一种酵母菌及其制备麦角硫因的应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种酵母菌及其制备麦角硫因的应用。


背景技术：

2.麦角硫因(英文：ergothioneine)是一种天然存在的氨基酸，是组氨酸的硫脲衍生物，其在咪唑环上含有一个硫原子。麦角硫因于1909年由mc tanret从黑麦麦角菌(学名：clavicepspurpurea)中分离发现，并以首次提纯它的麦角真菌命名，其结构于1911年确定。麦角硫因是一种易溶于水的水溶性物质，具有优良的热稳定性和ph稳定性。麦角硫因还是一种具有很强抗氧化活性的天然物质，具有几乎不受酸性(ph 2)至碱性(ph 12)条件影响的特性。在人类中，麦角硫因完全通过饮食获得，并在红细胞、骨髓、肝脏、肾脏、精液和眼睛中积累。
3.担子菌如蘑菇和一些细菌可以生物合成麦角硫因。蘑菇是富含麦角硫因的食物。麦角硫因在平菇中含量特别丰富。放线菌(例如耻垢分枝杆菌)和某些真菌(例如粗糙脉孢菌)也能生物合成麦角硫因。麦角硫因的代谢途径始于组氨酸的甲基化以产生组氨酸甜菜碱(海西宁)，然后从半胱氨酸中引入硫原子得到麦角硫因。其他种类的细菌，如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌和链球菌，以及酵母菌中的真菌不能生物合成麦角硫因。
4.目前，麦角硫因的制备方法有三种：化学合成法、提取法以及生物发酵合成法。在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，其难点是原料2-巯基咪唑的制备，并且α-碳的酸性会使反应很容易发生局部或者全部外消旋化。由于原料昂贵、合成成本高，导致产品的售价高，以至于限制了麦角硫因的应用。天然生物提取法是从食用菌的子实体、猪血、动物组织、麦角和谷物中提取麦角硫因，但上述原料中麦角硫因的含量很低，且存在原料的杂质多、药物残留、提取成本高等问题，不利于麦角硫因的产业化。以蕈菌菌丝体深层发酵技术生物制备麦角硫因，是低成本规模化生产麦角硫因的主流方向，可以通过代谢调控等发酵过程控制手段，有效地提高麦角硫因的产率，降低生产成本，更重要的是，可以保证产品的安全性，拓宽麦角硫因的应用空间。但是，以蕈菌菌丝体深层发酵技术生产麦角硫因，发酵周期长且最高产量仅达到135.7mg/l(姜文侠，刘琦，周涛.生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法[p].cn201210392417.8)。迄今为止，大规模生物合成天然麦角硫因仍然不能在工业中实现。
[0005]
因此，仍亟需一种成本低，产量高，发酵周期短的天然麦角硫因的制备方法。


技术实现要素：

[0006]
发明概述
[0007]
为解决上述问题，本技术提供一种酵母菌及其应用。
[0008]
第一方面，本技术提供一种酵母菌，所述酵母菌为经过传统诱变和筛选所得，其保藏编号为cctcc no：m 20211505；所述酵母菌株已经于2021年11月29日在中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国武汉武汉大学) 进行了生物保藏，分类命名为粟酒裂殖酵母
(schizosaccharomycespombe omk-79)。所述酵母菌具有均可用于制备麦角硫因，具有产率高，成本低，制备速度快等优点。
[0009]
第二方面，本技术提供一种麦角硫因的制备方法。所述麦角硫因的制备方法包括：将前述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。前述酵母菌可用于制备麦角硫因，采用其制备麦角硫因，具有所得麦角硫因产率高，成本低，制备速度快的优点。所述制备方法具有成本低，绿色环保，产品的质量高，产率高，杂质少，药物残留少，发酵周期短等优点。
[0010]
第三方面，本技术提供一种采用前述制备方法制备所得的麦角硫因。所述麦角硫因杂质少，药物残留少，杂质和化学残留少，产品质量高。
[0011]
第四方面，本技术提供一种第一方面所述酵母菌在制备麦角硫因中的应用。
[0012]
发明详述
[0013]
为解决上述问题，本技术提供以下技术方案。
[0014]
第一方面，提供一种酵母菌。
[0015]
一种酵母菌，其包括保藏编号为cctcc m 20211505；所述酵母菌株已经于2021年11月29日在中国典型培养物保藏中心(cctcc，武汉大学)进行了生物保藏，分类命名为粟酒裂殖酵母 (schizosaccharomycespombeomk-79)。
[0016]
在一种实施方式中，提供了能够大规模生物合成天然麦角硫因的酵母菌。本技术主要通过复合诱变育种，选育出高产天然麦角硫因的酵母菌种，将其中优选的一株命名为omk-79。该酵母菌株已经于2021 年11月29日在中国典型培养物保藏中心(cctcc，武汉大学)进行了生物保藏，分类命名为粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)，保藏编号为cctcc m 20211505。
[0017]
第二方面，提供一种麦角硫因的制备方法。
[0018]
一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。在一些实施方式中，一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌接种于种子液培养基中进行扩大培养，得到种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。在一些实施方式中，一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌进行活化，得含活化酵母菌的培养基，将含活化酵母菌的培养基接种于种子液培养基中进行扩大培养，得种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。
