新型GalNAc化合物及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法与流程

新型galnac化合物及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种新型galnac化合物，及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法。


背景技术：

2.n-乙酰半乳糖胺（n-acetylgalgactosamine, galnac）是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体（asgpr）结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体是肝细胞表面特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用去唾液酸糖蛋白受体的高亲和性配体galnac作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了一定的进展。例如，阿尔尼拉姆公司（alnylam pharmaceuticals, inc.）报道了基于galnac缀合技术的sirna在小鼠体内发挥基因沉默活性（j. am. chem. soc. 2014, 136, 16958）。文中报道了galnac与sirna的缀合物，在体内和体外试验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内试验，单一剂量的ed
50
确定为1 mg/kg，单次注射剂量小于1 ml。在长期给药试验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
3.目前，galnac与寡核苷酸缀合常规的方法是固相合成方法。一种方法是把galnac化合物连接到cpg（controlled pore glass，可控微孔玻璃）柱上，通过固相合成实现galnac化合物与寡核苷酸的连接。另一种方法是将galnac化合物先制备成亚磷酰胺单体，通过固相合成实现galnac化合物与寡核苷酸任意位置的连接。
4.常规的方法存在如下缺陷：1）固相合成偶联效率可能会因为galnac化合物空间位阻较大，导致偶联效率下降，甚至偶联较困难，从而整体收率大大降低。2）galnac亚磷酰胺单体合成路线长，难度较大。
5.目前的固相方法对反应的基团具有一定的限制，通常是将galnac化合物与核苷酸中磷酸二酯键的氧原子连接，因此，缀合的类型相对比较局限。对于硫代寡核苷酸，如果按照常规的固相合成方法，需要将galnac化合物制备成相应的亚磷酰胺单体，并且galnac化合物需要通过硫醚键连接到亚磷酰基团上，但由于以下原因，用常规的方法很难进行：1）将galnac化合物通过硫醚键连接到亚磷酰基团上制备成亚磷酰胺单体，至今尚未有相关类似化合物的报道，推测该技术实施起来难度过大。
6.2）虽然有相关专利和文献对一些简单类似合成的方法进行描述，如us5218088提到甲硫醚基连接到亚磷酰基团，wo2021178885提到3’或5’的氧原子被硫原子替代连接到亚磷酰基团，toshiki, tanaka等提到苯巯基连接到亚磷酰基团（tetrahedron letters, 1986, 27(2): 199-202.），但上述方法涉及的都是一些化学结构非常简单、化学性质稳定的小分子。
7.3）核苷酸结构复杂，含有碱基、核糖（或脱氧核糖）以及磷酸酯等基团，化学性质同简单的小分子差别巨大，关于将galnac化合物通过硫醚键与寡核苷酸进行缀合还未见报道。
8.因此，本领域仍有开发与硫代寡核苷酸偶联制备缀合物的方法的需求。


技术实现要素：

9.为了克服上述现有技术的一个或多个问题，本发明设计并合成了一系列新型galnac化合物，通过液相合成方法，这些galnac化合物可以与硫代寡核苷酸高效缀合。
10.本发明一方面提供式(i)化合物或其药学上可接受的盐：其中，x1为-(ch2)
a-或-(ch2ch2o)ach
2-，a是1-5的整数；x2为-(ch2)
b-，b是1-6的整数；x3为-nhc(o)-或-c(o)nh-；x4为-(ch2)
c-，c是1-5的整数；y1为0或1；y2为0、1或2；y3为1、2或3；r为cl、br、i、或。
11.例如，x1为-(ch2)
4-、-(ch2)
2-或-(ch2ch2o)3ch
2-。
12.例如，x2为-(ch2)
3-、-(ch2)-或-(ch2)
5-。
13.例如，x4为-(ch2)-或-(ch2)
2-。
14.例如，所述式(i)化合物为具有以下结构的化合物yk-gal-001、yk-gal-002、yk-gal-003、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-006、yk-gal-007、yk-gal-008、yk-gal-009或yk-gal-010：，，
，，，，
，，，。
15.优选地，式(i)化合物或其药学上可接受的盐能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。
16.本发明另一方面提供一种使如上述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸偶联的方法，包括以下步骤：1）将硫代寡核苷酸和式(i)化合物或其药学上可接受的盐在有机溶剂中反应；2）反应结束，浓缩溶剂，得残留物；和3）残留物纯化，得产品。
17.所述有机溶剂例如为极性非质子溶剂，优选为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或多种，更优选为二甲基亚砜。
18.所述硫代寡核苷酸例如是磷酸二酯键中的一个非桥氧原子被硫原子所取代的寡核苷酸。
19.所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸的摩尔比例如为约5: 1
至约30: 1，优选为约7.5: 1至约20: 1，更优选为约10: 1。
20.步骤1）的反应温度例如为约20至60℃，优选为约25至55℃，更优选为约50℃。
21.步骤1）的反应时间例如为约1至15h，优选为约5至10h，更优选为约8h。
22.所述硫代寡核苷酸例如为小干扰核苷酸、dna、微小rna、小激活rna、小向导rna、转运rna、反义核苷酸或适配体，优选为反义核苷酸或小干扰核苷酸。
23.本发明另一方面提供一种缀合物，其包含硫代寡核苷酸和galnac部分，其中galnac部分为，x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3如上述式(i)化合物中所定义。
24.优选地，所述硫代寡核苷酸调节靶基因的表达。
25.例如，所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过键或可切割的连接体连接。
26.例如，所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过硫代磷酸酯键连接。
27.例如，所述缀合物具有如下结构式：，x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3如上述式(i)化合物中所定义。
28.本发明另一方面提供上述缀合物，其用作药物。
29.本发明另一方面提供上述缀合物在制备药物中的用途。
30.本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含上述缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
具体实施方式
31.本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方案都可与任一其它实施方案或多个其它实施方案中的技术特征进行组合以得到另外的实施方案。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方案。
32.本发明中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本发明。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本发明中使用的用途或术语冲突，那么以本发明的用途和术语为准。
