Cas核酸酶的变体的制作方法

cas核酸酶的变体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年7月26日提交的美国临时申请第63/056,709号的优先权，所述美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明总体上涉及用于基因组工程的组合物和方法。更具体地，本发明涉及在基因组工程中具有改进的特异性的cas9变体。


背景技术：

4.来源于成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)-cas系统的rna引导的cas核酸酶为编辑各种生物体的基因组提供了通用的工具。在没有脱靶活性或脱靶活性最小的情况下对预定核酸酶靶位点进行特异性切割是crispr/cas系统的治疗应用的前提条件。然而，目前可用的大多数cas核酸酶表现出明显的脱靶活性，并且因此可能不适合临床应用。
5.在被发现的数千种cas蛋白中，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9(sacas9)由于其相对较小的大小和较高的基因编辑效率而显得尤为重要。然而，脱靶问题是其应用的主要问题，特别是在治疗方面。因此，仍然需要用于基因组工程技术的具有提高的特异性的新型组合物和方法。


技术实现要素：

6.本文公开了用于基因组工程、生成转基因细胞、组织、植物和动物的cas核酸酶的变体、编码所述变体的多核苷酸、其组合物、表达载体和其使用方法。本发明的组合物、载体和方法还可用于基因疗法和细胞疗法技术。
7.一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)的氨基酸序列的变体，其中所述变体包括与seq id no：1的至少70％的同一性和seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基(a)位于grna核苷酸12-14附近；(b)位于sacas9的桥螺旋中；或(c)与靶dna形成氢键。
8.在一些实施方式中，所述变体与seq id no：1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
9.在一些实施方式中，所述变体包括seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：n44、r61、n120、t134、y230、r245、k248、y249、t316、s317、g391、t392、n413、n419、i445、l446、s447、k482、y651、r654、d786、t787、y789、k815、y882、r1012、t1019和s1022。
10.在一些实施方式中，所述变体包括seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：n44、r61、k248、t316、s317、t392、n413、n419、k482和r654。
11.在一些实施方式中，所述突变选自n44、r61、k248、t316、s317、t392和k482。
12.在一些实施方式中，所述突变选自n44a、r61a、k248w、t316y、s317y、t392a和k482w。
13.在一些实施方式中，所述突变选自t316y、s317y和k482w。
14.在一些实施方式中，所述突变是n44a或r61a。
15.在一些实施方式中，所述突变是t392a，或者n413a、n419a和r654a的组合。
16.在一些实施方式中，所述突变是(a)n44a和t316y的组合，或(b)r61a和t316y的组合，或(c)t316y和t392a的组合，或(d)t316y和k482w的组合，或(e)k482w和t392a的组合，或(f)n413a、n419a、r654a和t316y的组合。
17.另一方面，本公开提供了一种编码本文所述的多肽的多核苷酸。
18.另一方面，本公开提供了一种包括本文所述的多核苷酸的载体。在一些实施方式中，所述载体是质粒载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或aav载体。
19.另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，以及向导rna。在一些实施方式中，所述组合物进一步包含包括转基因的供体dna。
20.另一方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞包括用于表达本文所述的多肽的载体。
21.另一方面，本公开提供了一种用于在细胞中进行基因组工程的方法，所述方法包括将本文所述的组合物引入所述细胞中。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单细胞胚胎。
22.根据以下描述、所附权利要求和附图，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解。
附图说明
23.以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文中所呈现的具体实施方式的详细说明可以更好地理解本公开。
24.图1是向导rna核苷酸的位置的示意图。
25.图2是与grna核苷酸结合的sacas9的晶体结构的示意图。核苷酸12-14标记为红色。
26.图3展示了野生型sacas9核酸酶的氨基酸序列。
具体实施方式
27.在上面的发明内容和在具体实施方式和下面的权利要求书以及在附图中都提到了本发明的特定特征(包括方法步骤)。应该理解的是，本说明书中的本发明的公开内容包括此类特定特征的所有可能组合。例如，在本发明的特定方面或实施方式或特定权利要求的上下文中公开特定特征的情况下，所述特征也可以在可能的范围内与本发明的其它特定方面和实施方式组合使用和/或在本发明的其它特定方面和实施方式的上下文中使用并且
可以大体地在本发明中使用。
28.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
29.本说明书中所引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，就像每个单独的出版物或专利被具体且单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文，以便结合所引用的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开因先前的公开而无权先于此类出版物。进一步地，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要独立地确认。
30.如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和展示的单独实施方式中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与其它若干实施方式中的任何实施方式的特征分离或组合。任何所叙述的方法都可以按所叙述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
31.定义
32.如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