[0019]
所述活化包括将第一方面所述的酵母菌接种于活化培养基中，于20℃-40℃，转速为100rpm-400rpm 的条件下生长16小时-60小时。在一些实施例中，所述活化包括将第一方面所述的酵母菌接种于活化培养基中，于25℃-35℃，转速为150rpm-300rpm的条件下生长24小时-48小时。
[0020]
所述活化培养基可以包括酵母膏、蛋白胨和葡萄糖。在一些实施例中，所述活化培养基包括酵母膏3g/l
ꢀ‑
30g/l，蛋白胨3g/l-30g/l和葡萄糖5g/l-50g/l。在一些实施例中，所述活化培养基包括酵母膏3g/l
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30g/l，蛋白胨3g/l-30g/l和葡萄糖5g/l-50g/l，余量为水。在一些实施例中，所述活化培养基包括酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l和葡萄糖20g/l。在一些实施例中，所述活化培养基包括酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l和葡萄糖20g/l，余量为水。
[0021]
所述扩大培养的温度可以为20℃-40℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为25℃-35℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为25℃-30℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为25℃-35℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、 34℃或35℃。
[0022]
所述扩大培养的转速可以为100rpm-900rpm。在一些实施例中，所述扩大培养的转速为150rpm
ꢀ‑
600rpm。在一些实施例中，所述扩大培养的转速为200rpm-500rpm。在一些实施例中，所述扩大培养的转速为100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、 550rpm、600rpm、700rpm、800rpm或900rpm。
[0023]
所述扩大培养的时间可以为16小时-200小时。在一些实施例中，所述扩大培养的时间为16小时-100 小时。在一些实施例中，所述扩大培养的时间为16小时-50小时。在一些实施例中，所述扩大培养的时间为16小时-48小时。在一些实施例中，所述扩大培养的时间为16小时、17小时、18小时、19小时、20 小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、35小时、40小时、45小时或48小时。
[0024]
所述扩大培养包括将含活化酵母菌的培养基以0.005％vol-30％vol的接种量接种于种子液培养基中。由于扩大培养的接种量可在大范围内进行调整，极少量的接种量也可以扩大培养成功，此为本领域公知常识，因此，所述扩大培养可以包括将含活化酵母菌的培养基以0.005％vol-30％vol的接种量接种于种子液培养基中。在一些实施例中，所述扩大培养包括将含活化酵母菌的培养基以0.5％vol-20％vol的接种量接种于种子液培养基中。在一些实施例中，所述扩大培养包括将含活化酵母菌的培养基以1％vol-10％vol的接种量接种于种子液培养基中。在一些实施例中，所述扩大培养包括将含活化酵母菌的培养基以1％vol-5％ vol的接种量接种于种子液培养基中。在一些实施例中，所述扩大培养包括将含活化酵母菌的培养基以 1％vol、2％vol、3％vol、4％vol、5％vol、6％vol、7％vol、8％vol、9％vol、10％vol、15％vol、20％ vol、25％vol或30％vol的接种量接种于种子液培养基中。
[0025]
所述种子液与发酵培养基的体积比可以为1:200-3:10。在一些实施例中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:150-2:10。在一些实施例中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:100-1:10。在一些实施例中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:100-1:20。
[0026]
所述底物的添加量可以为0-10g/l；酵母菌可代谢产生精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸等物质，但额外加入底物可提高麦角硫因产率。在一些实施例中，所述底物的添加量为0、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、 0.8g/l、0.9g/l、1.0g/l、1.2g/l、1.3g/l、1.4g/l、1.5g/l、2.0g/l、2.5g/l、3.0g/l、3.2g/l、3.5g/l、 4.0g/l、4.5g/l、5.0g/l、5.5g/l、6.0g/l、6.5g/l、7.0g/l、7.5g/l、8.0g/l、8.5g/l、9.0g/l、9.5 g/l或10.0g/l。
[0027]
