一种花粉类多糖的酶解提取方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花粉类多糖的酶解提取方法。


背景技术：

2.花粉是植物雄性配子体，存在于雄性花粉囊内，不仅具有低脂肪、高蛋白的特点，而且含有人体生存所需的多种营养物质，素有“微型营养库”之称，在国际上被誉为“完全营养品”。
3.油菜花属于花卉类蔬菜，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、碳水化合物、氨基酸和钙、铁、锌和硒等微量元素等。其中，油菜花粉中的多糖具有独特的抗氧化作用，油菜花粉多糖在硫酸酯化修饰，或者羧甲基化修饰情况下，可以提高油菜花粉的抗氧化性。另外，花粉多糖有很强的免疫能力，具有明显的防癌功效。
4.王芙蓉等采用果胶酶酶和纤维素酶进行酶解，再用超声波破碎仪在条件下处理，破壁率最终可达约以上90％以上，按最佳条件分别对破壁与未破壁花粉进行提取，多糖得率分别为1.631％和1.256％(王芙蓉.油菜花粉的破壁方法及其多糖、黄酮提取纯化工艺研究[d].华中农业大学,200706)。现有技术中，油菜花粉多糖结构复杂，种类繁多，采用常规提取方法使得植物多糖的提取率偏低。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种花粉类多糖的酶解提取方法，通过调整酶的种类及用量，筛取花粉的筛子目数，将花粉类多糖的提取率可达到5.189％。
[0006]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种酶解提取花粉类多糖的方法，将花粉粉碎后过目数＞45目的孔筛，依次进行第一超声、酶解和第二超声，超声液中含花粉类多糖；
[0008]
所述酶包括果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶中的一种或几种。
[0009]
优选的，采用复合酶时，所述复合酶包括复合酶1或复合酶2；其中，所述复合酶1包括果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素；所述复合酶2包括果胶酶和纤维素酶。
[0010]
优选的，所述复合酶1中，果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素的质量比为1:1:1:1～2；所述复合酶2中果胶酶和纤维素酶的质量比为1:1。
[0011]
优选的，所述酶解时酶的添加量为花粉用量质量的1％～15％。
[0012]
优选的，所述酶解的温度为35℃～45℃，所述酶解的时间为4h～6h。
[0013]
优选的，所述第一超声前，包括花粉溶解，花粉和水的料液质量比为1:8～10。
[0014]
优选的，所述酶解前，包括调节溶液的ph至6.4～6.8。
[0015]
优选的，所述第一超声和第二超声的温度独立为80℃～90℃，超声功率独立为40khz；所述第一超声的时间为80min～100min，所述第二超声的时间为20min～40min。
[0016]
优选的，所述过筛目数为45目～65目。
[0017]
优选的，花粉类多糖包括油菜花多糖。
[0018]
有益效果：
[0019]
本发明提供了一种花粉类多糖的酶解提取方法，通过限定筛取花粉的目数提高溶解效果，通过生物酶对花粉进行破壁处理，通过超声进行多糖提取，将花粉类多糖的提取率提高到了5.189％。
[0020]
通过提高花粉类多糖的提取率，扩大花粉类多糖的应用，为研发花粉研发相关的健康产品服务。
附图说明
[0021]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]
图1为添加浓度为1％和10％β-甘露聚糖酶的酶解效果对比图；
[0023]
图2为添加浓度均为10％复合酶1和复合酶2的酶解效果对比图；
[0024]
图3为葡萄糖标准曲线图。
具体实施方式
[0025]
本发明提供了一种酶解提取花粉类多糖的方法，将花粉粉碎后过目数＞45目的孔筛，依次进行第一超声、酶解和第二超声，超声液中含花粉类多糖；
[0026]
所述酶包括果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶和β-甘露聚糖酶中的一种或几种。
[0027]
本发明将花粉粉碎后过筛，所述过筛目数优选为45目～65目，进一步优选为60目～65目、更优选为65目。本发明通过限定筛选花粉的筛网的目数，将筛下花粉用于超声酶解可提高酶解的效果。
[0028]
本发明优选将过筛后的花粉加水溶解，得到花粉溶液。在本发明中，所述花粉和水的料液质量比优选为1:8～10，进一步优选为1:8。本发明对所述水的来源没有特殊限定。
[0029]
本发明优选采用可食酸调节花粉溶液的ph至6.4～6.8，进一步优选为6.4～6.6，更优选为6.5。本发明对可食酸的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明采用的可食酸，优选为醋酸、柠檬酸等。
[0030]
本发明在调节ph值后将花粉溶液进行第一超声，超声的温度优选为80℃～90℃，进一步优选为85℃，超声功率优选为40khz，超声的时间优选为80min～100min，进一步优选为90min。本发明采用常规超声手段即可。本发明在酶解前进行第一超声，使花粉充分溶于水中，增大溶解率。
[0031]
本发明在超声浸提后的花粉溶液中添加酶进行酶解，添加量优选为花粉用量质量的1％～15％，进一步优选为1％、10％和15％。本发明采用的酶购自索莱宝等生物公司，采用低温速递，实验室用5℃低温储藏，以保持酶的最佳酶活力。本发明所述半纤维素酶的酶活优选为1.5unit/mg solid，所述纤维素酶的酶活优选为3unit/mg solid，所述果胶酶的酶活优选为40u/mg，所述β-甘露聚糖酶的酶活优选为8万/g。花粉壁主要成分为纤维素、果胶、半纤维素、蛋白质等，通过生物酶对花粉进行破壁处理，酶解的同时还可将破壁体系中