33.术语“cas9”或“cas9核酸酶”是指包括cas9蛋白或其片段(例如，包括cas9的活性dna切割结构域或非活性dna切割结构域，和/或cas9的grna结合结构域的蛋白)的rna引导核酸酶。cas9核酸酶有时也被称为casn1核酸酶或crispr(成簇规则间隔短回文重复序列)相关核酸酶。crispr是一种提供保护以免于移动遗传元件(病毒、转座因子和接合质粒)的影响的适应性免疫系统。crispr簇含有间隔区、与先前移动元件互补的序列，以及入侵核酸的靶标。crispr簇被转录并加工成crispr rna(crrna)。在ii型crispr系统中，正确加工pre-crrna需要反式编码的小rna(tracrrna)、内源核糖核酸酶3(rnc)和cas9蛋白。tracrrna用作核糖核酸酶3辅助的pre-crrna加工的向导。随后，cas9/crrna/tracrrna核酸内切溶解地(endonucleolytically)切割与间隔区互补的线性dsdna靶标或环形dsdna靶标。与crrna不互补的靶链首先被核酸内切溶解地切割，然后被核酸外切溶解地(exonucleolytically)3
′‑5′
修整。在自然界中，dna的结合和切割通常需要蛋白质以及crrna和tracrrna。crrna和tracrrna的功能可以并入到单向导rna(“sgrna”或简单地“gnra”)中。参见例如jinek m.，chylinski k.，fonfara i.，hauer m.，doudna j.a.，charpentier e.《科学(science)》，337：816-821(2012)，所述文献的全部内容通过引用特此并入。cas9识别crispr重复序列中的短基序(pam或原间隔区相邻基序)，以帮助区分自我和非自我。cas9核酸酶的序列和结构对于本领域的技术人员来说是众所周知的。cas9直系同源物已在各种物种中进行了描述，包括但不限于酿脓链球菌(s.pyogenes)、变形链球菌(s.mutans)、嗜热链球菌(s.thermophilus)、空肠弯曲杆菌(c.jejuni)、脑膜炎奈瑟菌(n.meningitides)、多杀性巴氏杆菌(p.multocida)、新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)和金黄色葡萄球菌(s aureus)。
34.需要注意的是，在本公开中，如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”等术语是包括性的或开放式的，
并不排除另外的、未引用的元素或方法步骤。如“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”和“基本上由
……
组成(consists essentially of)”等术语允许包括不会对所要求保护的发明的基本和新颖特性产生实质性影响的另外的成分或步骤。术语“由
……
组成(consists of)”和“由
……
组成(consisting of)”是封闭的。
35.如本文所使用的，术语“有效量”是指足以引起所需生物应答的生物活性剂的量。例如，在一些实施方式中，核酸酶的有效量可以指足以诱导由核酸酶特异性结合和切割的靶位点的切割的核酸酶的量。如本领域技术人员将理解的，药剂，例如核酸酶的有效量可以根据各种因素而变化，例如，根据所需的生物应答、特定的等位基因、基因组、靶位点、靶向的细胞或组织以及所使用的药剂。
36.如本文所使用的，术语“同源的”是本领域理解的术语，其是指在核苷酸和/或氨基酸序列水平上高度相关的核酸或多肽。相互同源的核酸或多肽称为“同源物”。两个序列之间的同源性可以通过本领域技术人员已知的序列比对方法来确定。根据本发明，如果两个序列在至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少120个氨基酸、至少150个氨基酸或至少200个氨基酸的至少一个段中至少约50％至60％相同，例如，与一个序列或另一个序列中包括的所有残基中的至少约50％至60％具有相同的残基(例如，氨基酸残基)，至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同，则所述两个序列被认为是同源的。
37.如本文所使用的，术语“突变”是指用另一个残基取代序列，例如核酸或氨基酸序列内的残基，或者删除或插入序列内的一个或多个残基。突变通常在本文中是通过鉴定原始残基、随后的残基在序列内的位置以及随后的新取代的残基的身份来描述的。用于进行本文提供的氨基酸取代(突变)的各种方法在本领域是众所周知的，并且由例如green和sambrook，《分子克隆：实验室手册(molecular cloning：a laboratory manual)》(第4版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.)(2012))提供。
38.如本文所使用的，术语“核酸酶”是指能够切割核酸分子中连接两个核苷酸残基的磷酸二酯键的药剂，例如蛋白质。在一些实施方式中，核酸酶是能够与核酸分子结合并切割核酸分子内连接核苷酸残基的磷酸二酯键的蛋白质，例如酶。核酸酶可以是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的核酸内切酶；也可以是切割多核苷酸链的末端处的磷酸二酯键的核酸外切酶。在一些实施方式中，核酸酶是位点特异性核酸酶，其结合和/或切割特定核苷酸序列内的特定磷酸二酯键，所述特定核苷酸序列在本文中也被称为“识别序列”、“核酸酶靶位点”或“靶位点”。在一些实施方式中，核酸酶是rna引导(即，rna可编程)核酸酶，其与具有与靶位点互补的序列的rna(例如向导rna，即“grna”)缔合(例如，与之结合)，从而提供核酸酶的序列特异性。在一些实施方式中，核酸酶识别单链靶位点，而在其它实施方式中，核酸酶识别双链靶位点，例如，双链dna靶位点。许多天然存在的核酸酶，例如许多天然存在的dna限制性核酸酶的靶位点是本领域技术人员所熟知的。在许多情况下，dna核酸酶，如ecori、hindiii或bamhi识别长度为4个碱基对至10个碱基对的回文双链dna靶位点，并且在靶位点内的特定位置处切割两条dna链中的每条dna链。一些核酸内切酶对称地切割双链核酸靶位
点，即在同一位置处切割两条链，使得末端包括碱基配对的核苷酸，在本文中也称为平末端。其它核酸内切酶不对称地切割双链核酸靶位点，即在不同的位置处切割每条链，使得末端包括未配对的核苷酸。双链dna分子末端处的未配对核苷酸也被称为“突出端(overhang)”，例如被称为“5
′
突出端”或被称为“3
′
突出端”，这取决于未配对核苷酸是形成相应dna链的5
′
末端还是5
′
末端。以未配对核苷酸结尾的双链dna分子末端也被称为粘性末端，因为其可以“粘结”到其它包括互补的未配对核苷酸的双链dna分子末端。核酸酶蛋白通常包括“结合结构域”和“切割结构域”，所述“结合结构域”介导蛋白与核酸底物的相互作用并且在一些情况下还特异性地与靶位点结合，所述“切割结构域”催化核酸骨架内的磷酸二酯键的切割。在一些实施方式中，核酸酶蛋白可以以单体形式结合并切割核酸分子，而在其它实施方式中，核酸酶蛋白必须二聚化或多聚化才能切割靶核酸分子。
39.术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以进行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实施例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。
40.如本文所使用的，术语“药物组合物”是指可以在治疗和/或预防疾病或病症的上下文中施用于受试者的组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含活性成分，例如核酸酶或其片段(或编码所述活性成分的核酸)，以及任选地药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含本发明的cas9变体蛋白和适合将cas9变体靶向到靶核酸的grna。在一些实施方式中，靶核酸是基因。在一些实施方式中，靶核酸是与疾病相关的等位基因，由此所述等位基因通过cas9变体的作用被切割。
