一种基于基因沉默技术矮化芍药的方法

1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于基因沉默技术矮化芍药的方法。


背景技术：

2.芍药为芍药科芍药属多年生草本花卉，在我国具有悠久的栽培历史，是我国传统名花之一，适合庭院观赏，同时也是花卉市场重要的切花。中国芍药品种多数存在茎秆细软、垂头甚至倒伏等现象，严重影响了芍药的观赏价值和市场价值。另一方面，随着花卉产业的发展，小型化的花卉盆栽已成为花卉产业的发展趋势之一，而株高是限制盆栽芍药发展的一个重要因素。因此培育低矮的观赏芍药品种具有良好的市场前景。
3.赤霉素(gibberellin，ga)作为植物生长发育中一类重要的植物激素，通过使细胞快速生长以促进植物的茎秆伸长生长，参与调节细胞壁重塑过程，对植物株高的形成具有重要的调控作用。目前对于赤霉素的合成通路已经十分明晰(hedden,p.,proebsting,w.m.(1999)genetic analysis of gibberellin biosynthesis.plant physiol.119:365-370)，其中赤霉素合成的关键酶基因的功能一直是植物研究的热点之一。在小麦、水稻、豌豆等作物中已经分离得到了编码赤霉素合成酶的基因，获得了大量与赤霉素合成酶基因相关的突变体，均造成了矮化或半矮化的性状突变。对芍药进行赤霉素抑制剂处理会造成芍药明显矮化的表型。因此，沉默芍药赤霉素合成酶基因对芍药进行株型调控，具有一定的理论基础。
4.由病毒诱导的基因沉默技术(vigs)是利用在植物体内发生的病毒免疫应答与rna干扰的相互作用机制，从而在植物体内发生转录后的基因沉默。由烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)诱导的基因沉默，以其沉默效率高、持续时间长、操作简便等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。在观赏植物的基因功能验证方面，vigs技术在快速鉴定观赏植物基因功能方面也有较为广泛的应用，主要涉及观赏植物衰老、代谢、叶色、花形态发育、花色、抗病、抗逆方面的遗传改良，但在观赏植物株型调控方面的研究报道较少，仅有在菊花中沉默dmga20ox(ga20 oxidase)基因获得了矮小的菊花品种(xie,ql,et al.dual silencing of dmcpd and dmga20ox genes generates a novel miniature and delayed-flowering dendranthema morifolium variety[j].mol breeding,2015,2015,35)；在紫薇茎段中沉默生长素早期响应基因lfiaux22，沉默株系节间长度显著缩短(梁晓涵.紫薇株高相关saurs、aux/iaas基因的克隆与功能分析[d].北京林业大学,2020)。
[0005]
芍药作为一种多年生宿根花卉，具有较高的观赏价值和经济价值，但因其遗传转化体系尚不成熟，芍药的基因功能验证工作依赖模式植物验证，开发芍药的分子辅助育种对快速鉴定芍药基因功能具有重要意义，而目前公布的vigs介导的基因沉默方法不足以在芍药的株型调控中进行应用。利用本发明所述的方法可获得一种由烟草脆裂病毒trv病毒介导的高效的芍药内源基因沉默体系，并将该技术应用于芍药的株型调控中。


