一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法及其应用

1.本发明涉及一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法及其应用，属于生物化工技术领域。


背景技术：

2.1,4-丁二醇是一种重要的化学品，可以作为原料合成一系列具有重要应用的高附加值产品，例如具有特殊性能的高档聚氨酯胶黏剂、聚氨酯弹性体，其应用覆盖聚氨酯、聚酯、涂料、染料、医药等多个领域，具有广阔的市场前景。目前1,4-丁二醇高价格限制了其产能和应用，但全球市场对该产品的需求正在以5％～8％的年增长率增长。
3.目前全球工业上1,4-丁二醇生产几乎完全由乙炔、丁烷或丁二烯等不可再生的石油化石原料通过化学法制造，而且其生产装置较为复杂，生产费用较高，同时还会造成一定程度上的环境污染。不仅如此，工业生产设备通常面临设备装置要求高、设备腐蚀问题严重、催化剂稳定性差等问题。
4.利用生物法合成1,4-丁二醇可以减少金属催化剂和化石能源的消耗，提高循环经济水平，实现低碳生产。目前，生物基合成1,4-丁二醇的研究主要集中在使用葡萄糖、木质纤维素等生物质经过发酵法进行合成，不但要经过漫长的代谢路径，而且代谢调控十分复杂。欧美及日本等在生物法生产1,4-丁二醇的研究已进入逐渐成熟的阶段，并且已经商业化，尤其是美国genomatica公司，但其技术中副产物醋酸酯的产生难以控制。因此，开发一种新型的清洁高效的1,4-丁二醇微生物合成法很有必要。
5.通过生物催化的方法生产1,4-丁二醇，不仅反应温和，而且具备较好的反应选择性。因此，开发基于
ɑ-酮戊二酸为底物生物生产1,4-丁二醇的生物制造工业对于环境保护及提高循环经济水平都具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供一种高效、高产，可利用
ɑ-酮戊二酸在温和条件下转化生产1,4丁二醇的新方法。
7.本发明通过在大肠杆菌中引入来自mycobacterium bovis的
ɑ-酮戊二酸脱羧酶基因suca、来自porphyromonas gingivalis的nadh依赖性的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbd、来自mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因car、来自bacillus subtilis的4'-磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp和来自clostridium acetobutylicum的醇脱氢酶基因adhe获得了一种重组大肠杆菌，其可高效生物转化α-酮戊二酸生产1,4丁二醇。本发明优势为反应路径清晰，副产物少，只含有少量4-羟基丁酸和4-羟基丁醛的积累。
8.在本发明的一种实施方式中，所述
ɑ-酮戊二酸脱羧酶基因suca的核苷酸序列如no.1所示，所述nadh依赖性的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbd的核苷酸序列如no.2所示，所述羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如no.3所示，所述4'-磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp的核苷酸序列如no.4所示，所述醇脱氢酶基因adhe的核苷酸序列如no.5所示。
9.本发明还提供一种制备所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
10.(1)将基因以adhe和suca的顺序与质粒ptrchisa连接，构建重组质粒ptrchisa-adhe-suca；
11.(2)将基因以car、sfp和4hbd的顺序与质粒ptetone连接，构建重组质粒ptet-car-sfp-4hbd；
12.(3)将步骤(1)构建的重组质粒ptrchisa-adhe-suca及步骤(2)构建的重组质粒ptet-car-sfp-4hbd转化入大肠杆菌jm109的感受态中，获得重组大肠杆菌。
13.本发明还提供一种制备生产1,4-丁二醇的细胞催化剂的方法，将所述重组大肠杆菌发酵，收集菌体细胞。
14.在本发明的一种实施方式中，所述发酵为将所述重组大肠杆菌于37℃，转速200rpm，lb培养基中培养6～8h，然后转接到tb培养基，2h后诱导培养14～16h，4℃收集菌体。
15.本发明还提供一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法，将所述重组大肠杆菌加入含有
ɑ-酮戊二酸的催化体系中进行反应，催化体系包括：浓度为0.025m～0.05m、ph值为7.2～7.4的pbs缓冲液，1mm～2mm金属离子mg