41.术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸残基通过肽(酰胺)键连接在一起的聚合物。这些术语指的是任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常，蛋白质、肽或多肽的长度将为至少三个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可以指单个蛋白质或蛋白质的集合。可以例如通过添加如以下等化学实体来修饰蛋白质、肽或多肽中的一或多个氨基酸：碳水化合物基团、羟基、磷酸基团、法尼基团、异法尼基团、脂肪酸基团、用于缀合、功能化或其它修饰的接头等。蛋白质、肽或多肽也可以是单分子或者可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以只是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。本文提供的任何蛋白质都可以通过本领域已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可以通过重组蛋白的表达和纯化产生。用于重组蛋白的表达和纯化的方法是众所周知的，并且包括green和sambrook，《分子克隆：实验室手册》(第4版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2012))所描述的那些方法，所述文献的整个内容通过引用并入本文。
42.如本文所使用的，术语“受试者”是指单个生物体，例如，单个哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物。在一些实施方式中，受试者是绵羊、山羊、牛、猫或狗。在一些实施方式中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍蝇或线虫。在一些实施方式中，受试者是研究动物。在一些实施方式中，受试者是基因工程化的，例如，基因工程化的非人受试者。受试者可以是任何性别并且可以处于任
何发育阶段。
43.如本文在核酸酶的上下文中所使用的术语“靶核酸”和“靶基因组”分别是指包括给定核酸酶的至少一个靶位点的核酸分子或基因组。
44.如本文所使用的术语“靶位点”是指核酸分子内的由核酸酶(例如，本文提供的cas9蛋白)结合和切割的序列。靶位点可以是单链的或双链的。在cas9核酸酶的上下文中，靶位点通常包括与cas9核酸酶的grna互补的核苷酸序列，以及3
′
末端处的与grna互补序列相邻的原间隔区相邻基序(pam)。
45.多肽(例如，cas9核酸酶)的“变体”包括氨基酸序列，其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入到所述氨基酸序列中、从所述氨基酸序列缺失和/或取代到所述氨基酸序列中。
46.术语“载体”是指包括本发明的一种或多种多核苷酸(例如，编码本文提供的cas9蛋白和/或grna的多核苷酸)的多核苷酸。载体包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体和噬菌粒。载体可以在宿主细胞中复制并且其特征进一步在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，载体可以在所述位点处被切割并且可以在所述位点处插入期望的核酸序列。载体可以含有适合用于鉴定和/或选择已经用或尚未用载体转化或基因组修饰的细胞的一个或多个标记序列。标记包括例如编码增加或减少对抗生素(例如卡那霉素(kanamycin)、氨苄青霉素(ampicillin))或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码其活性可通过本领域已知的标准测定检测的酶(例如β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或荧光素酶)的基因，以及明显影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或斑块的表型的基因。本发明所包括的任何适合宿主细胞(例如大肠杆菌(e.coli)、哺乳动物细胞如cho细胞、昆虫细胞等)转化的载体，例如属于puc系列、pgem系列、pet系列、pbad系列、ptet系列或pgex系列的载体。在一些实施方式中，载体适用于转化宿主细胞以产生重组蛋白。用于选择和工程化用于表达蛋白(例如本文所提供的蛋白)的载体和宿主细胞、转化细胞并且表达/纯化重组蛋白的方法在本领域是众所周知的，并且由例如green和sambrook，《分子克隆：实验室手册》(第4版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2012))提供。
47.多肽和sacas9核酸酶变体
48.位点特异性核酸酶是体外和体内靶向基因组修饰的有力工具。活细胞中的位点特异性核酸酶切割触发dna修复机制，所述机制通常引起被切割和修复的基因组序列的修饰，例如通过同源重组。因此，对基因组内特定序列的靶向切割为活细胞中的基因靶向和基因修饰开辟了新的途径，所述活细胞包括难以用常规基因靶向方法操纵的细胞，如许多人类体细胞或胚胎干细胞。
49.位点特异性基因组修饰的一个问题是可能出现脱靶核酸酶效应，例如，切割与预定靶序列相差一个或多个核苷酸的基因组序列。脱靶切割的不期望的副作用从在基因靶向事件期间插入不需要的基因座到在临床情况下的严重并发症不等。施用于受试者的核酸内切酶对编码基本基因功能的序列或肿瘤抑制基因的脱靶切割可能导致受试者患病或甚至死亡。因此，所期望的是设计和开发具有最大的最小化脱靶效应可能性的新型核酸酶。
50.在一些方面，本公开的方法和组合物代表了相对于先前方法和组合物的改进，从而提供了被工程化成对预定靶标具有提高的特异性的核酸酶(及其使用方法)。因此，本公开的一些方面旨在使用新型的经工程化的cas9变体来减少cas9脱靶效应的可能性。在一个
实施例中，提供了一种cas9变体，其与野生型cas9相比具有提高的特异性，与野生型cas9相比，表现出例如＞2倍、＞5倍、＞10倍、＞50倍、＞100倍、＞140倍、＞200倍或更高的特异性。
51.一方面，本公开提供了一种基于金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)核酸酶的cas9变体。与其它cas9核酸酶，例如spcas9相比，sacas9因为其较小的大小(1053个氨基酸残基)而在基因组工程应用中具有重要意义。sacas9识别nngrrt原间隔区相邻基序(pam)。通常，sacas9核酸酶采用21个核苷酸的grna来引导核酸酶与其靶dna结合。在一些实施方式中，野生型sacas9核酸酶的氨基酸序列在seq id no：1中展示。
52.在一些实施方式中，本文提供的sacas9核酸酶变体具有与seq id no：1的至少70％的同一性，和seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：n44、r61、n120、t134、y230、r245、k248、y249、t316、s317、g391、t392、n413、n419、i445、l446、s447、k482、y651、r654、d786、t787、y789、k815、y882、r1012、t1019和s1022。
53.在核酸酶变体的上下文中，两个氨基酸(肽)或核酸(核苷酸)序列之间的“同一性百分比”和“％同一性”是指在两个最佳比对的序列中对应位置中相同的氨基酸或核苷酸残基的百分比。
54.为了确定两个氨基酸或核酸序列的“同一性百分比”，将这些序列一起比对。为了达到最优匹配，可以在序列中引入空位(即删除或插入，其也可以放在序列的末端处)。然后比较对应位置中的氨基酸和核苷酸残基。当第一序列中的位置被第二序列中占据对应位置的相同氨基酸或核苷酸残基占据时，这些分子在所述位置上是相同的。两个序列之间的同一性百分比是相同位置数除以序列的函数，即
55.同一性％＝(相同位置数/位置总数)
×
100。
56.根据有利的实施方式，所述序列具有相同的长度。有利地，所比较的序列没有空位(或插入)。