所述底物可以包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸中的至少一种。在一些实施例中，所述底物可以包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸。
[0028]
所述发酵培养基可以包含碳源。
[0029]
所述碳源可以包括选自蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其它含葡萄糖的聚合物中的至少一种。在一些实施例中，所述碳源为甘油。
[0030]
在一些实施例中，所述制备方法包括将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，在合适的培养条件下生长。酵母菌可以在分批发酵、单一补料分批发酵、混
合补料分批发酵或连续发酵或其组合中生长。
[0031]
在一些实施例中，所述底物可以在第一方面所述的酵母菌的潜伏期、指数增生期或者平台期加入发酵体系。
[0032]
所述第一方面所述的酵母菌在发酵培养基中可以是悬浮的或固定化的。
[0033]
所述发酵培养基可以包括磷酸、caso4、k2so4、koh、mgso4·
7h2o、甘油、酵母膏、蛋白胨、消泡油和无菌水。在一些实施例中，所述发酵培养基包括1％vol-7％vol的磷酸、0.03wt％-0.3wt％的caso4、 1wt％-6wt％的k2so4、0.1wt％-2wt％的koh、0.5wt％-5wt％的mgso4·
7h2o、1wt％-12wt％的甘油、 0.1wt％-2wt％的酵母膏、0.1wt％-2wt％的蛋白胨、0.01％vol-1％vol的消泡油，余量为水。在一些实施例中，所述发酵培养基包括2.27％vol的磷酸、0.093wt％的caso4、1.82wt％的k2so4、0.413wt％的koh、1.49wt％的mgso4·
7h2o、4wt％的甘油、0.5wt％的酵母膏、0.5wt％的蛋白胨、0.1％vol的消泡油，余量为水。
[0034]
所述种子液培养基可以包括酵母膏、蛋白胨和葡萄糖。在一些实施例中，所述种子液培养基包括酵母膏3g/l-30g/l，蛋白胨3g/l-30g/l和葡萄糖5g/l-50g/l。在一些实施例中，所述种子液培养基包括酵母膏3g/l-30g/l，蛋白胨3g/l-30g/l和葡萄糖5g/l-50g/l，余量为水。在一些实施例中，所述种子液培养基包括酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l和葡萄糖20g/l。在一些实施例中，所述种子液培养基包括酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l和葡萄糖20g/l，余量为水。
[0035]
所述发酵的温度可以为20℃-40℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为25℃-35℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为25℃-30℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为25℃-35℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
[0036]
所述发酵的时间可以为16小时-200小时。一般来说更长的培养时间产生更大量的天然麦角硫因。因此，可以将酵母菌培养16小时至200小时。在一些实施例中，所述发酵的时间可以为24小时-200小时。在一些实施例中，所述发酵的时间可以为48小时-200小时。在一些实施例中，所述发酵的时间可以为100 小时-200小时。在一些实施例中，所述发酵的时间可以为140小时-200小时。
[0037]
所述发酵的空气流通速度可以为0.8l/分钟-8l/分钟。在一些实施例中，所述发酵的空气流通速度为 1l/分钟-7l/分钟。在一些实施例中，所述发酵的空气流通速度为2l/分钟-6l/分钟。在一些实施例中，所述发酵的空气流通速度为3l/分钟-5l/分钟。在一些实施例中，所述发酵的空气流通速度为1l/分钟、2l/ 分钟、3l/分钟、4l/分钟、5l/分钟、6l/分钟、7l/分钟或8l/分钟。
[0038]
所述发酵的气压可以为0-0.6mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.05mpa-0.6mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.06mpa-0.50mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.07mpa-0.40 mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.07mpa-0.30mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为 0.07mpa-0.20mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.07mpa-0.10mpa。在一些实施例中，所述发酵的气压为0.05mpa、0.06mpa、0.07mpa、0.08mpa、0.09mpa、0.10mpa、0.15mpa、0.20mpa、 0.25mpa、0.30mpa、0.35mpa或0.40mpa。
[0039]
所述发酵的发酵体系ph可以为4.0-7.0。在一些实施例中，所述发酵的发酵体系ph为4.0、4.5、5.0、 5.5、6.0、6.5或7.0。
[0040]
所述发酵体系ph可以通过添加氨水来进行调节。