33.本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。
34.除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。
35.除了在工作实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质例如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本技术列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。
36.本发明中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本文所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
组成”、或“由
…
组成”。
37.术语“药学上可接受的”在本技术中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。
38.术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见s. m. berge等人“pharmaceutical salts”，j. pharm. sci. 1977, 66, 1-19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、d-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。例如，可使用hcl(或盐酸)、hbr(或氢溴酸溶液)、甲磺酸、硫酸、酒石酸或富马酸与式(i)所示的化合物形成药学上可接受的盐。
39.本技术中的硫代寡核苷酸包括单链寡核苷酸（例如反义核苷酸，简称aso）和双链寡核苷酸（例如小干扰核苷酸，简称sirna）。
40.在一种实施方案中，硫代寡核苷酸选自小干扰核苷酸、dna、微小rna（mirna）、小激活rna（sarna）、小向导rna（small guide rna，sgrna）、转运rna（trna）、反义核苷酸或适配体（aptamer），优选硫代寡核苷酸为反义核苷酸或小干扰核苷酸。
41.本技术中的寡核苷酸包括天然的寡核苷酸和化学修饰的寡核苷酸。此处的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。寡核苷酸的化学修饰不包括仅在核碱基序列上有差异的情形。此处的天然是指天然存在的rna或dna对应的情形。
42.天然的寡核苷酸进入细胞困难，且易被胞内核酸酶降解，作用效果较差。通过对寡核苷酸的化学修饰，可以改善其特性，增加其生物利用度。在众多修饰的寡核苷酸中，最具代表性的是硫代寡核苷酸，其中一种硫代方式为磷酸二酯键中的一个非桥氧原子被硫原子所取代，例如。
43.硫代寡核苷酸可以是市售的，也可以通过常规的固相合成方法制备。可以使用氢化黄原素作为硫化剂。例如，可参考cn1479745a和cn113150041a合成硫代寡核苷酸。
44.本技术中式(i)化合物与硫代寡核苷酸的缀合通过式(i)化合物的“r”基团与硫代
寡核苷酸中硫代磷酯的sh上的氢离去反应得到。
45.现有研究表明，化合物与硫代磷酯中巯基的反应收率，受化合物结构及与硫代磷酯中巯基连接的基团影响很大（bioorganic chemistry, 2009, 37(4):101-105.；advanced synthesis & catalysis, 2018, 360(10): 1913-1918）。虽然寡核苷酸分子量非常大，并且三维结构复杂，而且galnac化合物结构也非常复杂，但本发明将设计的galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联，收率为65%以上，最高可达85%以上。
46.本发明一方面提供式(i)化合物或其药学上可接受的盐：其中，x1为-(ch2)
a-或-(ch2ch2o)ach
2-，a是1、2、3、4或5；x2为-(ch2)
b-，b是1、2、3、4、5或6；x3为-nhc(o)-或-c(o)nh-；x4为-(ch2)
c-，c是1、2、3、4或5；y1为0或1；y2为0、1或2；y3为1、2或3，优选地为3；r为cl、br、i、或。
47.例如，x1为-(ch2)
4-、-(ch2)
2-或-(ch2ch2o)3ch
2-。
48.例如，x2为-(ch2)
3-、-(ch2)-或-(ch2)
5-。
49.例如，x4为-(ch2)-或-(ch2)
2-。
50.例如，所述式(i)化合物为具有以下结构的化合物yk-gal-001、yk-gal-002、yk-gal-003、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-006、yk-gal-007、yk-gal-008、yk-gal-009或yk-gal-010：，
，，，，，
，，，。
51.优选地，式(i)化合物或其药学上可接受的盐能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。
52.本发明另一方面提供一种使如上述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸偶联的方法，包括以下步骤：1）将硫代寡核苷酸和式(i)化合物或其药学上可接受的盐在有机溶剂中反应；2）反应结束，浓缩溶剂，得残留物；和3）残留物纯化，得产品。
53.硫代寡核苷酸可以是商购的或者通过固相化学合成方法制备的。
54.所述有机溶剂例如为极性非质子溶剂，优选为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或多种，更优选为二甲基亚砜。
55.所述硫代寡核苷酸例如是磷酸二酯键中的一个非桥氧原子被硫原子所取代的寡核苷酸。
56.所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸的摩尔比例如为约5: 1至约30: 1，优选为约7.5: 1至约20: 1，更优选为约10: 1。
57.步骤1）的反应温度例如为约20至60℃，优选为约25至55℃，更优选为约50℃。
58.步骤1）的反应时间例如为约1至15h，优选为约5至10h，更优选为约8h。
59.所述硫代寡核苷酸例如为小干扰核苷酸、dna、微小rna、小激活rna、小向导rna、转运rna、反义核苷酸或适配体，优选为反义核苷酸或小干扰核苷酸。
60.在一种优选的实施方案中，硫代寡核苷酸包含7-30个核苷酸。通过这样的硫代寡核苷酸制得的缀合物将更具有治疗价值。
61.本发明另一方面提供一种缀合物，其包含硫代寡核苷酸和galnac部分，其中galnac部分是上述式(i)化合物减去“r”基团，即，其中x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3同前所定义。
62.优选地，所述硫代寡核苷酸调节靶基因的表达。
63.例如，所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过键或可切割的连接体连接。此处的键可包括但不限于磷酸酯键和硫代磷酸酯键。
64.本技术中所用的可切割的连接体是指内化后由细胞内代谢进行切割的连接体，例如通过水解、还原或酶促反应进行切割。合适的连接体包括但不限于酸不稳定连接体、水解不稳定连接体、酶促可切割连接体和还原不稳定连接体。酸不稳定连接体可参考adc药物（mylotarg，besponsas，trodelvys）中的酸不稳定连接体。
65.例如，所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过硫代磷酸酯键连接。
66.例如，所述缀合物具有如下结构式：，其中x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3同前所定义。
67.本发明另一方面提供上述缀合物，其用作药物。
68.本发明另一方面提供上述缀合物在制备药物中的用途。