57.同一性百分比可以通过使用数学算法获得。用于比较两个序列的算法的非限制性实施例是karlin和altschul算法(《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》87(1990)2264-2268)，所述算法由karlin和altschul(《美国国家科学院院刊》90(1993)5873-5877)修改。所述算法被并入到altschul的blastn和blastp程序中(altschul等人，《分子生物学杂志(j.mol.bio.)》215(1990)403-410)。
58.为了即使在存在一个或多个空位(或插入)的情况下也能实现比对的目的，可以使用对每个空位(或插入)分配相对较高的罚分，并且对空位中每个另外的氨基酸或核苷酸残基分配较低的罚分(将这种另外的氨基酸或核苷酸残基定义为空位扩展)的方法。高的罚分将显然会使得比对被优化为空位数最少。
59.能够实现这种类型比对的程序的实施例是altschul等人，《核酸研究(nucleic acids res.)》25(1997)3389-3402中描述的blast程序。为此，blastn和blastp程序可以在默认参数的情况下使用。当使用blast程序时，通常采用blosum62矩阵。
60.用于实现最佳比对的程序的有利的且非限制性的实施例是gcg wisconsin bestfit软件包(美国威斯康辛大学(university of wisconsin，usa)；devereux等人，1984，《核酸研究》12：387)。再次使用默认参数，即对于氨基酸序列，其允许对空位进行-12的罚分，并且对每个扩展进行-4的罚分。
61.在一些实施方式中，本文提供的sacas9核酸酶变体具有野生型sacas9蛋白的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基位于grna核苷酸12-14附近。在一些实施方式中，野生型sacas9蛋白的位于grna核苷酸12-14附近的氨基酸残基选自i445、l446、s447、y651、t316、s317、k248、y249和k482。在一些实施方式中，野生型sacas9蛋白的位于grna核苷酸12-14附近的氨基酸残基是t316、s317、k482和k248。
62.在一些实施方式中，所述突变涉及用具有较大侧链的氨基酸残基取代野生型氨基酸残基。在一些实施方式中，用于取代的氨基酸残基是酪氨酸(y)、色氨酸(w)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)。在一些实施方式中，所述取代选自t316y、s317y、k248w和k482w。
63.在一些实施方式中，本文提供的sacas9核酸酶变体具有野生型sacas9蛋白质的桥螺旋中的氨基酸残基处的至少一个突变。在一些实施方式中，野生型sacas9蛋白的桥螺旋中的氨基酸残基与grna形成氢键。在一些实施方式中，桥螺旋中的氨基酸残基处的突变消除了与grna的氢键。在一些实施方式中，桥螺旋中的氨基酸残基是n44或r61。在一些实施方式中，突变是用选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)或缬氨酸(v)的氨基酸残基进行的取代。在一些实施方式中，突变是n44a或r61a。
64.在一些实施方式中，本文提供的sacas9核酸酶变体具有野生型sacas9蛋白的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基与靶dna形成氢键。在一些实施方式中，野生型sacas9蛋白的与靶dna形成氢键的氨基酸残基选自n120、t134、y230、r245、g391、t392、n413、n419、r654、d786、t787、y789、k815、y882、r1012、t1019和s1022。在一些实施方式中，所述突变是用选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)或缬氨酸(v)的氨基酸残基进行的取代。在一些实施方式中，所述突变是t392a，或者n413a/n419a/r654a的组合。
65.在一些实施方式中，本文提供的sacas9变体具有对seq id no：1中的氨基酸的一个或多个保守取代。在此上下文中，保守取代意味着所产生的变体不会显著改变sacas9核酸酶的生物活性。氨基酸的适合的保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的。通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代不会显著改变生物活性(参见例如，watson等人《基因的分子生物学(molecular biology of the gene)》，第4版，1987，本杰明/卡明斯出版公司(benjamin/cummings)，第224页)。具体地，此保守变体具有经修饰的氨基酸序列，使得变化不会显著改变蛋白质(保守变体)的结构和/或活性，例如酶活性。这些变化包括氨基酸序列的保守修饰变化，即对那些对蛋白质活性不关键的残基的氨基酸取代、增加或删除，或用具有类似性质(例如，酸性、碱性、带正电荷或带负电荷、极性或非极性等)的残基取代氨基酸，使得即使是对关键氨基酸的取代也不会显著改变结构和/或活性。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在本领域中众所周知。例如，一个用于选择保守取代的示例性准则包括(原始残基后跟示例性取代)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或he；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。可替代的示例性准则使用以下六个组，每个组含有相互保守取代的氨基酸：(1)丙氨酸(a或ala)、丝氨酸(s或ser)、苏氨酸(t或thr)；(2)天冬氨酸(d或asp)、谷氨酸(e或glu)；(3)天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)；(4)精氨酸(r或arg)、赖氨酸(k或lys)；(5)异亮氨酸(i或he)、亮氨酸(l或leu)、蛋氨酸(m或met)、缬氨酸(v或val)；以及(6)
苯丙氨酸(f或phe)、酪氨酸(y或tyr)、色氨酸(w或trp)；(还参见例如creighton(1984)《蛋白质(proteins)》，w.h.弗里曼出版社(w.h.freeman and company)；schulz和schimer(1979)，《蛋白质结构原理(principles of protein structure)》，施普林格出版社(springer-verlag))。本领域的技术人员将理解，上述鉴定的取代并不是唯一可能的保守取代。例如，为了一些目的，可以将所有带电荷的氨基酸视为彼此的保守取代，无论其是带正电荷还是带负电荷。另外，当待递送的蛋白质的三维结构和功能因在编码的序列中改变、增加或删除单个氨基酸或一小部分氨基酸的单个取代、删除或添加而保守时，此类变化也可以被视为“保守修饰的变化”。
66.可以理解的是，本文所描述的sacas9核酸酶变体可以在n端或c端处连接到肽或多肽。因此，另一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽含有本文所述的sacas9核酸酶变体中的任何一种变体以及与sacas9变体连接的一种或多种(多)肽。可以连接到sacas9变体的(多)肽的实施例包括但不限于标签(例如，6xhis标签、ha标签等)、核定位信号(nls)结构域、重组酶、转座酶等。
67.多核苷酸、载体、细胞、试剂盒