[0041]
在一些实施例中，所述发酵体系是指前述酵母菌与底物和培养基混合后形成的体系。在一些实施例中，发酵体系是底物加入前，前述酵母菌与培养基混合后形成的体系。在一些实施例中，发酵体系是前述酵母菌与培养基混合后形成的体系。
[0042]
所述发酵的初始搅拌速度可以为100rpm-900rpm。在一些实施例中，所述发酵的初始搅拌速度为 150rpm-600rpm。在一些实施例中，所述发酵的初始搅拌速度为200rpm-500rpm。在一些实施例中，所述发酵的初始搅拌速度为100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、 450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、700rpm、800rpm或900rpm。
[0043]
在发酵步骤中，可以在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm(例如100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、 400rpm、450rpm、500rpm、550rpm或600rpm)，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到30g/l-300g/l(例如30g/l、50g/l、100g/l、150g/l、180g/l、190g/l、200g/l、210 g/l、220g/l、250g/l或300g/l)。在一些实施例中，在发酵步骤中，可以在发酵至溶解氧浓度下降到 50％时，加入底物并补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到30g/l-300g/l。
[0044]
所述甘油的补加量可以为20g/l-220g/l。在一些实施例中，所述甘油的补加量为20g/l、30g/l、 40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、75g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、 150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l或220g/l。
[0045]
所述分离步骤可以包括采用离心、萃取、真空蒸馏或树脂吸附等进行分离和纯化。在一些实施例中，所述分离步骤包括采用萃取、真空蒸馏或树脂吸附等进行分离和纯化，得到均质(例如纯度有90％以上) 的麦角硫因。在一些实施例中，麦角硫因被分离为酵母菌的提取物，在这种情况下，麦角硫因可以被分离但不必纯化至均质。
[0046]
在一些实施例中，一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，在发酵温度为20℃-40℃，空气流通速度为0.8l/分钟-8l/分钟，气压为0-0.6mpa，ph为 4.0-7.0，搅拌速度为100rpm-900rpm的条件下进行发酵，在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到200g/l；然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因；所述底物包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸中的至少一种；所述发酵培养基所述发酵培养基包括1％vol-7％vol的磷酸、 0.03wt％-0.3wt％的caso4、1wt％-6wt％的k2so4、0.1wt％-2wt％的koh、0.5wt％-5wt％的 mgso4·
7h2o、1wt％-12wt％的甘油、0.1wt％-2wt％的酵母膏、0.1wt％-2wt％的蛋白胨、0.01％vol-1％vol 的消泡油，余量为水。
[0047]
在一些实施例中，一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌接种于种子液培养基中进行扩大培养，得到种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，在发酵温度为20℃-40℃，空气流通速度为0.8l/分钟-8l/分钟，气压为0-0.6mpa，ph为4.0-7.0，搅拌速度为100rpm-900rpm的条件下进行发酵，在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到200g/l；然后进行细胞破碎，分离，得到
麦角硫因；所述底物包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸中的至少一种；所述发酵培养基所述发酵培养基包括1％vo-7％vol的磷酸、0.03wt％-0.3wt％的caso4、1wt％-6wt％的 k2so4、0.1wt％-2wt％的koh、0.5wt％-5wt％的mgso4·
7h2o、1wt％-12wt％的甘油、0.1wt％-2wt％的酵母膏、0.1wt％-2wt％的蛋白胨、0.01％vol-1％vol的消泡油，余量为水。
[0048]
在一些实施例中，一种麦角硫因的制备方法，其包括：将第一方面所述的酵母菌进行活化，得含活化酵母菌的培养基，将含活化酵母菌的培养基接种于种子液培养基中进行扩大培养，得种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，在发酵温度为20℃-40℃，空气流通速度为0.8l/分钟-8l/分钟，气压为 0-0.6mpa，ph为4.0-7.0，搅拌速度为100rpm-900rpm的条件下进行发酵，在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到200g/l；然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。