69.本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含上述缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
70.赋形剂包括但不限于分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂、调味剂、着色剂等。赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如remington’s the science and practice of pharmacy, 第21版, a.r.gennaro；lippincott, williams&wilkins, baltimore, md, 2006)。
71.本发明的有益效果至少如下：1.设计了全新的galnac化合物，与现有技术galnac化合物相比，化学结构显著不同。
72.2.本技术设计的galnac化合物的合成收率高，其中一些代表性化合物的最后一步收率均可达70%以上，总收率最高可达65%。
73.3.合成出的galnac化合物可以与硫代寡核苷酸高效偶联。例如，yk-gal-004、yk-gal-009和yk-gal-010，与硫代寡核苷酸偶联收率分别可达88.1%、87.8%和85.0%。
74.4.本技术通过固相方法合成硫代寡核苷酸，再通过液相方法将galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物总收率可达60%以上，比现有技术固相方法总收率提高10倍以上。
75.1）现有技术常规方法制备galnac硫代寡核苷酸缀合物，合成硫代寡核苷酸以及galnac化合物与硫代寡核苷酸的偶联均用固相方法。此种方法受硫代寡核苷酸结构及偶联位点限制，并且当galnac化合物空间位阻较大时，收率很低。
76.2）本技术通过固相方法合成20个碱基的硫代寡核苷酸，再通过液相方法将galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联，不需将galnac化合物制备成相应的亚磷酰胺单体，能够将galnac化合物与硫代寡核苷酸直接偶联，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率能达到60%以上，与常规固相方法相比，可提高10倍以上。
77.实施例下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。除非另有说明，所有的温度以摄氏度给出。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
78.实施例1：galnac化合物的合成以下缩写字母分别代表如下试剂：dmf：n,n-二甲基甲酰胺；thf：四氢呋喃；hbtu：o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；diea：n, n-二异丙基乙胺；dmso：二甲基亚砜；tmsotf：三甲硅烷基三氟甲磺酸酯；hobt：1-羟基苯并三氮唑；t3p：1-丙基磷酸环酐1.yk-gal-001的合成合成路线如下：
79.步骤1：g1-3的合成将g1-1（53.46 g, 0.20 mol）溶解在n,n-二甲基甲酰胺（750 ml）中，加入o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（83.44 g, 0.22 mol）和n,n-二异丙基乙胺（64.63 g, 0.50 mol），25℃搅拌30 min。再加入g1-2（69.70 g，0.40 mol），25℃搅拌15h。向反应液中加入乙酸乙酯，用饱和氯化钠溶液洗涤3次。分液，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物67.63 g，收率79.8%。ms: 324.3 [m
ꢀ‑ꢀ
boc + h]
+
。
[0080]
步骤2：g1-4的合成将g1-3（67.60 g, 0.16 mol）溶解于二氯甲烷（300 ml）中，加入三氟乙酸（300 ml, 4.05 mol），25℃搅拌1 h。反应液45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物66.65 g，收率99.0%。ms: 324.2 [m + h]
+
。
[0081]
步骤3：g1-6的合成将g1-5（50.00 g, 0.13 mol）加入二氯乙烷（500 ml），25℃搅拌30 min。加入tmsotf（44.45 g, 0.20 mol），25℃搅拌15 h。将反应液缓慢倒入碳酸氢钠（33.60 g, 0.40 mol）冰水混合物（1 l）中，搅拌1 h。用二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，40-45℃减压浓缩除去溶剂，得淡黄色油状物41.85 g，收率98.9%。ms: 330.2 [m + h]
+
。
[0082]
步骤4：g1-8的合成将g1-6（41.05 g, 0.12 mol）和g1-7（37.50 g, 0.18 mol）加入二氯乙烷（500 ml），搅拌溶解，加入3a分子筛（48.20 g），25℃搅拌1 h。加入tmsotf（13.33 g, 0.06 mol），25℃搅拌反应15h。反应液用硅藻土过滤，将滤液缓慢倒入碳酸氢钠（10.08 g, 0.12 mol）冰水混合物（1 l）中，搅拌1 h。用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，40-45℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物65.66 g，收率98.0%。1hnmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.79 (d, j = 9.2 hz, 1h), 7.37-7.32 (m, 5h), 5.21 (d, j = 3.3 hz, 1h), 4.99-4.92 (m, 1h), 4.48 (d, j = 8.5 hz, 1h), 4.09-4.02 (m, 5h), 3.91-3.84 (m, 1h), 3.74-3.68 (m, 1h), 3.45-3.39 (m, 1h), 2.36 (t, j = 7.2 hz, 2h), 2.09 (s, 3h), 1.99 (s, 3h), 1.89 (s, 3h), 1.74 (s, 3h), 1.58-1.47 (m, 4h)。 ms: 560.4 [m + na]
+
。
[0083]
步骤5：g1-9的合成将g1-8（65.00 g, 0.12 mol）、甲酸铵（26.49 g, 0.42 mol）和钯炭（6.50 g）加入乙醇（500 ml）中，加热，回流2小时。过滤除去钯炭，滤液40-45℃减压浓缩除去溶剂，得到无色油状物53.21 g，收率98.4%。1hnmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.84 (d, j = 9.2 hz, 1h), 5.21 (d, j = 3.3 hz, 1h), 4.98-4.94 (m, 1h), 4.49 (d, j = 8.5 hz, 1h), 4.04-3.99 (m, 5h), 3.90-3.84 (m, 1h), 3.44-3.40 (m, 1h), 2.16-2.12 (m, 2h), 2.10 (s, 3h), 1.99 (s, 3h), 1.88 (s, 3h), 1.77 (s, 3h), 1.52-1.44 (m, 4h)。ms: 448.2 [m + h]
+
。
[0084]
步骤6：g1-10的合成将g1-9（20.00 g, 44.7 mmol）溶解在n, n-二甲基甲酰胺（240 ml）中，再加入o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（18.66 g, 49.2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（6.65 g, 49.2 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（20.68 g, 0.16 mol），搅拌30 min，最后加入g1-4（22.53 g, 53.6 mmol），25℃搅拌24 h。反应液55-60℃减压浓缩除去溶剂，再用二氯甲烷溶解，分别用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物。柱层析纯化（meoh/dcm），得棕色油状物25.55 g，收率76.0%。ms: 753.4 [m + h]
