及1到数个发夹茎环结构。pri-mirna再由微小rna处理复合体(microprocessor complex)加工生成约70nt核苷酸大小的前体mirna(pre-mirna)，并被运输到细胞核外。pre-mirna为单一发夹结构，5’端带有磷酸基团，3’端有两个突出碱基带有羟基。在细胞质中pre-mirna被dicer酶切割成长度约为22nt碱基的单链成熟mirna，并被招募至rna诱导的沉默复合体(risc)中。mirna的5’端与靶基因的3’非翻译区(3
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utrs)特异性结合，抑制靶基因的翻译。
4.鉴于mirna在各生物机制中的重要性，近年来发展出多种mirna表达分析方法。例如：norther blotting、逆转录结合定量聚合酶链式反应技术(quantitative reverse transcription pcr,rt-qpcr)、微阵列分析(micro array)、深度测序(deep sequencing)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,fish)等。其中rt-qpcr技术因其反应敏感，操作简便、省时、高通量且易于掌握等优点是目前检测mirna最方便实用的一种方法。尽管rt-qpcr分析技术已成功有效地运用于检测rna多年，并逐渐成为当前mrna定量分析的常规方法，由于mirna独有的特点，传统的rt-qpcr技术难以对其进行精准定量分析。
5.首先，mirna的长度与pcr反应中的引物长度相当(18～24核苷酸)，依照传统方法需要设计非常短的引物，这对后续反应是一个难以实现的挑战。其次，mirna在细胞中整体维持一个低丰度水平，而且家族成员间序列具有高度相似性，对检测手段的灵敏度和特异性提出了高要求。另外，细胞中mirna表达水平从几个拷贝到超过5x 105个拷贝，相差四个数量级。因此，mirna检测需要广泛的动态检测范围。同时，mirna调控基因表达具有“多对一”和“一对多”的特点，即单个基因可同时受多个mirna的调控，一个mirna可以调控多个靶基因的表达。这就需要通过同时检测多个mirna的方法来了解这些微小调控因子的重要性和复杂性，因此mirna基因表达的中高通量分析策略是另外一个技术上的要求。
6.目前rt-qpcr技术定量检测mirna主要集中在成熟体阶段的分析，方法主要分为以下几类：茎环(stem-loop)法、多聚a(poly-a)法、引物延伸(primer-extension)法、双尾(two-tailed)法等方法。上述方法已经在mirna成熟体阶段的分析中得到应用，但目前在检测初级和前体mirna的定量分析中还未见有简便易行的标准定量分析方法。除技术上的问
题以外，目前对于绝大部分初级和前体mirna的注释还不是十分清楚同样是制约对其深入研究的主要原因。目前针对mirna定量pcr技术主要是taqman法，需要合成特异性的引物探针，商业化的引物开发有限远不能满足当前研究的需要。另外，该方法还存在价格昂贵，引物设计相对复杂，不利于掌握等问题。现有的方法都关注于分析成熟体mirna，在某些情况下，如具有紧密相似性的mirna很难确定调控异常的候选mirna的基因组位置，为设计标准分子提出了挑战。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明提供了一种初级(pri-)和前体(pre-)mirna的检测方法，根据对初级和前体mirna上下游边界注释，根据其转录特点设计定量扩增引物，设计方法简便易行，对于具有临床诊断意义的mirna的标志物具有良好的潜在应用价值。
8.本发明的第一个目的是提供一种初级和前体mirna的检测方法，包括以下步骤：
9.s1、根据转录起始位点、cpg岛、表达序列标签、polya、基因表达的cap分析、cis-pet/ditags中的一种或几种对目标mirna进行定位；
10.s2、针对目标mirna设计引物，其中，正向引物设置范围为序列5’端至gu基序，反向引物设置范围为cnnc基序至3’端，正向引物和反向引物的tm值为55～61℃，且正向引物与反向引物的最大tm差为2℃；
11.s3、对样本进行逆转录和pcr，建立荧光强度和目标mirna的坐标系，实现对目标mirna的检测。
12.进一步地，在步骤s1中，对于已知的mirna，将名称输入ucsc或ncbi-gene等数据库搜索引擎，设定种属等限定条件即可查找对应序列及其在基因组中的位置；如果是未经注释或者验证的mirna，则可以通过ncbi-blastn找到其序列，同样根据种属输入ucsc或ncbi-gene等数据库确定其所在染色体和基因组中的位置。