[0049]
第三方面，提供一种根据第二方面所得的麦角硫因。
[0050]
一种根据第二方面所述的制备方法所得的麦角硫因。根据第二方面所述的制备方法所得的麦角硫因杂质少，药物残留少，杂质和化学残留少，产品质量高。
[0051]
第四方面，提供了一种第一方面所述酵母菌在制备麦角硫因中的应用。
[0052]
一种第一方面所述酵母菌在制备麦角硫因中的应用。
[0053]
有益效果
[0054]
相比现有技术，上述技术方案的一个实施例至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
[0055]
(1)本技术所提供的酵母菌可用于制备麦角硫因，所得麦角硫因产率高，成本低，制备速度快，具有优异的产业化前景。
[0056]
(2)本技术所提供的酵母菌可传代次数多，传代后产率稳定性好。
[0057]
(3)本技术所提供的麦角硫因的制备方法采用生物发酵合成的方法，与化学合成等方法相比，不需要昂贵的原料，有利于大大降低成本，还能大大减少制备过程中有毒有害的化学试剂的使用，绿色环保，且有利于减少产品的杂质和化学残留，有利于提高产品的质量。
[0058]
(4)本技术所提供的麦角硫因的制备方法相比其他天然生物提取法，具有产率高，杂质少，药物残留少，制备成本低等优点。
[0059]
(5)本技术所提供的麦角硫因的制备方法相比其他发酵技术，具有发酵周期短，产率高，成本低的优点，有利于产业化生产。
[0060]
(6)通过本技术所提供的制备方法不需加入有机溶剂和有毒有害试剂，而是通过生物发酵的方法进行制备，所得的麦角硫因天然，安全，环保，无有机溶剂残留。
附图说明
[0061]
图1为实施例1中麦角硫因的合成的示意图。
[0062]
图2为实施例1中麦角硫因标准品的高效液相色谱图。
[0063]
图3为实施例1中mm1菌株的发酵液的高效液相色谱图。对比图2，可证明图3中存在麦角硫因。
[0064]
图4为实施例3中天然麦角硫因的合成的示意图。
[0065]
术语定义：
[0066]
在本文的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现
±
10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如
±
1％、
±
2％、
±
3％、
±
4％或
±
5％的差异。
[0067]
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
[0068]
术语“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现。例如“将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合”指“将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基和底物混合”或者“将第一方面所述的酵母菌与发酵培养基混合”。
[0069]
术语“接种量”是指含活化酵母菌的培养基的体积占接种后种子液培养基和活化酵母菌的培养基总体积的体积百分比；或者种子液接种于发酵培养基后，种子液的体积占种子液和发酵培养基总体积的体积百分比。
[0070]
术语“od
600”是指检测的600nm波长处的光密度。
[0071]
术语“wt％”是指质量百分比。
[0072]
术语“％vol”是指体积百分比。
[0073]
术语“sam”是指s-腺苷甲硫氨酸，其为菌体细胞内天然存在的中间代谢产物。
[0074]
术语“sah”是指s-腺苷高半胱氨酸，由sam脱去甲基后生成，其为菌体细胞内天然存在的中间代谢产物。
[0075]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本文的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
[0076]
为了使本领域的技术人员更好地理解本文的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本文作进一步的详细说明。
[0077]
本文所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本技术所描述的方法制备而得。
[0078]
除另有规定外，以下具体实施例所述各培养基的配方如下：
[0079]
所述ypd培养基(酵母膏胨葡萄糖培养基)的配方为：酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l和葡萄糖20g/l，余量为水。
[0080]
所述ypd琼脂培养基(酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基)的配方为：酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l和琼脂粉15g/l，余量为水。
[0081]
所述含0.02％氯化锂(作为诱变剂)的ypd琼脂培养基的配方为：酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15g/l和氯化锂0.2g/l，余量为水。
[0082]