+
。
[0085]
步骤7：g1-11的合成将g1-10（25.00 g, 33.2 mmol）、甲酸铵（14.75 g, 0.23 mol）和钯炭（6.25 g）加入乙醇（1 l）中，加热，回流1小时。过滤除去钯炭，滤液40-45℃减压浓缩除去溶剂，得白色油状物18.25 g，收率89.0%。ms: 619.3 [m + h]
+
。
[0086]
步骤8：yk-gal-001的合成将g1-12（0.50 g, 3.6 mmol）溶解在乙酸乙酯（25ml）中，加入1-丙基磷酸环酐（1.52 g, 4.8 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（1.87 ml，12.0 mmol），搅拌5min，加入g1-11（1.49g, 2.4 mmol），25℃搅拌24h。反应液加入乙酸乙酯，水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得油状物1.33 g，收率74.7%。ms:739.0 [m + h]
+
。
[0087]
2.yk-gal-002的合成合成路线如下：
[0088]
将g1-9（600 mg, 1.3 mmol）溶解在n, n-二甲基甲酰胺（12 ml）中，加入o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（552 mg, 1.5 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（698 mg，5.4 mmol），室温下搅拌5min，加入g2-1（405 mg, 2.0 mmol），25℃搅拌24h。反应液加入乙酸乙酯，用饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得淡黄色油状物629 mg，收率86.0%。ms:554.3 [m + h]
+
。
[0089]
3.yk-gal-003的合成合成路线如下：
[0090]
步骤1：g3-1的合成将g1-9（1.0 g, 2.2 mmol）溶解在n, n-二甲基甲酰胺（20 ml）中，加入o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（0.92 g, 2.4 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（0.72 g，5.6 mmol），室温搅拌5min，再加入g1-2（0.57 g, 3.3 mmol），25℃搅拌20h。反应液中加入乙酸乙酯，并用饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物1.24 g，收率91.9%。ms: 604.3 [m + h]
+
。
[0091]
步骤2：g3-2的合成将g3-1（1.24 g, 2.1 mmol）溶解于二氯甲烷（17ml）中，加入三氟乙酸（4.27 ml, 56.89 mmol），25℃搅拌0.5h。反应液45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物1.21 g，收率98.4%。ms: 504.2 [m + h]
+
。
[0092]
步骤3：yk-gal-003的合成将g1-12（0.25 g, 1.8 mmol）溶解在乙酸乙酯（12ml）中，再加入1-丙基磷酸环酐（0.75 g, 2.4 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（0.76 g，5.9 mmol），室温搅拌5min，最后加入g3-2（0.59 g, 1.2 mmol），25℃搅拌20h。反应液中加入乙酸乙酯，用水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物0.59 g，收率80.8%。ms: 624.3 [m + h]
+
。
[0093]
4.yk-gal-004的合成合成路线如下：
[0094]
步骤1：g4-2的合成将g4-1（10.0 g, 0.11 mol）溶于四氢呋喃/水（370 ml，1:1）中，向其中加入碳酸钾（37.96 g, 0.27 mol），搅拌溶解，缓慢滴加二碳酸二叔丁酯（35.93 g, 0.16 mol）的四氢呋喃溶液（15 ml），25℃搅拌15h。分液，水相用四氢呋喃萃取3次，合并有机相。有机相分别用水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得白色固体19.2 g，收率91.4%。ms: 214.2 [m + na]
+
。
[0095]
步骤2：g4-4的合成将g4-2（19.12 g, 0.10 mol）溶于dmso（55 ml）中，向其中加入5 m 氢氧化钠溶液（2.2 ml），25℃搅拌2h，再加入g4-3（28.20 g, 0.22 mol），25℃搅拌15h。将反应液加入8倍重量的冰水中，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，分别用水和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得白色油状物24.58g。收率54.9%。ms: 414.3 [m
ꢀ–ꢀ
56（叔丁基） + na]
+
。
[0096]
步骤3：g4-5的合成
将g4-4（7.10 g,15.9 mol）溶于二氯甲烷（28ml）中，再加入4 m 盐酸/1,4-二氧六环溶液（110 ml），25℃搅拌20h。反应液45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物3.53 g，收率94.6%。
[0097]
步骤4：g4-6的合成将g4-5（1.87 g, 7.9 mmol）溶于10%碳酸钠溶液（110 ml）中，降温至0-5℃，滴加cbz-cl（1.14 ml）的四氢呋喃溶液（12.3 ml）， 25℃搅拌4h。反应液用10%柠檬酸溶液调节ph为2-3，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，分别用水和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得黄色油状物1.75 g，收率59.5%。ms: 304.2 [m
ꢀ‑ꢀ
2co
2 + na]
+
。
[0098]
步骤5：g4-7的合成以g4-6（1.75 g, 4.7 mmol）和g1-2（3.28 g, 18.8 mmol）为原料，按照合成g1-3的方法，得到黄色油状物2.56 g，收率79.3%。ms: 582.1 [m
ꢀ–ꢀ
boc + h]
+
。
[0099]
步骤6：g4-8的合成以g4-7（2.56 g, 3.8 mmol）为原料，按照合成g1-4的方法，得到黄色油状物2.46g，收率96.9%。ms: 504.4 [m + na]
+
。
[0100]
步骤7：g4-9的合成以g1-9（1.34 g, 3.0 mmol）和g4-8（2.46 g, 3.6 mmol）为原料，按照合成g1-10的方法，得到白色粘稠物3.14 g，收率78.1%。ms: 671.0 [m + 2 h]
2+
。
[0101]
步骤8：g4-10的合成以g4-9（3.14 g, 2.3 mmol）为原料，按照合成g1-11的方法，得到白色粘稠物2.45 g，收率88.2%。ms: 604.1 [m + 2 h ]
2+
。
[0102]
步骤9：yk-gal-004的合成以g4-10（2.45 g, 2.0 mmol）和g1-12（0.42 g, 3.0 mmol）为原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到白色固体2.01 g，收率75.5%。ms: 664.2 [m + h ]