13.进一步地，在步骤s2中，当目标mirna为初级mirna时，引物可以采用软件和线上多种方法设计，现以在线引物设计为例进行简要说明。将确定上下游的初级mirna序列从数据库中以fasta格式导出，通过导入primer-blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线设计。在specificity check区选择设计或验证引物的目标数据库(如人的refseq mrna或genome base)和物种。因序前体和成熟体序列包含在初级mirna内，需在“from-to”中设置正反向引物序列的范围。正向引物设置范围从序列5’端至gu基序，反向引物设置范围从cnnc基序位置至3’端，扩增片段全长选择80-200bp(一般《300bp)。也可通过高级参数设置对引物进一步优化，如对引物特异性检测，可在设计前选择specificity check确保引物的特异性。
14.进一步地，在步骤s2中，前体mirna引物设计与上述初级mirna设计方法类似，将fasta格式的前体mirna全长序列(即从gu基序至cnnc基序)导入primer-blast在线设计。因前体mirna序列全长一般较短(《200bp)，因此可以默认前体mirna序列即为设置扩增产物的全长。
15.进一步地，在步骤s2中，当目标mirna为成熟mirna时，所述引物为茎环引物或polyt引物。
16.进一步地，在步骤s3中，当目标mirna为初级mirna或前体mirna时，以寡聚胸腺嘧
啶引物为逆转录引物。
17.进一步地，在步骤s3中，当目标mirna为成熟mirna时，所述引物为茎环引物或polyt引物等，具体根据逆转录方法确定。
18.进一步地，在步骤s3中，所述pcr为qpcr。
19.进一步地，在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，对样本进行热激。
20.进一步地，所述的热激为将样本置于27～29℃下热处理。
21.进一步地，在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，抑制样本中的mirna加工酶的表达。
22.进一步地，所述的mirna加工酶选自pol ii、dicer、drosha、dgcr8(果蝇中为pasha)、exportin5、ago1和ago2中的一种或几种。
23.进一步地，所述的抑制方式包括敲除、敲降、加入抑制剂等。
24.进一步地，在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，对带有目标mirna的细胞进行培养，随后在480～520um(优选为500um，且目标mirna为前体mirna)亚砷酸盐(如naaso2)中应激处理，收集细胞提取总rna，逆转录后对mirna初级、前体和成熟体进行rt-qpcr相对定量分析。
25.进一步地，在本发明的一个实施例中，果蝇drosha敲降采用果蝇uas/gal4系统，将带有uas-drosha rnai的果蝇同特异性组织表达的gal4果蝇，如全身表达的daughterless-gal4(da-gal4)交配，收集子代da-gal4》uas-drosha rnai果蝇即为drosha敲降的果蝇(drosha rnai)。
26.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
27.(1)对初级和前体mirna的注释，能够对已知或者新发现的mirna的初级和前体转录本特点，包括其上下游转录起始和终止位点，编码区序列的相对位置关系等信息的详细注释，便于对感兴趣的基因进行深入研究。
28.(2)根据对初级和前体mirna上下游边界注释，根据其转录特点设计定量扩增引物，设计方法简便易行。对于具有临床诊断意义的mirna的标志物具有良好的潜在应用价值。
29.(3)基于sybr green的荧光qpcr方法灵敏性高，以let-7为例我们前期预实验显示模板量在0.5ng以下仍能实现正常扩增。
30.(4)高通量运行。对于涉及多个样本或者多种类型的mirna来讲，可以同时进行，如abi-7500的96孔板或者384孔模块中进行。
31.(5)本方法还具有经济、实验材料容易获得，可靠性高、耗时短，整个过程易学习掌握等优点。可联合其它多种方法，如深度rna测序，rna芯片等评估综合mirna功能。
32.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
33.为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明做进一步详细的说明。
34.图1为pri-mirna在基因组序列的结构特点；
35.图2为ucsc数据库中hsa-mir-let-7e周围侧翼区的转录特征界面；
36.图3为ncbi genomics中hsa-mir-let-7e周围侧翼区的转录特征界面；
37.图4为ucsc预测pre-let-7e物种间高度保守；
38.图5为pre-let-7e与各转录功能类型在基因组中的相对位置；
39.图6为rnaalifold预测的pri-let-7e的二级结构；