本技术所述复合诱变育种技术，为本领域技术人员熟知的常规诱变方法。应当理解，所述方法仅用于说明本技术，而不能限制本技术的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本技术精神和实质的前提下，对所述方法中的培养基组分、含量、培养条件、诱变条件进行的各种改变或改动也属于本技术的保护范围。
[0083]
优选的本技术所述紫外线诱变中，取酵母菌种悬液在紫外灯下25～35cm处照射处理15～25min。优选的本技术所述氯化锂诱变中，取酵母菌种悬液涂布于含有0.01-0.02％氯化锂(作为诱变剂)的培养基上，在18～37℃培养16～72小时。
[0084]
具体地讲，所述酵母菌种悬液的制备为取18～37℃培养16～72小时的酿酒酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母，德布尔有孢酵母或乳酸克鲁维酵母菌液，通过离心收集到菌液内的菌体，用无菌水冲洗菌体2-3 次，然后加入适量吐温80，重悬振荡处理使细胞分散，用无菌水调整细胞密度至约1000000个/ml。
[0085]
术语“rpm”表示转速“转每分钟”；“℃”表示温度单位“摄氏度”；“l”表示体积单位“升”；“ml”表示体积单位“毫升”；“ph”表示酸碱度；“g”表示质量单位“克”；“mpa”表示压强单位“兆帕”。
[0086]
实施例1：对酵母菌种的筛选
[0087]
细胞悬液的制备
[0088]
将分离出的酿酒酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、德布尔有孢酵母或乳酸克鲁维酵母菌接种于装有10ml酵母膏胨葡萄糖(ypd)培养基的50ml平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48小时，通过离心收集到菌液内的菌体，用10ml无菌水冲洗菌体3次，然后用10ml无菌水重悬并置于50ml平底锥形瓶中，用移液枪加入5ul的吐温80，在28℃和250rpm转速下振荡30min，使细胞分散。通过检测od
600
获知各酵母菌种的细胞密度，加入适量的无菌水调整细胞密度至约1000000个/ml。
[0089]
紫外线诱变
[0090]
分别吸取10ml、细胞密度约为1000000个/ml的各酵母菌悬液，分别置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方30cm处进行紫外照射，照射时间为20min。
[0091]
氯化锂诱变
[0092]
分别取紫外诱变后的各酵母菌悬液10ml，全部涂布于含有0.02％氯化锂(作为诱变剂)的ypd琼脂培养基上，用牛皮纸包裹，放入28℃培养箱中培养72h。
[0093]
酵母菌的筛选
[0094]
分别挑选长势良好、单菌落直径比较大的经过紫外线诱变和氯化锂诱变的各酵母菌的突变株平板划线于ypd琼脂培养基，于28℃恒温培养箱中培养48h。每个酵母菌种挑约500个突变株。将各突变株接种于装有10ml的ypd培养基的50ml平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48小时，得到菌液。通过破碎细胞、离心，收集含麦角硫因的上清液，取麦角硫因标准品和所述上清液，用高效液相色谱法 (hplc)测定上清液中发酵所得麦角硫因的含量。取复合诱变前的各酵母菌种的溶液作为对照。
[0095]
经紫外线和氯化锂复合诱变前，各酵母菌通过hplc检测均未检测到麦角硫因。经紫外线和氯化锂复合诱变后，部分酵母菌检测到具有合成麦角硫因的能力，选育出一株可在细胞内积累一定量麦角硫因的粟酒裂殖酵母，命名为mm1，麦角硫因的产量(即所述上清
液中麦角硫因的含量)约为62.6mg/l，参见图 1。该诱变粟酒裂殖酵母菌株mm1用甘油保存于零下80℃，且传代5次，麦角硫因产量稳定。
[0096]
实施例2：对粟酒裂殖酵母菌株mm1的复筛选
[0097]
细胞悬液的制备
[0098]
分别将粟酒裂殖酵母菌株mm1接种于装有10ml的ypd培养基的50ml平底锥形瓶中，在28℃和 250rpm转速下生长48小时，通过离心收集到菌液内的菌体，用10ml无菌水冲洗菌体3次，然后用10ml 无菌水重悬并置于50ml平底锥形瓶中，用移液枪加入5ul的吐温80，在28℃和250rpm转速下振荡30min，使细胞分散。通过检测od
600
获知粟酒裂殖酵母菌株mm1的细胞密度，加入适量的无菌水调整细胞密度至约1000000个/ml。
[0099]
紫外线诱变
[0100]
分别吸取10ml、细胞密度约为1000000个/ml的粟酒裂殖酵母菌株mm1悬液，置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方30cm处进行紫外照射，照射时间为20min。
[0101]
氯化锂诱变
[0102]
分别取紫外诱变后的粟酒裂殖酵母菌株mm1悬液10ml，全部涂布于含有0.02％氯化锂(作为诱变剂)的ypd琼脂培养基上，用牛皮纸包裹，放入28℃培养箱中培养72h。
[0103]
粟酒裂殖酵母的筛选
[0104]
分别挑选500个长势良好、单菌落直径比较大的经过紫外线诱变和氯化锂诱变的粟酒裂殖酵母菌株 mm1的突变株平板划线于ypd琼脂培养基，于28℃恒温培养箱中培养48h。再将突变株接种于装有10ml 的ypd培养基的50ml平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48小时，得到菌液。通过破碎细胞、离心，收集含的麦角硫因的上清液，取麦角硫因标准品和所述上清液，用高效液相色谱法(hplc) 测定所述上清液中麦角硫因的含量。取含复筛选前的粟酒裂殖酵母菌株mm1的溶液作为对照。
[0105]