2+
。
[0103]
5.yk-gal-005的合成合成路线如下：
4.28-4.20 (m, 2h), 4.15-4.08 (m, 2h), 3.99-3.93 (m, 2h), 3.90-3.83 (m, 2h), 3.70-3.63 (m, 8h), 3.55 (t, j = 6.2 hz, 9h), 3.16 (s, 7h), 3.06-3.00 (m, 14h)。ms: 1795.5 [m + h] +
。
[0108]
步骤5：yk-gal-005的合成将以g5-5（1.00 g, 0.6 mmol）和g1-12（0.13 g, 0.9 mmol）为原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到白色固体0.78 g，收率72.9%。ms: 958.2 [m + 2 h]
2+
。
[0109]
6.yk-gal-006的合成合成路线如下：
[0110]
步骤1：g6-2的合成将g5-1（2.36 g, 5.0 mmol）和g6-1（3.34 g, 16.5 mmol）溶解在n, n-二甲基甲酰胺（30 ml）中，加入o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（6.83 g, 18.0 mmol）和1-羟基苯并三氮唑（41 mg, 0.3 mmol），冰浴条件下，缓慢滴加n, n-二异丙基乙胺（2.13 g, 16.5 mmol），室温搅拌8h。冰浴条件下，加入40 ml水淬灭反应，再加入30 ml甲基叔丁基醚。分液，水相用乙酸乙酯萃取两次。合并有机相，有机相用40 ml饱和碳酸氢钠溶液洗1次，再水洗3次，最后用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相用无水硫酸钠干燥，45-50℃减压浓缩除去溶剂，得到淡黄色油状物（4.12 g, 4.0 mmol），收率80.3%。ms: 1024.6 [m + h]
+
。
[0111]
步骤2：g6-3的合成以g6-2（4.10 g，4.0 mmol）为原料，按照合成g1-4的方法，得黄色油状物为4.01 g, 收率98.8%。1h-nmr (400 hz; dmso): δ 7.94 (s, 1h), 7.68-7.77 (m, 4h), 7.14-7.15 (m, 4h), 4.80 (s, 2h), 3.79-3.85 (m, 5h), 3.47 (t, j = 6.00 hz, 4h), 3.39 (t, j = 6.00 hz, 5h), 3.33 (s, 4h), 3.28 (s, 3h), 2.18 (t, j = 6.10 hz, 3h), 2.12 (t, j = 6.10 hz, 5h), 1.76 (s, 7h), 1.32-1.37 (m, 10h), 0.97 (t, j = 7.16 hz, 8h)。ms: 724.6 [m + h]
+
。
[0112]
步骤3：g6-4的合成
g, 0.87 mmol），收率97.7%。ms: 538.2 [m + h]
+
。
[0118]
步骤3：g7-4的合成以g7-3（0.47 g, 0.87 mmol）和g5-3（0.20 g, 0.22 mmol）为原料，按照合成g1-10的方法，得到淡黄色油状物（0.35 g, 0.16 mmol），收率72.9%。ms: 1115.8 [m + 2 h]
2+
。
[0119]
步骤4：g7-5的合成以g7-4（0.35 g, 0.16 mmol）为原料，按照合成g1-11的方法，得到白色糠状固体（0.28 g, 0.13 mmol），收率84.8%。ms: 1049.0 [m + 2 h]
2+
。
[0120]
步骤5：yk-gal-007的合成以g7-5（0.28 g, 0.13 mmol）和g1-12（27.8 mg, 0.20 mmol）为原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到白色固体（0.22 g, 0.09 mmol），收率73.3%。ms: 1109.4 [m + 2 h]
2+
。
[0121]
8.yk-gal-008的合成合成路线如下：
[0122]
以g8-1（0.28 g, 3.0 mmol）和g1-11（1.24 g, 2.0 mmol）为原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到白色油状物（1.11 g, 1.6 mmol），收率79.9%。ms: 696.3 [m + h] +
。
[0123]
9.yk-gal-009的合成合成路线如下：
[0124]
以g9-1（0.69 g, 3.0 mmol）和g1-11（1.24 g, 2.0 mmol）原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到淡黄色油状物（1.25 g, 1.5 mmol）。收率75.3%。ms: 832.0 [m + h] +
。
[0125]
10.yk-gal-010的合成合成路线如下：
[0126]
以g10-1（0.21 g, 3.0 mmol）和g1-11（1.24 g, 2.0 mmol）为原料，按照合成yk-gal-001的方法，得到黄色油状物（1.18 g, 1.5 mmol）。收率72.8%。ms: 809.9 [m + h] +
。
[0127]
上面各galnac化合物合成收率见表1：表1 合成galnac化合物收率
[0128]
从表1可以看出，合成本技术设计的galnac化合物yk-gal-001、yk-gal-002、yk-gal-003、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-006、yk-gal-007、yk-gal-008、yk-gal-009、yk-gal-010，各步收率均较高，最高的是合成yk-gal-005的步骤2，收率达到了100%。各个化合物的最后一步收率均在70%以上。总收率也较高，例如，yk-gal-002的总收率达到了64.8%。
[0129]
实施例2：galnac化合物与硫代寡核苷酸（oligo s）的偶联2.1 硫代寡核苷酸（oligo s）的合成本实施例所涉及到的硫代寡核苷酸（即oligo s）的序列如下：5' tcctccggagccagacttc*a3' （*表示硫代位点）此硫代寡核苷酸采用固相方法合成，具体实验过程如下：（1）试剂和单体准备取100 nmol规格的通用cpg柱，商业化通用的dna单体（da，dt，dc，dg）溶于超干无水乙腈制备成浓度为约0.1-0.2 m溶液，并加入3 a分子筛。以5-乙硫基四氮唑（5-btt）的乙腈溶液为活化剂(0.25 m)，0.05 m碘的吡啶/水/thf溶液为氧化剂，3%三氯乙酸（tca）二氯甲烷溶液为脱保护剂，乙酸酐/水为盖帽剂a（cap a），吡啶/n-甲基咪唑/thf为盖帽剂b（cap b），0.2 m氢化黄原素的吡啶溶液为硫化剂，并装入192 p型号dna/rna自动合成仪中指定的试剂位置中。
[0130]
（2）粗品合成输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成。通用dna单体偶合时间约1分钟，其中氧代时间约30-45秒，硫代时间约2分钟。循环结束后，完成硫代寡核苷酸的固相合成。
[0131]
（3）脱保护合成结束后，需要将硫代寡核苷酸从cpg柱上脱离和单体上的保护基脱离。将带有硫代寡核苷酸的cpg柱从合成仪中取出，放入气相氨解仪内，95℃氨解2 h，氨解结束后降温至60℃以下。取出降至室温，用400 μl 90%乙腈溶液冲洗1次。离心抽干，再用400 μl纯化水洗涤1次，溶液低温浓缩，得粗品残留物。
[0132]
（4）纯化将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解，进行hplc纯化，收集产物峰溶液并用酶标仪测含量，约14.3 od，折算为78.2 nmol，即0.47 mg，收率78.2%。产物峰溶液冻干，冻干
物进行hplc和ms检测。纯度为98.0%。ms：863.9 [m
ꢀ‑ꢀ
7 h]
7-。
[0133]
2.2galnac化合物与硫代寡核苷酸（oligo s）的偶联2.2.1 yk-gal-002与硫代寡核苷酸的偶联（1）二甲基亚砜（dmso）为溶剂合成路线如下：