技术实现要素：

[0006]
针对现有存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种在芍药上有效的基因沉默以达到矮化的目的，主要解决芍药上基因功能验证困难的技术问题。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
1)克隆得到芍药赤霉素合成酶基因plkao
[0009]
克隆得到芍药plkao基因全长，该片段核苷酸序列如seq id no:1所示；
[0010]
2)构建烟草脆裂病毒trv重组质粒
[0011]
基于同源重组原理，在芍药plkao基因非保守域片段如seq id no:2，设计同源重组引物，将外源基因片段插入到trv2质粒的ecor1和xho1位点之间中，得到重组质粒plkao/trv2。
[0012]
3)重组质粒的测序鉴定
[0013]
trv2载体的多克隆位点附近设计引物，正向引物trv2-f(序列如seq idno:7所示)和反向引物trv2-r(序列如seq id no:8)；
[0014]
4)质粒转化农杆菌
[0015]
将上述植物重组表达载体plkao/trv2热激转化农杆菌感受态eha105，获得转基因菌株；
[0016]
5)农杆菌培养及重悬
[0017]
挑取鉴定后的阳性克隆，在lb液体抗性培养基中进行摇菌培养，后用重悬液进行重悬后，黑暗静置。
[0018]
6)芍药带芽块根负压真空侵染，
[0019]
将已打破休眠的芍药块根的芽浸没到步骤5)中的农杆菌液中，进行负压真空侵染；
[0020]
7)侵染后的芍药幼苗重新上盆进行培养
[0021]
将侵染后的芍药块根转移至培养基质中，放入温室进行上盆培养。
[0022]
8)侵染后的阳性植株鉴定，
[0023]
在trv2载体上的coat protein蛋白两侧设计引物，正向引物cp-f(序列如seq id no:9所示)和反向引物cp-r(序列如seq id no:10所示)，以trv1/trv2空载体侵染的芍药叶片为对照组，检测转基因芍药叶片中coat protein的表达情况。
[0024]
9)转化芍药表型的观察
[0025]
上盆培养30天后，对芍药植株的株高表型进行观察统计。
[0026]
本发明提供了完整、高效的基于基因沉默技术矮化芍药的具体流程，利用该方法能获得矮化芍药植株，为芍药盆花的培育及开发利用提供了一种新方法。
[0027]
相比现有技术，本发明具有如下优点：
[0028]
1、本发明对芍药进行基因沉默，能够精准对芍药性状进行遗传改良，方法简单易行，处理时间短，与现有矮化芍药的方法相比，对植物自身和土壤环境的潜在威胁大大降低，因此分子辅助育种是一种环保、高效、具有良好应用前景的调控观赏植物株型的方法。
[0029]
2、本发明首次以芍药块根作为基因沉默的材料，盆栽后成功的获得了基因沉默的芍药植株。本发明不需要组培及无菌的操作环境，成本低，直接获得基因沉默的芍药植株，有效解决了芍药无成熟遗传转化体系，难以在芍药植株上进行基因功能验证的难题，可以
作为芍药基因功能验证的一种重要手段，应用前景十分可观。
附图说明
[0030]
序列表seq id no:1为芍药plkao基因全长序列。
[0031]
序列表seq id no:2是芍药plkao基因一段非保守域序列。
[0032]
序列表seq id no:3是正向引物plkao-f。
[0033]
序列表seq id no:4是反向引物plkao-r。
[0034]
序列表seq id no:5是正向引物plkao-ecor1-f。
[0035]
序列表seq id no:6是反向引物plkao-xho1-r。
[0036]
序列表seq id no:7是正向引物trv2-f。
[0037]
序列表seq id no:8是反向引物trv2-r。
[0038]
序列表seq id no:9是正向引物cp-f。
[0039]
序列表seq id no:10是反向引物cp-r。
[0040]
图1：上盆栽培30天后对照组和沉默组的芍药植株。
[0041]
图2：半定量检测病毒载体中coat protein的积累情况。
[0042]
图3：定量检测侵染后芍药植株中plkao基因的表达水平。
[0043]
图4：上盆栽培30天后对照组和沉默组的芍药植株株高统计。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步详细说明。以下附图用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。以下实施例中试剂和方法若无特别说明均按照常规方法配制和操作。
[0045]
供试材料均种植于北林科技玻璃温室(北京，海淀区)。芍药植株均生长强壮、生长势基本一致，无病虫害植株。
[0046]
芍药基因沉默方法(农杆菌侵染法)：
[0047]
于3月份挖出芍药带芽块根植株，浸泡在携带重组trv病毒的农杆菌液中，进行负压真空抽提30min，然后上盆培养30天，进行阳性植株鉴定及芍药植株的表型观察统计。