40.图7为初级、前体及成熟体mirna(茎环法)引物设计；
41.图8为ncbi-genomics对dme-pri-let7注释的界面；
42.图9为初级和前体dme-let7基因组中的相对位置和引物设计；
43.图10为mirna design v1.01软件设计的成熟体dme-let-7的茎环和正/逆向引物；
44.图11为sybr green-qpcr检测不同浓度(250um和500um)naaso2处理人hek293细胞条件下初级hsa-pri-let7e表达情况；
45.图12为sybr green-qpcr检测不同浓度(250um和500um)naaso2处理人hek293细胞条件下前体hsa-pre-let7e表达情况；
46.图13为sybr green-qpcr检测不同浓度(250um和500um)naaso2处理人hek293细胞条件下成熟体hsa-let7e表达情况；
47.图14为sybr green-qpcr检测热激(29℃)条件下初级和前体dme-let7的表达水平；
48.图15为sybr green-qpcr检测drosha rnai条件下初级dme-pri-let7和前体dme-pre-let7扩增反应以及成熟体dme-let7表达水平。
具体实施方式
49.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
50.lethal-7(let-7)基因是最初在线虫(c.elegans)中被发现的mirna，并很快发现其成熟体在人、果蝇和其它物种基因组中同样表达，并且高度保守。通常let-7家族在基因组中存在多个拷贝，如物种人中存在10个成熟体let-7家族成员，由13个前体序列剪切产生，而在果蝇中只有一个let-7基因(dme-let7)。以下以人源hsa-let-7e和果蝇dme-let7为例对其初级和前体的注释和qpcr相对定量分析进行详细说明。
51.实施例1对人源mir-let-7e进行检测
52.mirna基因位点通常为多顺反子序列，其中许多mirna序列聚集在同一初级转录本内。尽管成熟mirna的基因坐标和序列容易获得，但对于pri-mirna的结构及转录往往需要通过实验确定，到目前为止许多pri-mirna和pre-mirna转录本的主要结构还没有很好地注释(annotation)，是制约转录特征分析和定量检测丰度的一个主要原因。
53.一、mirna转录本特点分析
54.对mirnas的转录特点分析是定位初级及前体mirna的前提。哺乳动物中大约50％的mirna位于蛋白质编码基因的内含子(introns)中，其pri-mirna被认为是宿主转录本(host transcript)，发生过程不需要drosha和dgcr8酶的剪切，定义为“基因内(intronic)mirna”或“mirtron”；而另一半mirna一般位于ensemble转录本以外，定义为“基因间(intergenic)mirna”。多种保守的转录功能类型(transcription feature types)位于成熟体这些mirna的上下游，参与其转录调控，剪切等过程，是转录过程中特异性识别的起始
和终止的标记(图1)。这些转录功能类型包括转录起始位点(transcription start sites,tsss)、cpg岛(cpg island)、表达序列标签(expressed sequence tags,ests)、polya、基因表达的cap分析(cap analysis of gene expression,5’cage)和cis-pet/ditags，可作为定位pri-mirna及特定注释的标记。
55.tsss一般位于pre-mirnas起始的上游区域6kb以内。cage标签是长约20或21nt的序列，来源于5’端帽位点附近的mrna序列，其映射到独特的基因组序列可以识别tsss。cpg岛是预测启动子的辅助工具，cpg岛一般《300bp，在pre-mirna上游和下游都存在，其中上游一般距离pre-mirna 4kb以内常与tsss共定位。
56.表达序列标签(expressed sequence tags,etss)是一段通常与基因间mirna重叠的序列，其5’端常与tsss和cpg岛相邻的用于标记mirna的上游，其下游3’端通常与polya尾重叠，用于标记mirna的3’末端。etss与cdnas的队列比较可以很好的展现pri-mirna的内含子-外显子连接结构。
57.tfbs结合位点可以用来定位mirna基因的核心启动子。mirnas的侧翼区比随机序列含有更多的结合位点，其分布是非随机的。mirna周围的tfbs结合位点的分布与预测的tsss和cpg岛的分布多共定位。pri-mirna的3’末端同样具有polya尾结构。
58.对于5’端ditags或者上游区域5’端cage的映射可以预测上游区域，同样的对于ditags的3’端进行映射可以确定polya尾的位置。ditags是全长转录本5’和3’的标志，因此可以定义pri-mirna转录本边界，是确定转录本长度的主要标记。