[0134]
将yk-gal-002（1.5 μmol）和硫代寡核苷酸（150 nmol）溶于二甲基亚砜中，保持硫代寡核苷酸浓度约200 μm。50℃搅拌8 h，lc-ms检测硫代寡核苷酸基本无残留。真空条件下浓缩溶剂，得残留物。将残留物溶于0.3 ml纯化水，hplc纯化，得产物约22.3 od（约0.80 mg，122.0 nmol），收率81.3%。ms: 814.8 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0135]
合成硫代寡核苷酸的收率为78.2%，因此合成galnac硫代寡核苷酸缀合物galnac-oligo s-002的总收率为63.6%。
[0136]
（2）n, n-二甲基甲酰胺（dmf）为溶剂将yk-gal-002（1.5 μmol）和硫代寡核苷酸（150 nmol）溶于n,n-二甲基甲酰胺中，按照（1）中方法，得产物约11.2 od（约0.40 mg，61.5 nmol），收率41.0%。ms: 814.7 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0137]
（3）四氢呋喃（thf）为溶剂将yk-gal-002（1.5 μmol）和硫代寡核苷酸（150 nmol）溶于四氢呋喃中，按照（1）中方法，得产物约16.6 od（约0.60 mg，90.8 nmol），收率60.5%。ms: 814.7 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0138]
每个实验反应溶剂及收率对比见表2。
[0139]
表2 反应条件及收率
[0140]
通过上面实验结果可知，yk-gal-002与硫代寡核苷酸的偶联，以二甲基亚砜、n, n-二甲基甲酰胺和四氢呋喃为溶剂，不需要加入其它试剂就能够反应，得到galnac硫代寡核苷酸缀合物。不同的反应溶剂对收率影响非常大，二甲基亚砜为溶剂，收率可达81.3%，而n, n-二甲基甲酰胺为溶剂，收率仅为41.0%，四氢呋喃作溶剂，收率在二者之间，为60.5%，其中收率最高的二甲基亚砜可达最低的n, n-二甲基甲酰胺的2倍。确定的最优反应溶剂为二甲基亚砜，后面的实施例均以二甲基亚砜为反应溶剂。
[0141]
对其它反应参数的优化结果表明，在反应温度为20~60℃、反应时间为1~15h、投料比（galnac化合物：硫代寡核苷酸）为5: 1~30: 1（摩尔比）条件下，galnac化合物yk-gal-002与硫代寡核苷酸（oligo s）均可偶联，实验结果与上面实验类似。
[0142]
2.2.2 yk-gal-004与硫代寡核苷酸的偶联合成路线如下：
nmol），收率87.8%。ms: 838.2 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0153]
合成硫代寡核苷酸的收率为78.2%，因此合成galnac硫代寡核苷酸缀合物galnac-oligo s-009的总收率为68.7%。
[0154]
2.2.6 yk-gal-010与硫代寡核苷酸的偶联反应路线如下：
[0155]
以yk-gal-010（1.5 μmol）和硫代寡核苷酸（150 nmol）为原料，以dmso为反应溶剂，按照yk-gal-002与硫代寡核苷酸偶联的方法，得产物约23.4 od（0.86 mg, 127.5 nmol），收率85.0%。ms: 838.3 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0156]
合成硫代寡核苷酸的收率为78.2%，因此合成galnac硫代寡核苷酸缀合物galnac-oligo s-010的总收率为66.5%。
[0157]
表3中列出了各个galnac化合物结构、与硫代寡核苷酸偶联收率及合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率。
[0158]
表3 galnac化合物结构、与硫代寡核苷酸偶联收率及总收率
[0159]
从表3可以看出，通过液相合成方法，不同结构的galnac化合物yk-gal-002、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-008、yk-gal-009和yk-gal-010与硫代寡核苷酸偶联，收率在65%~90%之间，其中收率最高的是yk-gal-009，即galnac对甲苯磺酸酯化合物，收率高达87.8%。合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率在50%~70%之间，其中最高的是yk-gal-004，总收率达到了68.9%。
[0160]
yk-gal-002、yk-gal-004和yk-gal-005三个化合物均为galnac溴化物，三者结构上的区别在于，yk-gal-002有1条连接臂，而yk-gal-004和yk-gal-005分别有2条和3条连接臂，化学结构更加复杂，但是与硫代寡核苷酸缀合的收率，三者并无明显差别，均达到了80%以上。
[0161]
现有研究表明，小分子化合物与硫代磷酯中巯基的反应收率，受化合物结构以及与硫代磷酯中巯基连接的基团影响很大（bioorganic chemistry, 2009, 37(4):101-105.；advanced synthesis & catalysis, 2018, 360(10).）。这些小分子化合物与硫代磷酯化学结构都非常简单，但反应收率受不同基团影响有很大波动，最低仅为30%左右。本实
施例中所用硫代寡核苷酸为20个碱基的寡核苷酸，与巯基连接的基团，包括磷酸二酯键、核糖、嘌呤和嘧啶等，化学结构非常复杂，与文献中报道的硫代磷酯化合物结构完全不同，具有巨大差异。因此无法根据现有技术推测出本技术设计的galnac化合物与具有20个碱基、化学结构非常复杂的硫代寡核苷酸是否能够反应，以及反应收率能有多少。
[0162]
发明人通过对反应条件的优化，本技术设计的galnac化合物与具有20个碱基的硫代寡核苷酸能够高效缀合，收率最高达到85%以上，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率可达60%以上，取得了预料不到的技术效果。
[0163]
对比例1：yk-gal-002与硫代寡核苷酸的偶联（参照现有技术方法）反应路线如下：
[0164]
参照cn111484540a中方法（说明书，第26页，[0158]段），氮气保护下，依次将硫代寡核苷酸（0.15 mmol），n, n-二甲基甲酰胺（0.88 ml），二异丙基乙胺（23 mg，0.18 mmol），碘化钠（22 mg，0.15 mmol）和yk-gal-002（99.6 mg，0.18 mmol）加入反应瓶，室温搅拌过夜，反应液经柱层析纯化，得产物342 mg，收率34.9%。ms：814.5 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0165]
从实验结果可知，采用现有技术方法，即n, n-二甲基甲酰胺为溶剂，在反应体系中加入二异丙基乙胺和碘化钠，本技术设计的galnac化合物yk-gal-002与具有20个碱基的硫代寡核苷酸的偶联收率仅为34.9%，而实施例1中采用本技术方法进行偶联，收率为81.3%，提高了46.4%，收率显著提升。
[0166]
对比例2：固相合成连接臂较短的galnac寡核苷酸缀合物通过此实验考察固相方法合成连接臂较短、结构简单的galnac寡核苷酸缀合物的收率。galnac化合物g1-9连接臂较短，为-(ch2)4c(o)o-，且仅有1条链，化学结构比较简单。先将g1-9与固相支持物cpg连接，再通过固相方法合成具有20个碱基的寡核苷酸，合成的寡核苷酸序列与实施例2中所用硫代寡核苷酸相同，只是无硫代。
[0167]
具体实验如下：g1-9先与化合物1反应，得到化合物2，再将化合物2与固相支持物cpg连接，得到cpg-galnac化合物3。
[0168]
1. cpg-galnac化合物的制备
[0169]