68.另一方面，本公开提供了编码本文所述的发明蛋白中的一种或多种蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，提供的多核苷酸用于表达本文所述的sacas9核酸酶变体。在一些实施方式中，所述多核苷酸用于在细胞中表达sacas9核酸酶变体，以用于细胞的基因组工程。在一些实施方式中，提供的多核苷酸用于本文所述的sacas9核酸酶变体的重组表达和纯化。在一些实施方式中，所述多核苷酸包括编码本文所述的任何sacas9核酸酶变体的序列和编码grna的一个或多个序列。
69.通常，“crispr-cas向导rna”或“向导rna”或grna是指引导crispr复合物序列特异性结合到靶序列的rna。在cas9核酸酶的上下文中，典型的向导rna包括：(i)与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交的向导序列，以及(ii)反式激活cr(tracr)配对序列。在一些实施方式中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，向导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定，其中所述算法的非限制性实施例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于burrows-wheeler变换的算法(例如burrows wheeler aligner)、clustalw、clustal x、blat、novoalign(novocraft科技公司(novocraft technologies))、eland(加利福尼亚州圣迭戈的依诺米那公司(illumina，san diego，calif.))、soap(可在soap.genomics.org.cn获得)和maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方式中，向导序列的长度为约或大于约5个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，向导序列的长度小于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、12个或更少的核苷酸。向导序列引导crispr复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可以通过本领域已知的任何合适的测定进行评估。例如，可以将足以形成crispr复合物的crispr系统的组分(包括待测试的向导序列)提供给具有对应靶序列的宿主细胞，如通过用编码crispr序列的组分的载体转染，然后评估靶序列内的优先切割。类似地，可以通过提供靶序列、crispr复合物的组分(包括待测试的向导序列)和不同于测试向导序列的对照向导序列
并比较在测试和对照向导序列反应之间在靶序列处的结合或切割速率来在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。
70.另一方面，本公开提供了载体，所述载体包括编码本文所述的任何sacas9核酸酶变体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的载体用于在细胞中进行基因组工程。在一些实施方式中，本文所述的载体用于sacas9核酸酶变体的重组表达和纯化。通常，所述载体包括编码sacas9核酸酶变体的序列，所述序列与启动子可操作地连接，使得sacas9核酸酶变体在宿主细胞中表达。在一些实施方式中，所述载体包括一个或多个编码本文所述的sacas9变体的序列和grna。在一些实施方式中，所述载体进一步包括待在靶位点处插入的供体序列或转基因。
71.另一方面，本公开提供了包括本文所述的多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，所述细胞用于本文提供的任何sacas9核酸酶变体的重组表达和纯化。所述细胞包括任何适合重组蛋白表达的细胞，例如，包括表达或能够表达本文所述的sacas9核酸酶变体的基因构建体的细胞(例如，已经用本文所述的一种或多种载体转化的细胞，或具有基因组修饰的细胞，例如从已并入细胞基因组中的等位基因表达本文提供的蛋白质的细胞)。用于转化细胞、基因地修饰细胞并且在此类细胞中表达基因和蛋白质的方法在本领域中是众所周知的，并且包括由例如green和sambrook，《分子克隆：实验室手册》(第4版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2012))和friedman和rossi，《基因转移：dna和rna的递送和表达：实验室手册(gene transfer：delivery and expression of dna and rna，a laboratory manual)》(第1版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2006))提供的那些方法。
72.另一方面，本公开提供了包括本文提供的sacas9核酸酶变体或编码所述变体的多核苷酸的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括用于表达本文所述的sacas9核酸酶变体的载体，其中所述载体包括编码本文提供的任何sacas9核酸酶变体的多核苷酸。在一些实施方式中，所述试剂盒包括细胞(例如任何适合表达sacas9核酸酶变体的细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞)，所述细胞包括用于表达本文提供的任何sacas9核酸酶变体的基因构建体。在一些实施方式中，本文提供的任何试剂盒进一步包括一种或多种grna和/或用于表达一种或多种grna的载体。在一些实施方式中，所述试剂盒包括赋形剂和用于使核酸酶与赋形剂接触以生成组合物的说明书，所述组合物适合于使核酸与核酸酶接触，使得发生与靶核酸的杂交和对靶核酸的切割。在一些实施方式中，所述组合物适合于将sacas9核酸酶变体递送给细胞。在一些实施方式中，所述组合物适合于将sacas9核酸酶变体递送给受试者。在一些实施方式中，所述赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
73.基因组工程的方法
74.另一方面，本公开提供了用于在细胞中进行基因组工程的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将有效量的本文所述的sacas9核酸酶变体引入细胞中。在一些实施方式中，sacas9核酸酶变体是通过使sacas9变体蛋白与细胞接触而引入细胞中的。在一些实施方式中，sacas9核酸酶变体是通过将载体引入细胞而被引入细胞中的，其中载体包括编码sacas9变体的多核苷酸。
75.常规的基于病毒和基于非病毒的基因转移方法可以用于在哺乳动物细胞、靶组织或单细胞胚胎中引入载体。此类方法可以用于将编码所述组合物的组分的核酸施用到培养中或宿主有机体体内的细胞中。非病毒载体递送系统包括dna质粒、rna(例如本文所述的载
体的转录物)、裸核酸和与递送媒剂(如脂质体)复合的核酸、与递送媒剂(如脂质体)复合的蛋白质。病毒载体递送系统包括dna病毒和rna病毒，在递送到细胞之后，所述dna病毒和所述rna病毒具有附加型基因组或整合型基因组。关于基因治疗程序的综述，参见anderson，《科学(science)》256：808-813(1992)；nabel和felgner，《生物技术趋势(tibtech)》11：211-217(1993)；mitani和caskey，《生物技术趋势》11：162-166(1993)；dillon，《生物技术趋势》11：167-175(1993)；miller，《自然(nature)》357：455-460(1992)；van brunt，《生物技术(biotechnology)》6(10)：1149-1154(1988)；vigne，《恢复性神经病学和神经科学(restorative neurology and neuroscience)》8：35-36(1995)；kremer和perricaudet，《英国医学公报(british medical bulletin)》51(1)：31-44(1995)；haddada等人，《当前微生物学和免疫学的话题(current topics in microbiology and immunology)》doerfler和bihm(编辑)(1995)；和yu等人，《基因疗法(gene therapy)》1：13-26(1994)。