[0048]
1)克隆得到plkao基因片段
[0049]
以芍药cdna为模板，以正向引物plkao-f(序列如seq id no:3所示)，反向引物plkao-r(序列如seq id no:4)所示为引物，扩增得到芍药赤霉素合成关键酶基因ent-kaurenoic acid oxidase(plkao)上200bp～350bp的保守基因片段，该片段的核苷酸序列信息如seq id no:1所示，将所得的plkao片段连接到pmd18-t载体上，得到重组质粒plkao/pmd18-t。
[0050]
2)构建烟草脆裂病毒trv重组质粒
[0051]
克隆含有同源臂的plkao片段，模板为重组质粒plkao/pmd18-t，引物序列为正向引物plkao-ecor1-f(序列如seq id no:5所示)和反向引物plkao-xho1-r(序列如seq id no:6所示)，以同源重组的方式插入到烟草脆裂病毒trv2(包含多克隆位点mcs和衣壳蛋白基因coat protein)的ecor1和xho1位点之间中，得到重组质粒plkao/trv2；
[0052]
3)重组质粒的测序鉴定
[0053]
将病毒空载trv1(辅助病毒载体)、空载trv2和重组质粒plkao/trv2分别转化大肠杆菌感受态dh5α，700ul无抗lb液体培养基中37℃震荡培养1h后涂布到含抗lb固体培养基(50mg/l氨苄青霉素)，在37℃培养箱中倒置过夜培养。
[0054]
挑取单菌落，于含抗液体培养基(50mg/l氨苄青霉素)中过夜震荡培养(培养温度37℃，摇床转速200rpm)，用于pcr鉴定和测序鉴定。以重组质粒plkao/trv2的大肠菌液为模板，trv2-f(序列如seq id no:7所示)和trv2-r(序列如seq id no:8所示)为引物，进行pcr扩增。将pcr结果条带正确的菌液送去公司测序，与seq id no:1序列进行比对，确定比对一致的阳性克隆菌液，进行过夜摇菌并保菌。
[0055]
4)质粒转化农杆菌
[0056]
将病毒空载trv1(辅助病毒载体)、空载trv2和重组质粒plkao/trv2分别转化农杆菌感受态eha105，700ul无抗lb液体培养基中28℃震荡培养1h后涂布到含抗lb固体培养基(50mg/l卡那霉素+25mg/l利福平)，在28℃培养箱中倒置培养2d。挑取单克隆菌落，放入1ml含抗lb液体培养基(50mg/l卡那霉素+25mg/l利福平)在28℃，200rpm摇床进行过夜摇菌。以重组质粒plkao/trv2的农杆菌菌液为模板，trv2-f(序列如seq id no:7所示)和trv2-r(序列如seq id no:8所示)为引物，以进行pcr扩增。将条带大小正确的菌液，转入500ml的含抗lb液体培养基再次过夜培养12h(28℃，200rpm)。
[0057]
5)农杆菌培养及重悬
[0058]
将空载trv1、空载trv2和重组质粒plkao/trv2的农杆菌菌液，5000rpm，20℃，离心5min弃去上清液，分别经侵染重悬液(1mm 2-吗啉乙磺酸mes+1mm氯化镁mgcl2+0.2mm乙酰丁香酮as)重悬，调节重悬液od值为od
600
＝0.8后。分别将trv1和trv2-plkao、trv2重悬液1:1混合，黑暗静置3h用于侵染。
[0059]
6)芍药带芽块根负压真空侵染
[0060]
当年3月挖取尚未出土的芍药块根，其上的饱满芽已伸长，用水冲洗芍药带芽块根后，用5ml注射器避开芽内生长点，刺穿健壮的芍药芽后整株浸没在混合重悬液中，进行负压真空侵染。压力约80kpa，保压15min后缓慢放气15min。
[0061]
7)侵染后的芍药幼苗重新上盆进行培养
[0062]
种植于营养基质中(草炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:1)，于玻璃温室中培养，每周浇一次水肥，30天后观察表型。
[0063]
8)侵染后的阳性植株鉴定
[0064]
以未侵染农杆菌的芍药叶片和trv1/trv2空载体侵染为对照组，plkao/trv2侵染的沉默芍药株系为沉默组分别进行coat protein的表达检测。对每个芍药单株分别取叶片提取rna，以单株cdna为模板，cp-f(序列如seq id no:9所示)和cp-r(序列如seq id no:10所示)为引物，使用荧光定量的方法检测plkao基因的沉默效果。
[0065]
9)转化芍药表型的观察
[0066]
对上盆30天后的trv1/trv2空载体侵染的对照组和plkao/trv2侵染的沉默组的芍药株系分别进行株高统计，plkao/trv2沉默株系的株高与对照组相比显著降低了34.65％。
[0067]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均属于本发
明要求保护范围。
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]