步骤1：化合物2的合成将g1-9（3.53 g, 7.9 mmol）、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（3.50 g, 9.2 mmol）和n, n-二异丙基乙胺（4.16 g, 32.2 mmol）加入二氯甲烷（200 ml）中，搅拌溶解，再加入化合物1（3.00 g，7.2 mmol），25℃搅拌反应2h。减压浓缩除去溶剂，分离纯化得到化合物2（5.21 g，86.0%）。ms: 849.8 [m + h] +
。
[0170]
步骤2：cpg-galnac化合物3的制备将化合物2（0.58 g, 0.68 mmol）、琥珀酸酐（0.14 g, 1.36 mmol）和4-二甲氨基吡啶（0.25 g, 2.05 mmol）溶于二氯甲烷（5 ml）中，25℃搅拌20h。反应体系用二氯甲烷稀释，并用水和冷的柠檬酸溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂，得琥珀酸酯（0.32 g, 0.34 mmol），收率50.4%。
[0171]
将琥珀酸酯（0.32 g，0.34 mmol）、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（0.13 g，0.34 mmol）和n, n-二甲基甲酰胺（15ml）加入反应体系，搅拌溶解。随后加入n, n-二异丙基乙胺（0.13 g，1.0 mmol），振荡5min。加入聚苯乙烯支架（5.0 g），25℃振荡24h。过滤，过滤物依次用二氯甲烷、10%甲醇/二氯甲烷和乙醚洗涤，真空干燥2h。再将过滤物于25%乙酸酐/吡啶溶液中振荡0.5h，过滤，依次用二氯甲烷、10%甲醇/二氯甲烷和乙醚洗涤，过滤物真空干燥2h，得cpg-galnac化合物3。
[0172]
2. galnac寡核苷酸缀合物固相合成合成的寡核苷酸序列与实施例2中所用硫代寡核苷酸相同，只是无硫代。将dna单体（a，t，c，g）的乙腈溶液（0.1-0.2m）和cpg-galnac化合物3装入192合成仪，调试设备并设置合成程序（其中第一个单体连接到cpg柱上的活化偶联时间约20min），合成galnac寡核苷酸缀合物。合成结束后进行气相氨解，并进行简单脱盐纯化。酶标仪定量，收率32.0%。ms：918.9 [m
ꢀ‑ꢀ
7 h]
7-。
[0173]
实验结果：对比例2用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物，总收率仅为13.9%。而实施例2中，先用固相方法合成硫代寡核苷酸，再用液相方法将galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联，总收率可达50~70%，为对比例2的3.6~5.0倍。
[0174]
1）cpg-galnac化合物的制备步骤1中，将galnac化合物g1-9与化合物1进行反应，得到化合物2，此步反应收率为86.0%；步骤2中，得到琥珀酸酯的收率仅为50.4%，后面与cpg连接的收率无法准确计算，但即使与cpg连接收率按100%计算，制备cpg-galnac化合物3的总收率仅为43.3%。
[0175]
2）galnac寡核苷酸缀合物固相合成以cpg-galnac化合物3为起始，用固相方法合成20个碱基的寡核苷酸，收率仅为32.0%。通常用固相方法合成寡核苷酸(即起始的核苷酸上无galnac偶联)，每加一个碱基的收率为99%，因此合成20个碱基的寡核苷酸的收率在80%左右。由此可知，本实验中，在用固相方法制备寡核苷酸时，起始的核苷酸上偶联galnac化合物，对后面的反应影响很大，使收率大大降低，仅为起始的核苷酸上无galnac偶联时收率的40%。
[0176]
结论：固相方法合成连接臂较短的galnac寡核苷酸缀合物，总收率仅为13.9%。本技术中先用固相方法合成硫代寡核苷酸，再用液相方法将galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联，总
收率可达50~70%，为对比例2的3.6~5.0倍，收率显著提高。
[0177]
对比例3：固相合成连接臂较长的galnac寡核苷酸缀合物考察galnac化合物连接臂的长短对固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物收率的影响。对比例3中所用的galnac化合物g1-11，连接臂为-(ch2)4c(o)nh(ch2)3nhc(o)(ch2)2o(ch2)2nh-，与对比例2中g1-9相比，连接臂更长，结构更复杂。
[0178]
1. cpg-galnac化合物的制备合成路线如下：
[0179]
步骤1：化合物5的合成以g1-11（4.89 g, 7.9 mmol）和化合物4（4.45 g, 7.2 mmol）为原料，按照合成化合物2的方法，得到淡黄色油状物（6.60 g, 5.41 mmol），收率75.2%。ms: 1219.7 [m + h] +
。
[0180]
步骤2：cpg-galnac化合物6的制备以化合物5（0.83 g, 0.68 mmol）为原料，按照制备cpg-galnac化合物3的方法，先制备得到琥珀酸酯（0.54 g，0.27 mmol），收率40.5%，然后以琥珀酸酯为原料得到cpg-galnac化合物6。
[0181]
2. galnac寡核苷酸缀合物固相合成合成的寡核苷酸序列与实施例2中所用硫代寡核苷酸相同，只是无硫代。将dna单体（a，t，c，g）的乙腈溶液（0.1-0.2m）和cpg-galnac化合物6装入192合成仪，调试设备并设置合成程序（其中第一个单体连接到cpg柱上的活化偶联时间约20min），合成galnac寡核苷酸缀合物。合成结束后进行气相氨解，并进行简单脱盐纯化。酶标仪定量，收率20.3%。ms: 850.2 [m
ꢀ‑ꢀ
8 h]
8-。
[0182]
实验结果：1．对比例2与对比例3比较可知，galnac化合物连接臂越长、化学结构越复杂，合成收率越低对比例3与对比例2相比，收率显著降低。对比例3中所用的galnac化合物g1-11与对比例2中g1-9相比，连接臂更长，化学结构更复杂。由此可知，连接臂更长的galnac化合物，用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物收率更低。对比例2和对比例3各步反应收率见表4。
[0183]
表4 对比例2和对比例3收率比较
[0184]
具体如下：i．cpg-galnac化合物的制备收率：对比例2步骤1收率为86.0%，对比例3收率为75.2%，比对比例2降低了10.8%；对比例2步骤2得到琥珀酸酯的收率为50.4%，对比例3收率为40.5%，比对比例2降低9.9%。两步反应总收率，对比例2为43.3%，对比例3为30.5%，比对比例2降低12.8%。
[0185]
ii．合成galnac寡核苷酸缀合物收率：对比例2为32.0%，对比例3为20.3%，比对比例2降低11.7%。
[0186]
iii．总收率：对比例2为13.9%，对比例3为6.2%，比对比例2降低7.7%。对比例2总收率是对比例3的2倍以上。
[0187]
由比较结果可知，galnac化合物连接臂越长，结构越复杂，用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物的收率也越低。
[0188]
2．本技术方法合成连接臂更长、结构更复杂的galnac硫代寡核苷酸缀合物，与固相合成方法相比，收率显著提高，至少可提高10倍以上i．本技术中galnac化合物yk-gal-008、yk-gal-009和yk-gal-010，是以g1-11为原料制备而成的氯化物、对甲苯磺酸酯化合物和三氟甲磺酸酯化合物，收率分别为79.9%、75.3%和72.8%（实施例1，8-10），由这3个化合物合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率分别达到了51.1%、68.7%和66.5%（实施例2，2.2.4-2.2.6）。ii．本技术中galnac化合物yk-gal-001、yk-gal-002、yk-gal-003、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-006、yk-gal-007、yk-gal-008、yk-gal-009和yk-gal-010，与g1-9和g1-11相比，连接臂更长，结构更复杂，其中有些化合物具有2条或3条链。如果用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物，预计总收率会低于对比例3，即总收率低于6%。