76.核酸的非病毒递送方法包括脂质体转染、核转染、电穿孔、微注射、基因枪(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、人工病毒粒子和药剂增强的dna摄取。脂质体转染例如在美国专利第5,049,386号、第4,946,787号和第4,897,355号中进行了描述，并且脂质体转染试剂在市场上有售(例如，transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。适合于多核苷酸的高效受体识别脂质体转染的阳离子脂质和中性脂质包括feigner，wo 91/17424；wo 91/16024中的阳离子脂质和中性脂质。递送可以是向细胞(例如，体外施用或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。
77.包括靶向脂质体的脂质：核酸复合物，如免疫脂质复合物的制备是本领域技术人员众所周知的(参见例如crystal，《科学》270：404-410(1995)；blaese等人，《癌症基因疗法(cancer gene ther.)》2：291-297(1995)；behr等人，《生物缀合物化学(bioconjugate chem.)》5：382-389(1994)；remy等人，《生物缀合物化学》5：647-654(1994)；gao等人，《基因疗法》2：710-722(1995)；ahmad等人，《癌症研究(cancer res.)》52：4817-4820(1992)；美国专利第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号和第4,946,787号)。
78.微注射用于将dna、rna或肽递送到单细胞胚胎的细胞核和细胞质中。这对于本领域的技术人员来说是众所周知的(参见《操纵小鼠胚胎：实验室手册(manipulating the mouse embryo；a laboratory manual)》，第四版，2014)。
79.使用基于rna或dna病毒的系统来递送核酸利用了高度进化的过程来将病毒靶向到体内的特定细胞，并且将病毒有效负载运输到细胞核。病毒载体可以直接施用于患者(体内)，也可以用于治疗体外的细胞，并且经修饰的细胞可以任选地施用于患者(体内)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。通过逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以在宿主基因组中整合，通常会引起插入的转基因的长期表达。另外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
80.在一些实施方式中，通过本文所述的方法进行的基因组工程涉及位点特异性核酸(例如，dna)切割。在一些实施方式中，位点特异性核酸切割涉及使dna与本文描述的由向导rna介导的任何sacas9核酸酶变体进行接触。例如，在一些实施方式中，所述方法包括使dna与sacas9核酸酶变体接触，其中sacas9核酸酶变体结合与dna的区域杂交的grna。在一些实
施方式中，所述方法的在靶：脱靶切割比率比利用野生型sacas9核酸酶的方法的在靶：脱靶切割比率高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍、至少130倍、至少140倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍或至少250倍或更多倍。用于测定在靶：脱靶切割比率的方法是已知的，并且包括实施例中所述的方法。
81.在一些实施方式中，在本文所公开的方法中涉及的位点特异性核酸切割之后进行核酸的修饰，例如，删除、插入、倒位或易位。
82.在一些实施方式中，本文提供的基因组工程方法进一步涉及两种或更多种核酸的重组，以便将核酸序列插入靶核酸中。在一些实施方式中，基因组工程方法进一步包括向细胞中待在靶位点处插入的供体序列。在一些实施方式中，供体序列包括转基因。在一些实施方式中，供体序列与靶位点处的基因组序列同源，例如与侧接靶位点(例如在靶位点的约100个碱基或更少的碱基内，例如在约90个碱基内、约80个碱基内、约70个碱基内、约60个碱基内、约50个碱基内、约40个碱基内、约30个碱基内、约15个碱基内、约10个碱基内、约5个碱基内)或紧接地侧接靶位点的核苷酸序列1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％同源。在一些实施方式中，供体序列与靶核酸不具有任何同源性，例如与靶位点处的基因组序列不具有同源性。供体序列可以是任意长度，例如10个核苷酸或更多、50个核苷酸或更多、100个核苷酸或更多、250个核苷酸或更多、500个核苷酸或更多、1000个核苷酸或更多、5000个核苷酸或更多、10000个核苷酸或更多、100000个核苷酸或更多等。
83.通常，供体序列与其所替代或插入的靶序列不相同。在一些实施方式中，供体序列相对于靶序列(例如，靶基因组序列)含有至少一个或多个单碱基改变、插入、删除、倒位或重排。在一些实施方式中，供体序列还包括载体骨架，所述载体骨架含有与所关注的dna区不同源并且不打算插入所关注的dna区的序列。
84.与靶(例如，基因组)序列相比，供体序列可以包括某些序列差异，例如限制性位点、核苷酸多态性、可选择标记(例如，耐药基因、荧光蛋白、酶等)，所述序列差异可以用于评估供体序列在靶位点处的成功插入，或在一些情况下可以用于其它目的(例如，用于表示在靶向基因组基因座处的表达)。在一些实施方式中，如果定位于编码区中，则此类核苷酸序列差异将不会改变氨基酸序列，或将产生沉默氨基酸改变(例如，不影响蛋白质的结构或功能的改变)。
85.供体序列可以作为单链dna、单链rna、双链dna或双链rna提供给细胞。它可以以线性或环形形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，防止核酸外切溶解性降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3
′
端和/或将自互补寡核苷酸连接到一个或两个末端。参见例如chang等人，《美国国家科学院院刊》1987；84：4959-4963；makrides等人，《科学》.1996；272：886-889。在一些实施方式中，可以将供体序列作为载体分子的一部分引入细胞，所述载体分子具有另外的序列，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。在一些实施方式中，供体序列可以作为裸核酸、作为与如脂质体或泊咯沙姆等药剂复合的核酸引入，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、aav等)递送。
86.在一些实施方式中，本文所述的基因组工程方法是在细胞，例如细菌、酵母细胞或
哺乳动物细胞中进行的。在一些实施方式中，本文提供的基因组工程方法是在真核细胞中进行的。在一些实施方式中，所述基因组工程方法是在体外或离体的细胞或组织中进行的。在一些实施方式中，所述基因组工程方法是在个体，如患者或研究动物中进行的。在一些实施方式中，所述个体是人。
87.药物组合物