技术特征：
1.一种基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)克隆得到芍药赤霉素合成酶基因plkao；2)以烟草脆裂病毒trv质粒为载体，将芍药plkao基因非保守域片段插入到trv2质粒的ecor1和xho1酶切位点之间，得到重组质粒plkao/trv2；3)在trv2载体的多克隆位点附近设计引物，鉴定重组质粒的序列；4)将重组表达载体plkao/trv2热激转化农杆菌感受态eha105，获得转基因菌株；5)挑取鉴定后的阳性克隆，在lb液体抗性培养基中进行摇菌培养，后用重悬液(1mm mes+1mm mgcl2+0.2mm as)进行重悬后测定吸光值od
600
＝0.8，trv1与trv2、plkao/trv2分别按体积比1:1混合，黑暗静置3h；6)当年3月从基地挖取未出土的芍药块根，其上所带的饱满芽已伸长，将已打破休眠的芍药块根的芽浸没到步骤5)中的农杆菌液中，进行负压真空侵染；7)将侵染后的芍药块根转移至培养基质中，放入温室进行上盆培养；8)在trv2载体上的coat protein蛋白两侧设计引物，以trv1/trv2空载体侵染的芍药叶片为对照组，检测转基因芍药叶片中报告基因coat protein的表达情况以及plkao相对表达量，来鉴定阳性植株；9)上盆培养30天后，对芍药植株的株高表型进行观察统计。2.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，步骤1)中所述的芍药赤霉素合成酶基因plkao的核苷酸序列如seq id no:1所示。3.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，步骤2)中所述的非保守域片段为如seq id no:2所示。4.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，步骤3)中所述的引物为正向引物trv2-f(序列如seq id no:7所示)和反向引物trv2-r(序列如seq id no:8所示)。5.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，步骤6)中所述的芍药块根为饱满芽已伸长但未出土的芍药块根。6.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，步骤8)中所述的引物为正向引物cp-f(序列如seq id no:9所示)和反向引物cp-r(序列如seq id no:10所示)。7.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于，如seq id no:1所示的芍药plkao片段在矮化芍药植株中的应用。8.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于：于侵染过程中抽真空，压力为80kpa，侵染时间为30min，保压15min后缓慢放气15min。9.根据权利要求1所述基于基因沉默技术矮化芍药的方法，其特征在于：阳性转化植株的鉴定，用到了报告基因coat protein的半定量鉴定，目的基因的相对表达量检测和植株株高的统计。

技术总结
本发明提供了一种基于基因沉默技术矮化芍药的方法，包括如下步骤：1)克隆得到PlKAO基因片段；2)构建烟草脆裂病毒TRV重组质粒；3)重组质粒的测序鉴定；4)质粒转化农杆菌；5)农杆菌培养及重悬；6)芍药带芽块根负压真空侵染；7)侵染后的芍药幼苗重新上盆进行培养；8)侵染后的阳性植株鉴定；9)转化芍药表型的观察。与现有矮化芍药的方法相比，对植物自身的危害和土壤环境的潜在威胁大大降低，盆栽后成功获得了基因沉默的芍药植株，达到了精准改良芍药性状的目的。侵染过程不需要无菌操作，有效解决了芍药无成熟遗传转化体系从而无法在芍药上进行基因功能验证的难题，可作为芍药基因功能验证的一种重要手段，应用前景十分可观。应用前景十分可观。应用前景十分可观。


技术研发人员：于晓南 陈曦 朱炜 曹津津 张葳 赵家庚
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2022.11.17
技术公布日：2023/7/22