59.以人mir-let-7e为例，利用基因组数据库ucsc(http://genome.ucsc.edu/,university california,santa cruz)和ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析转录本上下游约10kb转录功能类型的特点，并对其5
‘
和3’边界进行定位(图2和图3)。5种转录特征类型(tsss、cpg、5’cage、ctcf和polya)可作为注释hsahsa-let-7e的标志。pre-mir-let-7e位于第19号染色体(19q13.41:51,692,786-51,692,864)，长度为79nt的人源初级mirna，与基因spaca6-as1(sperm acrosome associated,51693527-51750123,11597bp)编码序列毗邻，是一种典型的“intergenic mirna”。hsa-let-7e上游106nt处为mir-99b，其下游390nt处同hsa-mir-125a相邻，三者共同组成mir-99b～125amirna簇。ucsc的预测显示hsa-mir-99b～125a mirna簇在人、小鼠、大鼠和斑马鱼基因组中高度保守(图4)。phylop直方图显示，在mir-99b、let-7e和mir-125a序列区域均出现较高的分值。核苷酸pre-let-7e上游边界分析发现，一个大小为241bp的cpg岛出现在其～3500bp，与三个tsss(id:309755,id:309756,id:309757)重叠，提示此区域为5’末端边界。同时此区域还是多个fantom 5’cage的紧密聚集区，进一步确认为启动子gh19j051687所在区域(图5)。
60.hsa-let-7e下游3’末端10kb以内的标记仅有polya出现，在hsa-pre-let-7e下游3494bp处出现序列为“aataaa”的polya，预测为hsa-let-7e的3’边界(图5)。可以推测出pri-let-7e的上游边界位于3454bp(51,689,333)，下游边界位于3500bp的polya处(51,696,357)。
61.二、mirna转录本二级结构分析
62.利用rnaalifold(http://rna.tbi.univie.ac.at)对pri-let-7e结构进行预测分析(图6.a)，依据碱基互补配对概率对获得的序列进行二级结构预测，生成最小自由能(minimum free energy,mfe)结构的交互图，配对区域互补关系概率越高着色越深反之越
浅，对于未配对的区域无着色。预测结果以最小自由能(minimum free energy,mfe)表示的最佳二级结构(图6.a)，最小自由能为-377.60kcal/mol。结果显示mir-99b～125a mirna簇表现出较好的二级结构拟合度，如预测的hsa-pre-let7e二级结构同图6.b中所示hsa-pre-let-7e序列的茎环结构基本相同。图6.a中颜色标记位置分别为前体mirna-99b，let-7e和mirna-125a在转录本中的相对位置及二级结构，依据碱基互补配对概率分析，均显示出较高的rna结构和碱基配对概率间的对应关系。依据碱基互补配对概率最小自由能对图a中的对mir-99b～125amirna簇序列进行位置熵(entropy)分析，做山形图(图6.c)。最小自由能mfe、rna结构的热力学集合pf和重心centroid分析显示，发卡环结构位置处碱基配对的概率均表现出较高的熵评分，与mir-99b～125a mirna簇中的前体mirna的序列位置相对应。
63.三、引物设计
64.1.初级和前体mirna引物设计
65.引物设计采用以下标准：mirna前体的发卡序列均位于初级和前体mirna引物内(图7a)。其中，pri-mirna正向引物以侧翼序列5’端ug结构上游，而逆向引物设计为3’端cnnc基序下游。pre-mirna的正向引物在茎部主干部位，包含mirna全长序列，逆向引物则设计为对侧包含*mirna的序列。
66.由于发卡结构同时位于pri和pre-mirna中，针对发卡结构设计的引物能同时扩增两种rna。引物设计需满足以下几点要求：
67.1)pre-dme-let7引物的5’和3’端允许最大延伸4nt。
68.2)引物长度为18～24nt，最大tm差为2℃。
69.3)引物理想tm值为55～61℃。
70.4)3’端无gc夹序列，扩增片段》55bp。
71.2.成熟体mirna引物设计(茎环法)
72.首先设计逆转录茎环引物(图7b-d)和正向和逆向扩增引物(图7d)。其中，茎环引物是一段全长为约50nt的序列，序列碱基主体部分基本相同，仅在末尾包含mirna 3’端6个碱基的反向互补序列。经逆转录后形成茎部主干和发卡结构的cdna模板(图7c)。正向引物约20nt的序列，包含mirna mirna主干(除茎环引物3