88.另一方面，本公开提供了一种包含本文所述的任何sacas9核酸酶变体的药物组合物。例如，一些实施方式提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的sacas9核酸酶变体或编码此变体的核酸以及药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的治疗活性物质。
89.在一些实施方式中，将本文提供的组合物施用于受试者，例如施用于人受试者，以在受试者体内实现靶向基因组修饰。在一些实施方式中，从受试者获得细胞，并且使所述细胞与sacas9核酸酶变体离体接触。在一些实施方式中，任选地在从受试者体内取出并与本发明的核酸酶变体离体接触的细胞中已实现或检测到期望的基因组修饰后，将所述细胞重新引入受试者体内。虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于施用于人类的药物组合物，但是本领域的技术人员将理解，此类组合物通常适合于施用于各种种类的动物。为了使适合于施用于人类的药物组合物适合于施用于各种动物，对所述组合物进行修饰是容易理解的，并且本领域技术的兽医药理学家可以利用仅常规的(如果有的话)实验来设计和/或执行此修饰。药物组合物所考虑施用于的受试者包括但不限于人和其它灵长类动物、哺乳动物、驯养动物、宠物和商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠、大鼠和鸟类，包括商业相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡。
90.本文所述的药物组合物的调配物可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂缔合，并且然后如果需要或期望，则将产物成形并包装成期望的单剂量或多剂量单位。
91.药物调配物可以另外地包含药学上可接受的赋形剂，如本文所使用的，所述赋形剂包括如适用于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。雷明顿的《药学科学与实践(the science and practice of pharmacy)》，第21版，a.r.gennaro(马里兰州巴尔的摩的利平科特
·
威廉斯和威尔金斯出版公司(lippincott，williams&wilkins，baltimore，md.)，2006；所述文献通过引用整体并入本文)公开了用于调配药物组合物的各种赋形剂和用于制备药物组合物的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与某种物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不期望的生物学作用或以其它有害的方式与药物组合物的任何其它组分进行相互作用，否则设想其使用将在本公开的范围内。
92.在一些实施方式中，根据本发明的组合物可以用于治疗各种疾病、病症和/或病状中的任何一种，包括但不限于以下中的一种或多种：自身免疫性病症(例如，糖尿病、狼疮、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎)；炎性病症(例如，关节炎、盆腔炎性疾病)；传染病(例如，病毒感染(例如，hiv、hcv、rsv)、细菌感染、真菌感染、脓毒症)；神经系统病症(例如，阿尔茨海默病(alzheimer
′
s disease)、亨廷顿病(huntington
′
s disease)；自闭症；杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy))；心血管病症(例如，动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血功能障碍、血管生成障碍，如黄斑病变)；增殖性病症(例如，癌症、良
性肿瘤)；呼吸病症(例如，慢性阻塞性肺病)；消化病症(例如，炎性肠病、溃疡)；肌肉骨骼病症(例如，纤维肌痛、关节炎)；内分泌、代谢和营养性病症(例如，糖尿病、骨质疏松症)；泌尿系统病症(例如，肾脏疾病)；心理病症(例如，抑郁症、精神分裂症)；皮肤病症(例如，伤口、湿疹)；血液和淋巴病症(例如，贫血、血友病)等。
93.本发明的这些和其它实施方式的功能和优点将从下面的实施例中得到更充分的理解。以下实施例旨在说明本发明的益处并描述特定的实施方式，但并不旨在对本发明的全部范围进行例示。因此，将理解的是这些实施例并不意味着限制本发明的范围。
94.实施例1
95.本实施例展示了具有提高的特异性的sacas9核酸酶变体的生成，其中所述变体具有阻断“r12-14开口”的突变。
96.通常，sacas9核酸酶采用21nt向导rna(grna)来引导核酸酶与其靶dna结合。通过对已发表的研究文章进行数据挖掘，本发明人注意到与在靶位点相比，大多数脱靶位点在位置12与位置14之间含有不匹配的碱基(位置1是pam序列nngrrt的5
′
的第1个核苷酸，图1)。根据晶体结构，此dna/rna复合体段面向sacas9的开口(图2)。由于非互补性的dna/rna碱基相对于互补性的碱基会使结构不太紧凑，所以减小sascas9的开口大小可以提高其特异性。本发明人分析了sacas9的结构，以鉴定位于grna核苷酸12-14附近的氨基酸残基。用具有较大侧链的残基取代这些残基可以提高酶的特异性。这些残基包括i445、l446、s447、y651、t316、s317、k248、y249、k482。最佳候选物是t316、s317、k482和k248，例如，t316y、s317y和k482w。
97.vegfa_8 grna(gggtgagtgagtgtgtgcgtg，seq id no：2)是一种已发表的有详尽的脱靶位点记录的grna，其被选择来评估不同sacas9变体的特异性。将34-bp的双链寡脱氧核苷酸(dsodn)用编码sacas9变体的质粒和grna质粒共转染。使用深度测序分析顶级脱靶位点的修饰。结果列于表1，这些变体显示出相当的在靶效率(野生型sacas9的63-84％)和较少的脱靶切割。
98.表1.针对vegfa_8 grna的在靶和脱靶的sacas9变体t316y、s317y和k482w的深度测序分析(列出了每个位点处的indel的％和dsodn整合的％，即indel％/dsodn整合％)
[0099][0100][0101]
实施例2
[0102]
本实施例展示了具有提高的特异性的sacas9核酸酶变体的生成，其中所述变体具有桥螺旋的突变。
[0103]
桥螺旋对r环的启动和稳定至关重要。经证实，桥螺旋中的精氨酸残基的突变会极大地影响酿脓性链球菌(streptococcus pyogenes)cas9(spcas9)的在靶活性和脱靶活性(bratovic m(2020)《自然化学生物学(nature chemical biology)》，16：587-592)。本发明人鉴定了桥螺旋与grna之间的所有氢键，进行了各个氨基酸取代以逐个去除每个氢键。该方法产生了两种特异性更高的sacas9变体，即n44a和r61a。
[0104]
评估过程与实施例1相同。如表2所示，与野生型sacas9相比，n44a和r61a都显示出相似的在靶活性和较低的脱靶编辑。
[0105]
表2.针对vegfa_8 grna的在靶和脱靶的sacas9变体n44a和r61a的深度测序分析。(列出了每个位点处的indel的％和dsodn整合的％，即indel％/dsodn整合％)
[0106]
sacas9wtn44ar61a在靶64.6/14.5750.5/11.8240.7/10.44ot10.06/0.060/00/0ot30.28/0.190/00/0ot40/00/00/0ot70/00/00/0ot100/00/00/0ot130/00/00/0ot160/00/00/0ot170/00/00/0ot200/00/00/0ot210.44/0.220.44/0.330/0
[0107]
实施例3
[0108]
本实施例展示了具有提高的特异性的带有突变的sacas9核酸酶变体的生成，其中所述变体的突变去除了sacas9与靶dna之间的氢键。