经紫外线和氯化锂复合诱变后，复筛选出一株可在细胞内积累一定量的麦角硫因的粟酒裂殖酵母菌，命名为mm2，其可产出约为598mg/l(即所述上清液中麦角硫因的含量)的麦角硫因。该诱变粟酒裂殖酵母菌株mm2用甘油保存于零下80℃，且传代5次，麦角硫因产量稳定。
[0106]
对粟酒裂殖酵母菌株mm2再次进行紫外线和氯化锂复合诱变，经过多次复合诱变后，最终选育出一株高产麦角硫因的粟酒裂殖酵母菌株，命名为omk-79(该菌株的保藏编号为cctcc m 20211505，于 2021年11月29日在中国典型培养物保藏中心(cctcc，武汉大学)进行了生物保藏)。该诱变粟酒裂殖酵母菌株omk-79用甘油保存于零下80℃，且传代5次，麦角硫因产量稳定。
[0107]
实施例3：麦角硫因的发酵生产
[0108]
将粟酒裂殖酵母菌株omk-79接种于装有50ml的ypd培养基的250ml平底锥形瓶中，在28℃和 250rpm转速下生长48小时来活化菌株。活化后的omk-79菌株以1％的接种量转接到装有150ml的ypd 培养基的1l平底锥形瓶中，28℃和250rpm转速下生长18小时，得到种子液。将100ml的粟酒裂殖酵母omk-79种子液接种到3l的发酵培养基中进行发酵。发酵在5l的小试规模生物反应器中进行，其温度和ph值分别控制在28-30℃和4.0-7.0。在上述发酵的整个运行期间，空气流通速度保持在3l/分钟，压力维持在0.08mpa，ph值通过添加氨水来控
制，初始搅拌速度是200rpm。
[0109]
当溶解氧浓度(do)下降到50％(约发酵24小时后)，开始补加甘油，并增加搅拌速度到600rpm，直至检测生物量达到200g/l(湿重)，补加的甘油的量约为75g/l，补加甘油120小时后，发酵液的菌体细胞密度达到饱和，od
600
值最高可达400。在补加甘油开始后的整个发酵期间，空气流通速度保持在4l/ 分钟，压力维持在0.10mpa。发酵结束后，破碎细胞、离心，收集含麦角硫因的上清液，用高效液相色谱法(hplc)测定所述上清液中麦角硫因的含量，其含量为7.6g/l。
[0110]
实施例4：麦角硫因的生产优化
[0111]
将粟酒裂殖酵母菌株omk-79接种于装有50ml的ypd培养基的250ml平底锥形瓶中，在28℃和 250rpm转速下生长48小时来活化菌株。活化后的omk-79菌株以1％的接种量转接到装有150ml的ypd 培养基的1l平底锥形瓶中，28℃和250rpm转速下生长18小时，得到种子液。将100ml的粟酒裂殖酵母omk-79种子液接种到3l的发酵培养基中进行发酵。发酵在5l的小试规模生物反应器中进行，其温度和ph值分别控制在28-30℃和5.0-6.0。在上述发酵的整个运行期间，空气流通速度保持在3l/分钟，压力维持在0.08mpa，ph值通过添加氨水来控制，初始搅拌速度是200rpm。
[0112]
当溶解氧浓度(do)下降到50％(约发酵24小时后)，开始补加甘油和底物。底物分别为1g/l的精氨酸、1g/l的组氨酸、1g/l的蛋氨酸或1g/l的半胱氨酸。开始补加甘油和底物后，逐渐增加搅拌速度到600rpm，直至检测生物量达到200mg/ml(湿重)，补加的甘油的量约为75g/l，补加甘油和底物120小时后，发酵液的菌体细胞密度达到饱和，od
600
值最高可达400。在整个补加甘油和底物开始后的整个发酵期间，空气流通速度保持在4l/分钟，压力维持在0.10mpa。发酵结束后，破碎细胞、离心，收集含麦角硫因的上清液，用高效液相色谱法(hplc)测定所述上清液中麦角硫因的含量。通过实验得到，底物精氨酸、组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的补加均对麦角硫因的生产有促进作用，上清液中麦角硫因的含量分别为10.7g/l(底物为精氨酸)、9.8g/l(底物为组氨酸)、9.2g/l(底物为蛋氨酸)和8.4g/l(底物为半胱氨酸)。
[0113]
实施例5：麦角硫因的发酵优化
[0114]
将粟酒裂殖酵母菌株omk-79接种于装有50ml的ypd培养基的250ml平底锥形瓶中，在28℃和 250rpm转速下生长48小时来活化菌株。活化后的omk-79菌株以1％的接种量转接到装有150ml的ypd 培养基的1l平底锥形瓶中，28℃和250rpm转速下生长18小时，得到种子液。将100ml的粟酒裂殖酵母omk-79种子液接种到3l的发酵培养基中进行发酵。发酵在5l的小试规模生物反应器中进行，其温度和ph值分别控制在28-30℃和5.0-6.0。在上述发酵的整个运行期间，空气流通速度保持在3l/分钟，压力维持在0.08mpa，ph值通过添加氨水来控制，初始搅拌速度是200rpm。
[0115]
当溶解氧浓度(do)下降到50％(约发酵24小时后)，开始补加甘油、1.3g/l的精氨酸、0.8g/l 的组氨酸、0.6g/l的蛋氨酸和0.5g/l的半胱氨酸。开始补加甘油和底物后，逐渐增加搅拌速度到600rpm，直至检测生物量达到200mg/ml(湿重)，补加的甘油的量约为75g/l，补加甘油和底物120小时后，发酵液的菌体细胞密度达到饱和，od
600
值最高可达400。在整个补加甘油和底物开始后的整个发酵期间，空气流通速度保持在4l/分钟，压力维持在0.10mpa。发酵约148小时后，破碎细胞、离心，收集含麦角硫因的上清液，用高效液相色谱法
(hplc)测定所述上清液中麦角硫因的含量，其含量为12.5g/l。
[0116]
本技术的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本技术内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本技术技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本技术内。