‘
端6个碱基外)和5’末端约4-6个碱基的生成序列(图7d)。逆转录通用引物为茎环引物3’端的一段长约20nt的反向互补序列。
73.四、rna提取及qpcr录反应
74.采用trizol(life technologies)的方法从hek293t细胞(1x105)或组织中提取总rna。再加入1ml trizol室温放置5分钟，4℃低温离心机中以12000g离心10分钟后取上清转移至新的离心管中。室温孵育5分钟后加入0.2ml氯仿，轻轻翻转离心管约10次后室温静置3-5分钟。在4℃低温离心机12000g离心15分钟。此时总rna位于上层的水相，移液器吸取470μl上层水相转移至新的离心管。加入470μl的异丙醇，轻轻翻转离心管约10次后置于-80℃冰箱10分钟。取出，4℃离心机12000g离心15分钟沉淀rna，此时或可见白色半透明rna附着在管底。弃去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤，低温离心机中12000g离心10分钟，弃上清后加入预热的depc水充分溶解rna，在nanodrop 2000(thermo fisher scientific)上测量rna浓度以及纯度。
75.初级和前体mirna的逆转采用通用引物oligo(dt)，而成熟体mirna逆转录反应根据不同方法采用不同的逆转录引物，如茎环法采用茎环引物(stem-loop primer)，polya法
采用ployt引物等。
76.采用sybr green法在逆转录模板中加入rox dye染料、dna聚合酶(如taq等)、特异性上下游引物以及dntp、mgcl2等，热循环仪(如abi-7500)上快速实时定量聚合酶链式反应。根据设计的特异性引物分别对初级、前体和成熟体mirna进行扩增。
77.五、对人源let-7e(hsa-let7e)进行检测
78.为了检验本方法对初级、前体和成熟体mirna定量过程，我们以亚砷酸钠(naaso2)处理hek293t细胞检测人let-7e为例进一步说明。首先，hek293t细胞以每孔1x 105数目铺6孔细胞培养板，贴壁培养24h待细胞汇合度达到90％后，将细胞分为三组，即naaso2不同剂量(250和500μmol)处理组和ctrl对照组，处理30min。随后收集细胞，trizol regent提取总rna，进行逆转录和qpcr反应。
79.引物采用在线引物设计。将确定上下游的初级mirna序列从数据库中以fasta格式导出，初级mirna引物通过primer-blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线设计。在specificity check区选择设计或验证引物的目标数据库(如人的refseq mrna或genome base)和物种。因序前体和成熟体序列包含在初级mirna内，需在“from-to”中设置正反向引物序列的范围。对于初级mirna，正向引物设置范围从序列5’端至gu基序，反向引物设置范围从cnnc基序位置至3’端，扩增片段全长一般选择80-300bp。可通过高级参数设置对引物进一步优化，如对引物特异性检测，可在设计前选择specificity check确保引物的特异性。前体mirna的引物设计需将前体mirna全长序列即从gu基序至cnnc基序输入搜索引擎。前体mirna序列全长较初级短，扩增片段长度一般情况下《200bp。
80.以下为采用ncbi primer-blast设计的hsa-let7e的初级和前体引物：
81.hsa-pri-let-7e(332bp)
82.正向引物：tgtcgggggctcaccat tm＝60.26℃/17nt
83.逆向引物：tttcaggggaaggaggggat tm＝59.88℃/20nt
84.hsa-pre-let-7e(73bp)
85.正向引物：gggctgaggtaggaggttgt tm＝60.0℃/20nt
86.逆向引物：gggaaagctaggaggccgta tm＝60.0℃/20nt
87.成熟体hsa-let7e扩增采用poly(a)法，qpcr扩增反应的正/逆向引物设计时，若退火温度过低，可在5’端增加3-5个c和g碱，如果过高则删除几个碱基，tm值优化至59℃左右。反向引物为15个t，在其5’端补充g，a，c，c，t，g，g，a，c使引物最短的情况下至退火温度59℃。的本次实验引物设计如下：
88.逆转录引物序列为
89.polyt：gaggtccagttttttttttttttvn
90.正向引物：cgcgtgaggtaggaggttgt tm＝59.88℃/20nt
91.逆向引物(通用)：caggtcttttttttttttttt 40.70℃/21nt
92.实施例2对果蝇来源的let-7进行检测