的多糖以外的某些成分进一步转化成多糖，进而提高花粉类多糖提取率。
[0032]
本发明采用复合酶时，优选为包括复合酶1或复合酶2；其中，所述复合酶1优选为包括果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素；所述复合酶2包括果胶酶和纤维素酶。本发明所述复合酶采用上述市售单酶进行复配制得。
[0033]
本发明采用复合酶时，所述复合酶1中，果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素的质量比为1:1:1:1～2；所述复合酶2中果胶酶和纤维素酶的质量比为1；1。
[0034]
本发明酶解时，所述酶解的温度优选为35℃～45℃，进一步优选为37℃～42℃，更优选为40℃；所述酶解的时间优选为4h～6h，进一步优选为5h。
[0035]
本发明在酶解后进行第二超声，超声的温度优选为80℃～90℃，进一步优选为85℃，超声功率优选为40khz，超声的时间优选为20min～40min，进一步优选为30min。本发明采用常规超声手段即可。本发明在酶解后进行第二超声，进一步提高花粉类多糖的提取率。
[0036]
本发明制备得到的花粉类多糖，优选为油菜花多糖。
[0037]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种酶解提取花粉类多糖的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0038]
实施例1
[0039]
将干燥的油菜花粉粉碎，过筛65目，取5g油菜花粉，料液质量比1:8加入蒸馏水溶解，用醋酸调节ph至6.5左右；于温度85℃，功率40khz，超声溶解浸提90min。加入花粉用量质量1％，酶活为1.5unit/mg solid的半纤维素酶处理，在40℃恒温水浴条件下酶解5h，取出。85℃，40khz超声溶解混匀，超声30min。在10000r/min条件下，离心15min，取上清液，滤纸抽滤，即得酶处理后的样品。
[0040]
将上述酶处理后的样品，在60℃加热板上浓缩至10ml左右，加入4倍体积的无水乙醇5℃低温下过夜沉淀，转速为5000r/min，离心10min，所得沉淀于干燥烘箱中60℃，风速1.2m/s，烘干至恒重，即为油菜花粉粗多糖。
[0041]
实施例2
[0042]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为1％，酶活为3unit/mg solid的纤维素酶。
[0043]
实施例3
[0044]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为1％，酶活为8万/g的β-甘露聚糖酶。
[0045]
实施例4
[0046]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为10％，酶活为8万/g的β-甘露聚糖酶。
[0047]
图1左为1％β-甘露聚糖酶的酶解效果，右为10％β-甘露聚糖酶的酶解效果。视觉上，明显看出酶解的量有所不同，酶解后1％β-甘露聚糖酶的提取液较多，酶解效果更佳。
[0048]
实施例5
[0049]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为10％，酶活为1.5unit/mg solid的半纤维素酶。
[0050]
实施例6
[0051]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为10％，酶活为为3unit/mg solid的
纤维素酶。
[0052]
实施例7
[0053]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为15％，酶活为1.5unit/mg solid的半纤维素酶。
[0054]
实施例8
[0055]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为15％，酶活为3unit/mg solid的纤维素酶。
[0056]
实施例9
[0057]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为15％，酶活为8万/g的β-甘露聚糖酶。
[0058]
实施例10
[0059]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为10％的复合酶1，由酶活为40u/mg的果胶酶、酶活为3unit/mg solid纤维素酶、酶活为8万/gβ-甘露聚糖酶和酶活为1.5unit/mg solid的半纤维素按质量比为1:1:1:2组成。
[0060]
实施例11
[0061]
按照实施例1的方式进行，区别在于将酶调整为10％的复合酶2，由酶活为40u/mg的果胶酶和酶活为3unit/mg solid的纤维素酶按质量比为1:1组成。
[0062]
图2左为10％复合酶1的酶解效果，右为10％复合酶2的酶解效果。视觉上，明显看出酶解的量有所不同。
[0063]
实施例12
[0064]
按照实施例3的方式进行，区别在于将过筛目数调整为45目。
[0065]
实施例13
[0066]
按照实施例3的方式进行，区别在于将过筛目数调整为60目。
[0067]
实施例14
[0068]
按照实施例4的方式进行，区别在于将过筛目数调整为45目。
[0069]
实施例15
[0070]
按照实施例4的方式进行，区别在于将过筛目数调整为60目。
[0071]
对比例1
[0072]
按照实施例1的方式进行，区别在舍去酶处理。
[0073]
