锰离子作为一种FMDV感染的拮抗剂的应用

锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用
技术领域
1.本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用。


背景技术：

2.口蹄疫病毒(fmdv)是口蹄疫的病原体，可引起严重的流行病，对畜牧业造成严重威胁[1]。fmdv是小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属的一种病毒，其基因组为单股正链rna。目前已知fmdv有7种血清型(o、a、c、sat1、sat2、sat3和asia1)和多个亚型。病毒基因组长度超过8000nt，包含一个开放的阅读框，编码4个结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4)和8个非结构蛋白(nsps)(lpro、2a、2b、2c、3a、3b、3cpro和3dpol)[2]。fmdv在易感动物中迅速传播的能力使其成为世界动物卫生组织(woah)分类中一种相当严重的疾病。然而，目前使用口蹄疫疫苗诱导早期保护是有限的，因为猪的保护至少在接种后7天生效[3]。因此，有必要采用其他抗病毒药物的方法，以减少fmdv在疫情期间的传播。
[0003]
锰元素是哺乳动物组织中含量最丰富的金属之一，含量在0.3-2.9mg/kg之间，是机体发育、繁殖、神经功能、免疫调节和抗氧化防御等多种生理过程所必需的[4,5]。锰离子通过调节各种mn2+依赖酶起作用，包括氧化还原酶、异构酶、转移酶、连接酶、裂解酶和水解酶，其是超氧化物歧化酶(sod2)、谷氨酰胺合成酶(gs)和精氨酸酶等金属酶的基本成分[6]。研究发现，mn2+通过提高dna传感器cgas及其下游适配器蛋白sting的灵敏度[7]，对宿主保护免受dna病毒感染至关重要。然而，关于mn2+在rna病毒感染中的作用研究较少，其作用机制尚不清楚。
[0004]
在本研究中，我们发现mn2+在pk15细胞中能够抵抗fmdv的感染。mn2+对fmdv的抑制作用包括nf-κb的激活和干扰素刺激基因表达的上调。动物实验进一步证明，mn2+对感染fmdv的c57bl/6n小鼠具有良好的保护作用。