93.为了检验本方法是否适用于其它物种，我们选择了模式生物黑腹果蝇(drosophila melanogaster)作为研究对象，对let-7的果蝇同源基因dme-let7(或dme-let7-5p)的初级和前体转录本注释、引物设计及rt-qpcr扩增等过程进行详细说明。
94.一、dme-let7转录特点分析
95.在ncbi-gnome或ucsc基因组浏览器中找到let7在基因组中的位置，同人源let-7相似，果蝇dme-pre-let7上游500nt处为dme-mir-100，其下游203nt处同dme-mir-125相邻，三者共同组成转录相关的dme-mir-100～125簇，显示出物种的保守性。ncbi-genomics(图8)和ucsc的预测结果显示mir-100～125a mirna簇3’末端与cg10283紧密相接。距dme-let7上游～15kb出现三个cpg岛聚集(702ne,774nt和699nt)，预示着dem-pri-let7的上游边界。同样的证据，ucsc分析发现此多个ests(bi167235,bi636579，bi229433和bi234565等)同cpg岛聚集区重叠，进一步表明此区域为转录起位置。由此可以推定dme-pri-let7上游边界约为距离前体dme-let7上游18.49kb处。下游标志物同样由cpg岛作为标志。在下游16.4kb处的cpg岛为cg10283编码序列的下游边界之外，同数个ests(co275548,ec252334和bp546386等)相重叠，预示着dme-pri-let7下游边界。
96.二、dme-let7引物设计
97.pri-mirna的二级结构中5’末端的gu基序和3’末端的cnnc基序相对保守，是判断初级mirna的边界标志(图9.b)，为了准确扩增dme-let7的初级、前体，正向引物设计范围设置为dme-mirna-100的3’末端至gu基序，逆向引物设计范围为cnnc基序3’末端至下游dme-mirna-125的5’末端(图9.a)。因前体较短，pre-let7正向和逆向引物扩增范围可不做限制。
98.采用ncbi primer-blast设计dem-let7的初级和前体引物，序列如下所示：
99.dme-pri-let7(214bp)
100.正向引物：cgtttcaaccaaaaaccgaacc tm＝59.4℃/22nt
101.逆向引物：ggtgcagttcgattgggattc tm＝59.6℃/21nt
102.dme-pre-let7(74bp)
103.正向引物：ggcaaattgaggtagtaggttgt tm＝58.67/23nt
104.逆向引物：caagcaaagaaagctagcacat tm＝57.83/22nt
105.首先从mirnabase数据库(ver.22)中获得成熟体dme-let7序列，利用primer design tool(http://genomics.dote.hu:8080/mirnadesigntool/)网络mirna引物设计工具或mirna design v1.01软件(vazyme biotech)设计成熟体dem-let7逆转录茎环引物和正向引物设计。逆转录通用引物为茎环引物的一段长反向互补序列。以mirna design v1.01软件(图10)为例设计成熟体dme-let-7引物，序列分别为：
106.茎环逆转录引物(stem-loop)：
107.gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaca ctata
108.正向扩增引物(forward primer)：
109.gcgcgtgaggtagtaggttg tm＝58.4℃/20nt
110.逆向通用引物(universal reverse):
111.agtgcagggtccgaggtatt tm＝58.5℃/20nt
112.三、果蝇样品的准备
113.选取野生型w
1118
果蝇分别放入常温25℃和热激29℃培养箱，培养48小时。后取出解剖显微镜下去除内脏组织，以每3只/管放入装有200μl trizol(life science)的1.5ml离心管中，研磨棒研磨约1分钟充分匀浆。再加入800μl trizol至总体积为1ml，4℃低温离心机中以12000g离心10分钟后取上清转移至新的离心管中。室温孵育5分钟后加入0.2ml氯
仿，轻轻翻转离心管约10次后室温静置3-5分钟。在4℃低温离心机12000g离心15分钟。此时总rna位于上层的水相，移液器吸取470μl上层水相转移至新的离心管。加入470μl的异丙醇，轻轻翻转离心管约10次后置于-80℃冰箱10分钟。取出，4℃离心机12000g离心15分钟沉淀rna，此时或可见白色半透明rna附着在管底。弃去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤，低温离心机中12000g离心10分钟，弃上清后加入预热的depc水充分溶解rna，在nanodrop 2000(thermo fisher scientific)上测量rna浓度以及纯度。qpcr仪(applied biosystems