2+
、浓度为20～21.8g/l的
ɑ-酮戊二酸，所述重组大肠杆菌细胞悬液的od
600
为20-60；
16.在本发明的一种实施方式中，所述催化体系包括：浓度为0.01m、ph值为7.2～7.4的pbs缓冲液，浓度为20g/l的
ɑ-酮戊二酸，所述重组大肠杆菌细胞悬液的od
600
为30。
17.在本发明的一种实施方式中，所述催化体系的反应条件为：30
±
1℃，190-210rpm，反应时间为24h。
18.本发明还提供一种上述重组微生物、其制备方法、制备生产1,4-丁二醇的细胞催化剂的方法以及全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法的如下任一种应用：
19.(1)在发酵生产1,4-丁二醇中的应用；
20.(2)在提高生物法合成1,4-丁二醇的能力中的应用。
21.有益效果：
22.本发明中提供了一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法，其能够利用
ɑ-酮戊二酸在温和条件下转化生产1,4-丁二醇。该反应时间较直接发酵更短，且中间操作较少，产量更高，以
ɑ-酮戊二酸为底物，加入重组大肠杆菌，在30℃进行全细胞催化，消耗20g/l的
ɑ-酮戊二酸，可产生7.2g/l的丁二醇，摩尔转化率达59％，仅积累2.3g/l的4-羟基丁酸，3.0g/l的4-羟基丁醛。
附图说明
23.图1：产物1,4-丁二醇液相图；
24.图2：全细胞催化生产1,4-丁二醇的产量；
25.图3：全细胞催化底物浓度优化；
26.图4：全细胞催化温度优化；
27.图5：全细胞催化初始od
600
值优化。
具体实施方式
28.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.实施例1重组大肠杆菌的构建
30.大肠杆菌本身无法直接利用
ɑ-酮戊二酸合成1,4-丁二醇，为此在大肠杆菌中引入来自引入来自mycobacterium bovis的
ɑ-酮戊二酸脱羧酶基因suca、来自porphyromonas gingivalis的nadh依赖性的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbd、来自mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因car、来自bacillus subtilis的4'-磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp和来自clostridium acetobutylicum的醇脱氢酶基因adhe，构建能利用
ɑ-酮戊二酸转化生产1,4-丁二醇的大肠杆菌重组菌株a01。
31.1、重组质粒ptrchisa-adhe-suca的构建
32.(1)以suca u和suca d为引物，以人工合成密码子优化后的suca基因(核酸序列如no.1所示)为模板，扩增获得带酶切位点的suca片段。
33.sucau：ataaggatcgatggggatccatgtataggaaatttagagatgacccctcatcc；
34.suca d：ttctcctctttaatgagctcttagccgaacgcctcgtcca；
35.(2)以adhe u和adhe d为引物，以人工合成密码子优化后的adhe基因(核酸序列如no.5所示)为模板，扩增获得带酶切位点的adhe片段。
36.adhe u：agctcattaaagaggagaaaatgaaagtaacaaatcaaaaagaactaaagcaaaaatt g；
37.adhe d：taccagctgcagatctcgagttaaaagctcttaatatagatgtctttcagctcgct；
38.(3)用ecorⅰ和hindⅲ酶切质粒ptrchisa。
39.(4)将步骤(1)和步骤(2)所得基因片段suca和adhe,以adhe-suca-u,adhe-suca-d为引物进行融合pcr连接，获得adhe-suca片段。
40.adhe-suca-u:
41.ctcgagattaaagaggagaaaatgtataggaaatttagagatgacccctcatcc；
42.adhe-suca-d:
43.tacattttctcctctttaatctcgagttaaaagctcttaatatagatgtctttcagc；
44.(5)将步骤(3)所得酶切质粒与步骤(4)所得基因片段adhe-suca，以ptrc-adhe-suca反p d和ptrc-adhe-suca反p u为引物进行pcr连接，获得重组质粒ptrchisa-adhe-suca。
45.ptrc-adhe-suca反p u:gaattcgaagcttggctgtt