技术实现要素：

[0005]
(一)解决的技术问题
[0006]
针对现有技术的不足，本发明提供了锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，具备抑制fmdv感染的优点，来解决上述问题。
[0007]
(二)技术方案
[0008]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：检测锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用；其中，所述锰离子是mn2+，包括以下步骤：s1、mn2+在体外抗fmdv的活性研究；s2、mn2+在pk15细胞中通过激活nf-κb信号通路发挥抗病毒作用；s3、接种mn2+后fmdv攻毒小鼠存活率提高。
[0009]
优选的，所述s1包括：s1.1、s1.2与s1.3。
[0010]
优选的，所述s1.1为评估mn
2+
对fmdv敏感细胞的毒性，mn
2+
经连续2倍梯度稀释后，孵育pk15细胞，在培养72小时后，测量细胞活力，并与未处理的细胞对照组进行比较，得出
mn
2+
对pk15细胞的活性抑制作用呈剂量依赖效应，采用graphpad 8软件对数据进行回归分析，计算得到mn
2+
对pk15细胞的半数细胞毒性浓度(cc
50
)为438μm。
[0011]
优选的，所述s1.2为研究mn
2+
的抗病毒作用，用不同浓度的mn2+处理pk15细胞，然后感染fmdv，分析病毒滴度和拷贝数，与未处理fmdv对照组相比，mn2+在20～200μm浓度范围内具有抗病毒活性(p《0.01)，且在20～200μm浓度范围内病毒滴度和拷贝数呈剂量依赖性(p《0.01)。
[0012]
优选的，所述s1.3为探索mn
2+
对fmdv复制周期的影响，添加时间测试，mn
2+
处理后，各时间点fmdv滴度显著降低(p《0.001)，且提前1h处理组(i)、联合处理组(ii)、病毒感染后2h(iii)、4h(iv)处理组fmdv复制水平显著低于未处理组(p《0.001)，此外，mn
2+
在病毒进入前和病毒进入阶段(ii)的抗病毒效果优于复制周期早期(iii)和复制周期后期(iv)。
[0013]
优选的，所述s2：mn2+在pk15细胞中通过激活nf-κb信号通路发挥抗病毒作用，先用mn
2+
提前1h处理pk15细胞，然后用fmdv感染pk15细胞，通过western blot检测发现，mn
2+
处理的pk15细胞中p-p65和p-tbk1水平较对照组明显上调，而fmdv vp1表达明显降低，此外，我们测定了mn
2+
诱导的pk15细胞中isgs和干扰素(ifn)的表达，mn
2+
处理细胞中ifn-α、黏液病毒抗性(mx)、isg54等基因mrna水平明显高于对照组。
[0014]
优选的，所述s3：接种mn2+后fmdv攻毒小鼠存活率提高，在病毒感染小鼠前12小时静脉注射1mg/kg或2mg/kg的mn
2+
，然后用致死剂量的fmdv感染小鼠，与pbs对照组相比，这些病毒感染小鼠在mn
2+
预处理后的生存时间明显更长，在所有对照组小鼠死亡的情况下，约有一半预处理小鼠仍存活，结果表明，mn
2+
能够增强小鼠对fmdv感染的抵抗力。
[0015]
优选的，所述s3之后还包括s4：mn
2+
处理小鼠诱导细胞因子激活，在接种mn2+的小鼠中测定细胞因子水平，c57bl/6n小鼠在fmdv感染前12h静脉注射2mg/kg mn2+，pbs在fmdv感染前12h通过静脉注射接种，作为阴性对照，发现在病毒感染后24和48h小鼠血清中ifn-α、ifn-β等平显著升高。
[0016]
(三)有益效果
[0017]
与现有技术相比，本发明提供了锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，具备以下有益效果：
[0018]
发现mn2+在体外和体内都对fmdv具有抗病毒作用，mn2+对fmdv的抑制作用包括nf-κb的激活和干扰素刺激基因的上调，且动物实验表明，mn2+能够一定程度保护c57bl/6n小鼠免受fmdv感染。
附图说明
[0019]
图1为mn
2+
在pk15细胞中抑制fmdv的感染示意图，(a)pk15细胞与连续2倍梯度稀释mn
2+
孵育72h后，测定细胞活力，并与未处理的细胞对照组进行比较，(b)pk15细胞分别用0、10、20、50、100和200μm mn
2+
处理1h后，感染fmdv(moi为1)，fmdv感染12小时后收集细胞及上清液，用tcid
50
检测病毒滴度，误差条表示与平均值的标准偏差(sd)，进行t检验以确定统计学上的显著差异。*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001。****,p《0.0001。
[0020]
图2为mn
2+
处理pk细胞能够激活nf-κb信号通路示意图，用50μm mn
2+
处理pk15细胞，在fmdv感染后3、6、9h收集pk15细胞进行western blot检测。
[0021]
图3为mn2+处理pk细胞中能够上调ifn-i和isgs的表达示意图，用50μm mn2+处理
α、ifn-β等平显著升高(图5)。
[0027]
综上所述，在本发明中，我们发现mn2+在体外和体内都对fmdv具有抗病毒作用，mn2+对fmdv的抑制作用包括nf-κb的激活和干扰素刺激基因的上调，且动物实验表明，mn2+能够一定程度保护c57bl/6n小鼠免受fmdv感染。
[0028]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.检测锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用；其中，所述锰离子是mn2+，其特征在于，包括以下步骤：s1、mn2+在体外抗fmdv的活性研究；s2、mn2+在pk15细胞中通过激活nf-κb信号通路发挥抗病毒作用；s3、接种mn2+后fmdv攻毒小鼠存活率提高。2.根据权利要求1所述的锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，其特征在于，所述s1包括：s1.1、s1.2与s1.3。3.根据权利要求2所述的锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，其特征在于，s1.1为评估mn
2+
对fmdv敏感细胞的毒性。4.根据权利要求2所述的锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，其特征在于，s1.2为研究mn
2+
的抗病毒作用。5.根据权利要求2所述的锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，其特征在于，s1.3为探索mn
2+
对fmdv复制周期的影响。6.根据权利要求1所述的锰离子作为一种fmdv感染的拮抗剂的应用，其特征在于，所述s3之后还包括s4：mn
2+
处理小鼠诱导细胞因子激活。

技术总结
本发明涉及预防兽医学技术领域，具体为锰离子作为一种FMDV感染的拮抗剂的应用，本发明发现Mn2+在体外和体内都对FMDV具有抗病毒作用，Mn2+对FMDV的抑制作用包括NF-κB的激活和干扰素刺激基因的上调，且动物实验表明，Mn2+能够一定程度保护C57BL/6N小鼠免受FMDV感染，为此，我们提出锰离子作为一种FMDV感染的拮抗剂的应用，用来抑制FMDV感染。用来抑制FMDV感染。用来抑制FMDV感染。


技术研发人员：张志东 李彦敏 张志雄 赵帅阳 郭紫晶 杨洋 陈飞 柏玲
受保护的技术使用者：西南民族大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/7/22