tm 7500,thermo fisher scientific)上进行逆转录和qpcr反应。
114.四、逆转录及qpcr反应
115.对于成熟体hsa-let7e和dme-let7的扩增，分别采用polya法和茎环法。
116.1)hsa-let7e成熟体mirna逆转录反应(polya法)。通过计算得到100ng rna所对应的rna溶液的体积，在200μl的离心管中进行如下反应。
[0117][0118]
pcr仪上运行程序：温度37℃反应60分钟,85℃维持5min后反应结束。
[0119]
成熟体hsa-let7e qpcr反应，在反应管中配制如下反应液：
[0120][0121]
qpcr仪上运行如下反应程序：
[0122]
[0123]
2)dme-let7成熟体mirna逆转录反应(茎环法)：
[0124]
mirna逆转录按照试剂盒mirna 1st strand cdna synthesis kit(#mr101,vazyme)进行。
[0125]
基因组dna的去除：
[0126]
通过计算得到100ng rna所对应的rna溶液的体积，在200μl的离心管中进行如下反应：
[0127][0128]
pcr仪上运行程序：热盖温度105℃，体系温度42℃反应2分钟。
[0129]
cdna模板合成反应：
[0130]
反应完成后无需转移液体，在rnase-free离心管中配制如下混合液，移液器轻轻吹打混匀。pcr仪上进行第一链cdna模板合成。
[0131][0132]
pcr仪上运行程序如下：
[0133][0134]
结束逆转录程序后，将离心管取下并保存在-20℃。
[0135]
成熟体dme-let7 qpcr反应采用试剂盒mirna universal sybr qpcr master(vazyme,#mq101)。
[0136]
[0137][0138]
qpcr仪上运行如下反应程序：
[0139][0140]
5)初级和前体let7逆转录反应(适用于上述两个物种)：
[0141]
初级和前体dme-let7的逆转录反应采用试剂盒iii rt supermix for qpcr(+gdna wiper)(vazyme,#r323)。
[0142]
基因组dna的去除：
[0143]
通过计算得到500ng rna所对应的rna溶液的体积，在200μl的离心管中进行如下反应：
[0144][0145]
pcr仪上运行程序：热盖温度105℃，体系温度42℃两分钟。
[0146]
反应完成后向离心管中加入4μl 5
×
hiscript iii qrt super mix至20μl反应体系，并用枪头混匀。pcr仪上运行如下程序：逆转录引物为oligo dt随机引物。
[0147][0148]
逆转录反应结束后，将离心管取下并保存在-20℃。
[0149]
初级和前体dme-let7 qpcr反应：
[0150]
初级和前体dme-let7的qpcr反应均采用试剂盒mirna universal sybr qpcr master mix(vazyme,mq101)。
[0151]
dme-let7的qpcr反应体系：
[0152]
前体pre-let7的qpcr反应体系：
[0153][0154]
初级pri-let7的qpcr反应体系：
[0155][0156]
qpcr仪上运行如下反应程序：
[0157]
[0158][0159]
溶解检测曲线程序：95℃15秒；63℃1分钟；95℃15秒，在此步骤检测荧光信号。对于hsa-let-7e及其前体的内参基因设为snrna u6，dem-let7的内参基因设为snor422，对于pre-let7和pri-let7的内参设为rp49。不含cdna模板的反应设置为阴性对照。
[0160]
五、实验结果
[0161]
1)人源has-let-7e初级、前体和成熟体的扩增反应
[0162]
hek293t细胞经naaso2处理30min后，收集细胞提取总rna，逆转录后对hsa-pri-let-7e(c,e)进行rt-qpcr相对定量分析，结果见图11。为了对比不同剂量naaso2(250um和500um)处理是否影响hsa-pri-let-7e生物发生，采用sn rna u6(b,d)作为内参对hsa-pri-let-7e表达水平进行相对定量。hsa-pri-let-7e和sn rna u6的反应的扩增曲线(b、c)表明qpcr均能对hsa-pri-let-7e和sn rna u6进行扩增，而阴性对照显示无扩增(a)。熔解曲线也显示hsa-pri-let-7e和内参sn rna u6反应良好(b、d)，表明引物具有特异性。采用2-δδct
分析对各组进行定量分析，naaso2不同浓度处理组与对照组相比并无明显改变(f)，表明naaso2对hsa-pri-let-7e水平无显著影响。
[0163]