46.ptrc-adhe-suca反p d:ttcattttctcctctttctcggatccccatcgatcctt
47.2、重组质粒ptet-car-sfp-4hbd的构建
48.(1)以car u和car d为引物，以人工合成密码子优化后的car基因(核酸序列如no.3所示)为模板扩增得到带酶切位点的car片段。
49.car u：aagaattcaaagaggagaaaatgtcacccataacaagagaagagagg；
50.car d：ttctcctctttaatgtcgacttacaacaggcctaaaagacgtagatcg；
51.(2)以sfp u和sfp d为引物，以人工合成密码子优化后的sfp基因(核酸序列如no.4所示)为模板扩增获得带酶切位点的sfp片段。
52.sfp u：tcgacattaaagaggagaaaatgaagatttacgggatttacatggacc；
53.sfp d：attttcccctctttaagcttttaaagcaactcctcgtaagaaaccatg；
54.(3)以4hbd u和4hbd d为引物，以人工合成密码子优化后的4hbd基因(核酸序列如no.2所示)为模板扩增获得带酶切位点的4hbd片段。
55.4hbd u：
56.aaaagcttaaagaggggaaaatgcaattatttaaactaaagtcagtaacacaccac；
57.4hbd d：
58.cctggagatccttactcgagttaatacagacgtctgtagatgccctcg
59.(4)用ecorⅰ和hindⅲ酶切质粒ptet-one。
60.(5)将步骤(1)、(2)、(3)所得基因片段car、sfp和4hbd以car d1,sfp u1,sfp d1和4hbd u1为引物融合pcr连接，获得car-sfp-4hbd片段。
61.car d1:ttctcctctttaatgtcgacttacaacaggcctaaaagacgtagatcg；
62.sfp u1:tcgacattaaagaggagaaaatgaagatttacgggatttacatggacc；
63.sfp d1:attttcccctctttaagcttttaaagcaactcctcgtaagaaaccatg；
64.4hbd u1：aaaagcttaaagaggggaaaatgcaattatttaaactaaagtcagtaacacaccac
65.(6)将步骤(4)所得酶切质粒与步骤(5)所得基因片段car-sfp-4hbd以ptet-car-sfp-4hbd反p d和ptet-car-sfp-4hbd反p d反p u为引物进行pcr连接，获得重组质粒ptet-car-sfp-4hbd。
66.ptet-car-sfp-4hbd反p u:ctcgagtaaggatctccaggcatc；
67.ptet-car-sfp-4hbd反p d:tttctcctctttgaattcttttctctatcactgatagggagt；
68.3、重组菌株的构建
69.将重组质粒ptrchisa-adhe-suca及ptet-car-sfp-4hbd转化入大肠杆菌jm109的感受态中，在包含100mg/l氨苄霉素，33mg/l氯霉素的lb平板上获得正确的重组菌株，命名为a01。
70.实施例2全细胞催化合成1,4-丁二醇
71.将重组大肠杆菌a01在装有50ml lb的250ml摇瓶中进行培养，培养温度为37℃，转速200rpm，生长完成之后转接到50ml的tb培养基中，在两小时后当od
600
达到0.6～0.8时，加入0.5mm iptg诱导培养16h，4℃离心收集菌体。
72.构建全细胞催化体系(以终浓度计)：初始od
600
为30的重组大肠杆菌a01，含有1.0mm mn
2+
、1.0mm mg
2+
、3.0mm nadh、3.0mm atp和6.0mm nadph的pbs缓冲液，20g/l
ɑ-酮戊二酸，ph调整至7.3，在30℃下进行全细胞催化。
73.转化结束后，在4℃，8000r/min的条件下离心10min，收集上清液，利用高效液相色谱检测
ɑ-酮戊二酸转化情况，检测条件：aminex hpx-87h柱子，流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温35℃，进样量10μl。根据标准曲线计算即得各组分实际浓度。结果发现a01菌株24h可以消耗20g/l
ɑ-酮戊二酸，生产1,4-丁二醇的浓度为6.3g/l，摩尔转化率(1,4-丁二醇生成量mol/
ɑ-酮戊二酸消耗量mol)达51.5％。延长反应时间至28h可以消耗20g/l
ɑ-酮戊二酸，生产1,4-丁二醇的浓度为7.2g/l，摩尔转化率达59％，此后产量不再随时间延长而
增加，如图2所示。反应副产物少，仅积累2.3g/l的4-羟基丁酸和3.0g/l的4-羟基丁醛。
74.实施例3全细胞催化底物浓度优化