[0109]
本策略最初由j.keith joung小组使用spcas9证实(kleinstiver bp，(2016)，《自然》，529：490-495)。本方法聚焦于核酸酶与其靶dna之间的氢键。香港城市大学(city university of hong kong)的jiahai shi和zongli zheng小组测试了sacas9中的四个残基，并且发现一种被称为sacas9-hf的四重取代变体(n413a/n419a/r245a/r654a)显示出更高的特异性(tan y(2019)《美国国家科学院院刊(pnas)》116：20969-20976)。然而，已公布的数据有其局限性。首先，氢键是靶dna特异性的；sacas9-hf中描述的氨基酸取代可能对其它靶dna序列有不同的影响。其次，公布的四个残基并没有覆盖在晶体结构中sacas9与靶dna之间的所有氢键。第三，sacas9-hf显示出相对较低的在靶活性。本发明人评估了sacas9晶体结构中所有与靶dna显示氢键的残基，包括n120、t134、y230、r245、g391、t392、n413、n419、r654、d786、t787、y789、k815、y882、r1012、t1019和s1022。在这个列表中，与野生型sacas9相比，t392a显示出更好的特异性(参见表3)。三重突变n413a/n419a/r654a也显示出提高的特异性。
[0110]
表3.针对vegfa_8 grna的在靶和脱靶的sacas9变体t392a和n413a/n419a/r654a的深度测序分析。(列出了每个位点处的indel的％和dsodn整合的％，即indel％/dsodn整合％)
[0111]
sacas9wtt392awtn413a/n419a/r654a在靶71.02/7.1250.25/7.6864.6/14.5748.9/12.12ot10.65/0.10.44/0.060.06/0.060.09/0ot30.48/0.060.28/0.050.28/0.190/0ot40/00/00/00/0ot60/00/00/00/0ot70.11/0.050/00/00/0ot140/00/00/00/0ot150/00/00/00/0ot160/00/00/00/0ot170.06/00/00/00/0ot200/00/00/00/0ot210.85/0.410/00.44/0.220/0
[0112]
实施例4
[0113]
本实施例展示了具有提高的特异性的带有突变的sacas9核酸酶变体的生成，其中所述变体组合了选自权利要求的不同突变。
[0114]
如表4所示，与野生型sacas9相比，具有n44a/t316y、r61a/t316y、t316y/t392a、t316y/k482w、k482w/t392a和n413a/n419a/r654a/t316y处的组合突变的sacas9变体表现出提高的特异性。
[0115]
表4.针对vegfa_8 grna的在靶和脱靶的sacas9变体n44a/t316y、r61a/t316y、t316y/t392a、t316y/k482w、k482w/t392a和n413a/n419a/r654a/t316y的深度测序分析。(列出了每个位点处的indel的％和dsodn整合的％，即indel％/dsodn整合％)
[0116]

技术特征：
1.一种多肽，其包括金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)核酸酶的变体，其中所述变体包括与seq id no：1的至少70％的同一性和seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基(a)位于grna核苷酸12-14附近；(b)位于sacas9的桥螺旋中；或(c)与靶dna形成氢键。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的组的所述氨基酸残基处：n44、r61、n120、t134、y230、r245、k248、y249、t316、s317、g391、t392、n413、n419、i445、l446、s447、k482、y651、r654、d786、t787、y789、k815、y882、r1012、t1019和s1022。3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述变体包括seq id no：1的氨基酸残基处的至少一个突变，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：n44、r61、k248、t316、s317、t392、n413、n419、k482和r654。4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变选自：n44a、r61a、t316y、s317y、t392a、n413a、n419a、k482w和r654a。5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变选自：t316y、s317y和k482w。6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变是n44a或r61a。7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变是t392a，或者n413a、n419a和r654a的组合。8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述突变是(a)n44a和t316y的组合，或(b)r61a和t316y的组合，或(c)t316y和t392a的组合，或(d)t316y和k482w的组合，或(e)k482w和t392a的组合，或(f)n413a、n419a、r654a和t316y的组合。9.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的多肽。10.一种载体，其包括根据权利要求9所述的多核苷酸。11.根据权利要求10所述的载体，其是质粒载体或病毒载体。12.根据权利要求11所述的载体，其是慢病毒载体、逆转录病毒载体或aav载体。13.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至8中任一项所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，以及向导rna。14.根据权利要求13所述的试剂盒，其进一步包括包含转基因的供体dna。15.一种细胞，其包括用于表达根据权利要求1至7中任一项所述的多肽的载体。16.一种用于在细胞中进行基因组工程的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸引入所述细胞中。17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括将包括转基因的供体dna引入所述细胞中。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。19.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或人细胞。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是单细胞胚胎。

技术总结
本文公开了用于生成转基因细胞、组织、植物和动物的Cas核酸酶的变体、编码所述变体的多核苷酸、其组合物、表达载体和其使用方法。本发明的组合物、载体和方法还可用于基因疗法和细胞疗法技术。细胞疗法技术。


技术研发人员：张焕达 郑起
受保护的技术使用者：ASC治疗公司
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2023/7/22