对比不同剂量naaso2(250um和500um)处理的hek293t细胞hsa-pre-let-7e表达水平，同样逆转录后对hsa-pre-let-7e表达水平进行相对定量(c,e)，采用sn rna u6(b,d)作为内参，结果见图12。hsa-pre-let-7e和sn rna u6的反应的扩增曲线(b、c)表明qpcr均能对hsa-pre-let-7e和sn rna u6进行有效扩增，而阴性对照显示无扩增(a)。熔解曲线也显示hsa-pre-let-7e和内参sn rna u6反应良好(b、d)，表明引物具有特异性。采用2-δδct
分析对各组进行定量分析，尽管250um浓度的naaso2处理组与对照组相比并无明显改变，500um浓度的naaso2处理组hsa-pre-let-7e表达水平显示出有意义的升高(f)，表明高剂量naaso2处理影响hsa-pre-let-7e表达水平(*,p《0.05)。
[0164]
对比不同剂量naaso2(250um和500um)处理的hek293t细胞hsa-let-7e表达水平，同样逆转录后对hsa-let-7e表达水平进行相对定量(c,e)，采用sn rna u6(b,d)作为内参，结果见图13。hsa-let-7e和sn rna u6的反应的扩增曲线(b、c)表明qpcr均能对hsa-let-7e
let7发生水平显著降低可能是由于drosha酶对前体dme-let7处理能力的下降导致。以上过程表明，sybr green荧光qpcr法能够对初级、前体和成熟体mirna进行有效地相对定量分析。
[0173]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种初级和前体mirna的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、根据转录起始位点、cpg岛、表达序列标签、polya、基因表达的cap分析、cis-pet/ditags中的一种或几种对目标mirna进行定位；s2、针对目标mirna设计引物，其中，正向引物设置范围为序列5’端至gu基序，反向引物设置范围为cnnc基序至3’端，正向引物和反向引物的tm值为55～61℃，且正向引物与反向引物的最大tm差为2℃；s3、对样本进行逆转录和pcr，建立荧光强度和目标mirna的坐标系，实现对目标mirna的检测。2.根据权利要求1所述的mirna检测方法，其特征在于：在步骤s3中，当目标mirna为初级mirna或前体mirna时，以寡聚胸腺嘧啶引物为逆转录引物。3.根据权利要求1所述的mirna检测方法，其特征在于：在步骤s3中，所述pcr为qpcr。4.根据权利要求1所述的mirna检测方法，其特征在于：在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，对样本进行热激。5.根据权利要求4所述的mirna检测方法，其特征在于：所述的热激为将样本置于27～29℃下热处理。6.根据权利要求1所述的mirna检测方法，其特征在于：在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，抑制样本中的mirna加工酶的表达。7.根据权利要求6所述的mirna检测方法，其特征在于：所述的mirna加工酶选自pol ii、dicer、drosha、dgcr8、pasha、exportin5、ago1和ago2中的一种或几种。8.根据权利要求1所述的mirna检测方法，其特征在于：在步骤s3中，在逆转录和pcr之前，对带有目标mirna的细胞进行培养，随后在480～520um亚砷酸盐中应激处理，收集细胞提取总rna。9.根据权利要求8所述的mirna检测方法，其特征在于：所述目标mirna为前体mirna。10.根据权利要求8所述的mirna检测方法，其特征在于：所述亚砷酸盐的浓度为500um。

技术总结
本发明涉及一种初级和前体miRNA的检测方法，包括对目标miRNA定位、针对目标miRNA设计引物以及RT-QPCR检测步骤，具体地：根据转录起始位点、CpG岛、表达序列标签、polyA、基因表达的Cap分析、CIS-PET/Ditags中的一种或几种对目标miRNA进行定位；设计引物时，正向引物设置范围为序列5’端至GU基序，反向引物设置范围为CNNC基序至3’端，正向引物和反向引物的Tm值为55～61℃，且正向引物与反向引物的最大Tm差为2℃；对样本进行逆转录和PCR，建立荧光强度和目标miRNA的坐标系，实现对目标miRNA的检测。本发明根据对初级和前体miRNA上下游边界注释，根据其转录特点设计定量扩增引物，设计方法简便易行，对于具有临床诊断意义的miRNA的标志物具有良好的潜在应用价值。标志物具有良好的潜在应用价值。标志物具有良好的潜在应用价值。


技术研发人员：孟红蕊 龙翔 姜梦妮 阎双佳 张婷
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/7/21