75.本实施例提供了一种全细胞催化合成1,4-丁二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2中
ɑ-酮戊二酸的浓度，使催化体系中的
ɑ-酮戊二酸浓度分别为10g/l、30g/l、40g/l，其他反应条件不变，28h后反应液中1,4-丁二醇的浓度分别为7.0g/l、6.9g/l、6.8g/l。
76.实施例4全细胞催化温度优化
77.本实施例提供了一种全细胞催化合成1,4-丁二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2中全细胞催化的温度，使催化体系中温度分别为25℃、35℃、37℃，其他反应条件不变，28h后反应液中1,4-丁二醇的浓度分别为4.5g/l、3.9g/l、5.6g/l。
78.实施例5全细胞催化初始od值优化
79.本实施例提供了一种全细胞催化合成1,4-丁二醇的方法，具体方法与实施例2相同，区别仅在于，改变实施例2中重组大肠杆菌在催化体系中的初始od值，使其初始od
600
分别为20、40、60，其他反应条件不变，28h后反应液中1,4-丁二醇的浓度分别为5.3g/l、4.8g/l、4.3g/l。
80.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，过表达
ɑ-酮戊二酸脱羧酶基因suca、nadh依赖性的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbd、羧酸还原酶基因car、4'-磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp和醇脱氢酶基因adhe。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述
ɑ-酮戊二酸脱羧酶基因suca的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述nadh依赖性的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbd的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述4'-磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述醇脱氢酶基因adhe的核苷酸序列如seq id no.5所示。3.制备权利要求1所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将基因片段adhe和suca连接至质粒ptrchisa上，构建重组质粒ptrchisa-adhe-suca；(2)将基因片段car、sfp和4hbd连接至质粒ptetone上，构建重组质粒ptet-car-sfp-4hbd；(3)将步骤(1)构建的重组质粒ptrchisa-adhe-suca及步骤(2)构建的重组质粒ptet-car-sfp-4hbd转入大肠杆菌jm109的感受态中，获得重组大肠杆菌。4.一种制备生产1,4-丁二醇的细胞催化剂的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述重组大肠杆菌发酵，收集菌体细胞。5.一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述重组大肠杆菌加入含有
ɑ-酮戊二酸的催化体系中进行反应。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述催化体系包括：浓度为0.025m～0.05m、ph值为7.2～7.4的pbs缓冲液，1mm～2mm金属离子mg
2+
。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述α-酮戊二酸的浓度为20～21.8g/l。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌的od
600
为20～60。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应的条件为：29～31℃，190-210rpm，至少反应24h。10.权利要求1或2所述重组大肠杆菌，权利要求3所述方法，或权利要求4所述方法，或权利要求5-9任一所述方法在生产1,4-丁二醇及提高生物法合成1,4-丁二醇的能力中的应用。

技术总结
本发明公开了一种全细胞催化生产1,4-丁二醇的方法及其应用，属于生物化工技术领域。本发明以大肠杆菌为出发菌株，通过过表达五个外源基因：


技术研发人员：刘立明 倪平 高聪 刘佳 陈修来 宋伟 魏婉清 吴静
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/7/22