技术特征：
1.一种酵母菌，其保藏编号为cctcc m 20211505。2.一种麦角硫因的制备方法，其包括：将权利要求1所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因；或者将权利要求1所述的酵母菌接种于种子液培养基中进行扩大培养，得到种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因；或者将权利要求1所述的酵母菌进行活化，得含活化酵母菌的培养基，将含活化酵母菌的培养基接种于种子液培养基中进行扩大培养，得种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。3.根据权利要求2所述的制备方法，所述底物包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸中的至少一种；任选地，所述发酵培养基包含碳源；任选地，所述碳源包括选自蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其它含葡萄糖的聚合物中的至少一种。4.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，所述发酵培养基包含磷酸、caso4、k2so4、koh、mgso4·
7h2o、甘油、酵母膏、蛋白胨、消泡油和水；任选地，所述发酵培养基所述发酵培养基包括1％vol-7％vol的磷酸、0.03wt％-0.3wt％的caso4、1wt％-6wt％的k2so4、0.1wt％-2wt％的koh、0.5wt％-5wt％的mgso4·
7h2o、1wt％-12wt％的甘油、0.1wt％-2wt％的酵母膏、0.1wt％-2wt％的蛋白胨、0.01％vol-1％vol的消泡油，余量为水；优选地，所述发酵培养基包括2.27％vol的磷酸、0.093wt％的caso4、1.82wt％的k2so4、0.413wt％的koh、1.49wt％的mgso4·
7h2o、4wt％的甘油、0.5wt％的酵母膏、0.5wt％的蛋白胨、0.1％vol的消泡油，余量为水。5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，所述种子液培养基包括酵母膏、蛋白胨和葡萄糖；任选地，所述种子液培养基包括酵母膏3g/l-30g/l，蛋白胨3g/l-30g/l，葡萄糖5g/l-50g/l。优选地，所述种子液培养基包括酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l。6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，所述发酵的温度为20℃-40℃；和/或所述发酵的时间为16小时-200小时；和/或所述发酵的空气流通速度为0.8l/分钟-8l/分钟；和/或所述发酵的气压为0-0.6mpa；和/或所述发酵的发酵体系ph为4.0-7.0；和/或所述发酵的初始搅拌速度为100rpm-900rpm。7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，在发酵步骤中，在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到30g/l-300g/l；任选地，所述甘油的补加量为20g/l-220g/l。8.一种麦角硫因的制备方法，其包括：将权利要求1所述的酵母菌接种于种子液培养基中进行扩大培养，得到种子液，将种子液与发酵培养基和任选的底物混合，在发酵温度为20
℃-40℃，空气流通速度为0.8l/分钟-8l/分钟，气压为0-0.6mpa，ph为4.0-7.0，搅拌速度为100rpm-900rpm的条件下进行发酵，在发酵至溶解氧浓度下降到50％时，补加甘油，增加搅拌速度为初始搅拌速度的基础上继续增加100rpm-600rpm，持续补加甘油和维持增加搅拌速度直至检测湿重生物量达到200g/l；然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因；所述底物包括选自精氨酸、组氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸中的至少一种；所述发酵培养基所述发酵培养基包括1％vol-7％vol的磷酸、0.03wt％-0.3wt％的caso4、1wt％-6wt％的k2so4、0.1wt％-2wt％的koh、0.5wt％-5wt％的mgso4·
7h2o、1wt％-12wt％的甘油、0.1wt％-2wt％的酵母膏、0.1wt％-2wt％的蛋白胨、0.01％vol-1％vol的消泡油，余量为水。9.一种根据权利要求2-8任一项所述的制备方法所得的麦角硫因。10.一种权利要求1所述的酵母菌在制备麦角硫因中的应用。

技术总结
本发明涉及一种酵母菌及其制备麦角硫因的应用。属于生物技术领域。所述酵母菌为经过传统诱变和筛选所得，其保藏编号为CCTCC M 20211505。所述应用为在麦角硫因的制备方法中的应用。所述制备方法包括将所述的酵母菌与发酵培养基和任选的底物混合，发酵，然后进行细胞破碎，分离，得到麦角硫因。所述酵母菌具有均可用于制备麦角硫因，具有产率高，成本低，制备速度快等优点。所述制备方法具有天然，安全，成本低，绿色环保，产品的质量，产率高，杂质少，药物残留少，发酵周期短等优点。发酵周期短等优点。


技术研发人员：周丽琴 向婷 杨美雪 彭文旭 邢晨光 刘刚
受保护的技术使用者：厦门欧米克生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2023/7/22