实施例16
[0074]
将实施例得到的油菜花多糖，加10ml蒸馏水溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤，取过滤后的1ml溶液于50ml容量瓶中，定容，取2ml于干燥的烧杯中，加入5％的苯酚1.0ml，迅速滴加浓硫酸5.0ml，室温放置20min后测定吸光度。每个试验重复了两次，求平均值。根据吸光度和标准曲线计算提取粗多糖的提取率。
[0075]
称取0.1103g的无水葡萄糖于50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，制成葡萄糖标准溶液。
[0076]
分别吸取葡萄糖标准溶液0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml。加入浓度为5％苯酚1.0ml，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀振荡均匀后于室温放置20min，在487nm处测定吸光度。以2.0ml蒸馏水按同样显色操作作为空白，横坐标为标准葡
萄糖体积数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线(如图3)。
[0077]
本发明所述实施例1油菜花多糖的吸光度值为0.5664，提取率为3.318％，实施例2吸光度值为0.8834，提取率为4.273％，实施例3吸光度值为0.482，提取率为3.063％，实施例4吸光度值为0.8396，提取率为4.141％，实施例5吸光度值为0.6058，提取率为3.436％，实施例6吸光度值为0.8573，提取率为3.677％，实施例7吸光度值为0.5904，提取率为3.390％，实施例8吸光度值为1.1876，提取率为5.189％，实施例9吸光度值为0.7364，提取率为3.830％，实施例10吸光度值为0.5174，提取率为3.17％，实施例11吸光度值为0.5241，提取率为3.19％，实施例12吸光度值为0.3814，提取率为2.76％，实施例13吸光度值为0.395，提取率为2.80％，实施例14吸光度值为0.3216，提取率为2.58％，实施例15吸光度值为0.454，提取率为2.98％。
[0078]
其中，对比例1不做酶处理的吸光度值为0.056，提取率1.78％，实施例的油菜花多糖的提取率较对比例1提高了至少一倍，且实施例8提取率最高，可达到5.189％。
[0079]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种酶解提取花粉类多糖的方法，其特征在于，将花粉粉碎后过目数＞45目的孔筛，依次进行第一超声、酶解和第二超声，超声液中含花粉类多糖；所述酶包括果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶和β-甘露聚糖酶中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用复合酶时，所述复合酶包括复合酶1或复合酶2；其中，所述复合酶1包括果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素；所述复合酶2包括果胶酶和纤维素酶。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复合酶1中，果胶酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半纤维素的质量比为1:1:1:1～2；所述复合酶2中果胶酶和纤维素酶的质量比为1:1。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解时酶的添加量为花粉用量质量的1％～15％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为35℃～45℃，所述酶解的时间为4h～6h。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一超声前，包括花粉溶解，花粉和水的料液质量比为1:8～10。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶解前，包括调节溶液的ph至6.4～6.8。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一超声和第二超声的温度独立为80℃～90℃，超声功率独立为40khz；所述第一超声的时间为80min～100min，所述第二超声的时间为20min～40min。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过筛目数为45目～65目。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉类多糖包括油菜花多糖。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶解提取花粉类多糖的方法。本发明将花粉粉碎后过目数＞45目的孔筛，依次进行第一超声、酶解和第二次超声，超声液中含花粉类多糖；所述酶包括果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶和β-甘露聚糖酶中的一种或几种。通过筛取花粉的目数提高溶解效果，通过生物酶对花粉进行破壁处理，将花粉类多糖的提取率提高到了5.189％。花粉类多糖的提取率提高到了5.189％。花粉类多糖的提取率提高到了5.189％。


技术研发人员：成鑫垚 侯凯 李小柱 陈棋 丁琳 吴卫
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/7/22