[0189]
iii．yk-gal-002具有1条连接臂，与硫代寡核苷酸偶联收率为81.3%，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率为63.6%（实施例2，2.2.1）。总收率是对比例3固相合成方法的10倍。
[0190]
iv．yk-gal-004和yk-gal-005分别具有2条和3条连接臂，与g1-9和g1-11相比，连接臂更长，结构更复杂，但用本技术方法，与硫代寡核苷酸偶联收率分别可达88.1%和87.5%，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物的总收率分别为68.9%和68.4%（实施例2，2.2.2和2.2.3），均达到了对比例3固相合成方法的11倍，总收率显著提高。
[0191]
v．yk-gal-001和yk-gal-003具有1条连接臂，yk-gal-006和yk-gal-007具有3条连接臂，用本技术方法合成galnac硫代寡核苷酸缀合物，预计总收率均可达60%以上，可达对比例3固相合成方法的10倍以上。
[0192]
结论：
1．应用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物，galnac化合物的结构，例如连接臂长短，对收率影响非常大，连接臂越长收率越低。
[0193]
2．本技术设计的galnac化合物结构复杂，用固相方法合成galnac寡核苷酸缀合物，预计总收率要低于6%。
[0194]
3．用本技术方法，将galnac化合物与硫代寡核苷酸偶联收率可达85%，合成galnac硫代寡核苷酸缀合物总收率可达60%以上，总收率达到了对比例3固相合成方法的10倍以上，收率显著提高。
[0195]
总之，本技术设计并合成出了一系列新型galnac化合物，并用液相方法将galnac化合物与硫代寡核苷酸进行偶联，得到了galnac硫代寡核苷酸缀合物。该方法可以实现硫代寡核苷酸与galnac化合物的定点偶联，反应条件温和，实验操作简单，收率高。

技术特征：
1.式(i)化合物或其药学上可接受的盐：其中，x1为-(ch2)
a-或-(ch2ch2o)
a
ch
2-，a是1-5的整数；x2为-(ch2)
b-，b是1-6的整数；x3为-nhc(o)-或-c(o)nh-；x4为-(ch2)
c-，c是1-5的整数；y1为0或1；y2为0、1或2；y3为1、2或3；r为cl、br、i、或。2.根据权利要求1所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中x1为-(ch2)
4-、-(ch2)
2-或-(ch2ch2o)3ch
2-。3.根据权利要求1所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中x2为-(ch2)
3-、-(ch2)-或-(ch2)
5-。4.根据权利要求1所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中x4为-(ch2)-或-(ch2)
2-。5.根据权利要求1所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其中所述式(i)化合物为具有以下结构的化合物yk-gal-001、yk-gal-002、yk-gal-003、yk-gal-004、yk-gal-005、yk-gal-006、yk-gal-007、yk-gal-008、yk-gal-009或yk-gal-010：，，
，，，，
，，，。6.根据前述权利要求中任一项所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，其能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。7.一种使如前述权利要求中任一项所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸偶联的方法，包括以下步骤：1）将硫代寡核苷酸和式(i)化合物或其药学上可接受的盐在有机溶剂中反应；2）反应结束，浓缩溶剂，得残留物；和3）残留物纯化，得产品。8.根据权利要求7中所述的方法，其中所述有机溶剂为极性非质子溶剂。9.根据权利要求8中所述的方法，其中所述有机溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或多种。10.根据权利要求9中所述的方法，其中所述有机溶剂为二甲基亚砜。11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述硫代寡核苷酸是磷酸二酯键中
的一个非桥氧原子被硫原子所取代的寡核苷酸。12. 根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸的摩尔比为5: 1至30: 1。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸的摩尔比为7.5: 1至20: 1。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述式(i)化合物或其药学上可接受的盐与硫代寡核苷酸的摩尔比为10: 1。15.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中步骤1）的反应温度为20至60℃。16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤1）的反应温度为25至55℃。17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤1）的反应温度为50℃。18.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中步骤1）的反应时间为1至15h。19.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述硫代寡核苷酸为小干扰核苷酸、dna、微小rna、小激活rna、小向导rna、转运rna、反义核苷酸或适配体。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述硫代寡核苷酸为反义核苷酸或小干扰核苷酸。21. 一种缀合物，其包含硫代寡核苷酸和galnac部分，其中galnac部分为，其中x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3如权利要求1-6中任一项的式(i)化合物中所定义。22.根据权利要求21中所述的缀合物，其中所述硫代寡核苷酸调节靶基因的表达。23.根据权利要求21-22中任一项所述的缀合物，其中所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过键或可切割的连接体连接。24.根据权利要求23所述的缀合物，其中所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分通过硫代磷酸酯键连接。25. 根据权利要求24所述的缀合物，其具有如下结构式：，其中x1、x2、x3、x4、y1、y2、y3如权利要求1-6中任一项的式(i)化合物中所定义。26.根据权利要求21-25中任一项所述的缀合物，其用作药物。27.根据权利要求21-25中任一项所述的缀合物在制备药物中的用途。28.一种药物组合物，其包含权利要求21-25中任一项所述的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

技术总结
本发明提供了一种新型GalNAc化合物及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法，该新型GalNAc化合物为式(I)化合物。采用液相合成方法，式(I)化合物可以与硫代寡核苷酸直接偶联得到缀合物，该方法反应条件温和，收率高。收率高。收率高。


技术研发人员：宋更申 王杰 黄泽傲 谢豪 马儒杰
受保护的技术使用者：北京悦康科创医药科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/7/22