肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统及其制备方法和应用

galnaz反应后膜表面表达叠氮基团；所述背包为蛋白纳米凝胶，是由细胞内治疗蛋白和穿孔肽通过二硫键交联而成，所述细胞内治疗蛋白选自颗粒酶b、细胞色素c，所述穿孔肽为gala，所述二硫键为双活性酯-双硫键交联剂(nhs-ss-hns)。
8.进一步地，所述肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，由颗粒酶b纳米凝胶通过点击化学利用苯甲酰亚胺键连接到叠氮化血小板膜表面制备得到。
9.所述的颗粒酶b纳米凝胶由颗粒酶b和穿孔肽gala通过二硫键nhs-ss-nhs交联合成。颗粒酶b是由自然杀伤细胞和效应t细胞分泌的一种赖氨酸激酶，可以诱导细胞的凋亡；所述gala是一种人工合成的由30个氨基酸组成的多肽，能够实现溶酶体逃逸；所述的叠氮化血小板是由血小板和udp-galnaz孵育后收集而得。
10.所述颗粒酶b纳米凝胶中各组分及摩尔配比为：颗粒酶b:gala＝1:(0-0.08)，优选摩尔比为：颗粒酶b:gala＝1:0.06；颗粒酶b与nhs-ss-nhs的摩尔比为：颗粒酶b:nhs-ss-nhs＝1:15。
11.所述的叠氮化血小板是由血小板与1.2mm udp-galnaz孵育60min后收集而得。
12.所述的苯甲酰亚胺酸敏感键由苯甲醛-聚乙二醇2000-活性酯(benzaldehyde-peg2000-nhs ester,简称bd-peg2000-nhs)与sulfo dbco-peg4-amine反应而成。
13.所述的颗粒酶b纳米粒与叠氮化血小板连接过程为先将颗粒酶b纳米凝胶与摩尔量100倍的bd-peg2000-nhs反应，再与摩尔量100倍的sulfo dbco-peg4-amine反应，最后与叠氮化血小板混合搅拌反应。
14.所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)按颗粒酶b纳米凝胶组分摩尔配比：颗粒酶b:gala:nhs-ss-nhs＝1:(0-0.08):15，备料；
16.(2)将颗粒酶b、gala和nhs-ss-nhs分别溶解于试剂或有机溶剂中，充分搅拌，获得颗粒酶b纳米凝胶；
17.(3)颗粒酶b纳米凝胶与摩尔量100倍的bd-peg2000-nhs于试剂中反应后，去除多余bd-peg2000-nhs，再与摩尔量100倍的sulfo dbco-peg4-amine于缓冲液中反应，使颗粒酶b一端连有dbco(二苯并环辛炔)；
18.(4)富含血小板的血浆与1.2mm udp-galnaz在37℃条件下孵育60min后，离心提取血小板，获得膜表面修饰叠氮的血小板；
19.(5)步骤(3)中制得的颗粒酶b纳米凝胶与bd-peg2000-nhs、sulfo dbco-peg4-amine的反应产物与步骤(4)中制得的叠氮化血小板在室温搅拌12-24h，获得血小板颗粒酶b背包系统。
20.所述的步骤(2)中，有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)，试剂为pbs。
21.所述的步骤(2)中，制得的颗粒酶b纳米凝胶为球状，平均粒径为110nm。
22.所述的步骤(3)中，颗粒酶b纳米凝胶与bd-peg2000-nhs反应条件为室温反应2-3h，与sulfo dbco-peg4-amine反应条件为室温缓慢搅拌3-4h，试剂为pbs，缓冲液为0.01m柠檬酸缓冲液(ph 6.0)。
23.所述的步骤(4)中，培养基中加入1μm pge e1，抑制血小板活化。
24.所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统在细胞内治疗蛋白药物递
送领域的应用。
25.所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，所述的黑色素瘤药物靶向b16-f10细胞。
26.本发明具有以下有益效果：
27.(1)本发明制备了粒径均匀颗粒酶b纳米凝胶，制备方法简单高效，稳定性好，实现了颗粒酶b高效包载。
28.(2)所制备的肿瘤微环境响应性血小板背包系统载药量高、能够微环境响应性释药、可以增强蛋白药物的摄取和肿瘤深部渗透，进而增强了抗肿瘤的活性。
29.(3)研究了肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统在肿瘤微环境的释药情况，蛋白凝胶在肿瘤组织中的渗透，蛋白凝胶在溶酶体的逃逸表现，以及对术后肿瘤生长的抑制作用。进行了血小板递送细胞的制剂表征、酸响应背包释放行为检测、纳米药物还原释放行为检测、血小板制剂粘附实验、蛋白凝胶溶酶体逃逸实验、诱导细胞凋亡实验、肿瘤球实验，以及动物体内的药效学考察。结果表明，肿瘤微环境响应性血小板背包系统不会破坏血小板的正常生理功能，可以在肿瘤微酸性环境可控智能的释药，增强了蛋白凝胶的摄取以及肿瘤渗透能力，能够有效地逃离溶酶体快速诱导细胞凋亡的发生，显著抑制了局部切除手术后肿瘤的复发。为解决血小板递送细胞治疗效果差，无法控制释药的瓶颈提供了新的策略和更多的选择，满足了临床中对高效化疗制剂的迫切需求。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中颗粒酶b纳米凝胶的制备实验图。
31.a：gala-gngs的透射电镜显微镜图。
32.b：gngs与gala-gngs的圆二色谱图。
33.c：两种蛋白凝胶的包封率。
34.d：不同gala含量的纳米凝胶处理48h后的b16-f10细胞存活率。
35.图2为本发明实施例2中血小板叠氮化实验图。
36.a：与1.2mm udp-galnaz孵育60min后，血小板与dbco-cy5孵育1h后的共聚焦图像。
37.b：与1.2mm udp-galnaz孵育60min后，血小板与dbco-cy5孵育1h后的流式分析图。
38.c：与1.2mm udp-galnaz孵育不同时间后的血小板活力。
39.d：新鲜血小板与udp-galnaz处理后的血小板透射电镜显微镜图。
40.图3为本发明实施例3中血小板背包系统的特征检测图。
41.a：gala-cngs-p的扫描电镜电镜图。
42.b：platelets、n
3-platelets和gala-gngs-p的sds-page凝胶电泳结果图。
43.c：platelets、n
3-platelets和gala-gngs-p的特征性蛋白western blotting检测图。
44.d：gala-cngs-p的流式荧光强度分析图。
45.e：gala-cngs-p的共聚焦荧光定位结果图。
46.图4为本发明实施例4中血小板背包系统的体外释放检测图。
47.a：gala-cngs-p中细胞色素c在不同gsh条件下的释放动力学结果图。
48.b：cy5-p中cy5在不同ph条件下的释放动力学结果图。
blotting检测图。
具体实施方式
78.实施例1：颗粒酶b纳米凝胶及细胞色素纳米凝胶的制备与筛选
79.将溶解在dmso中的nhs-ss-nhs添加到颗粒酶b(grb)的pbs中溶液中，nhs-ss-nhs/grb摩尔比为15:1，然后将上述反应物旋转30min。向上述反应液中添加grb摩尔量的2％、4％、6％、8％的gala(即grb:gala摩尔比依次为1:0.02,1:0.04,1:0.06,1:0.08)，用以将gala引入ngs(纳米凝胶)，反应得到的颗粒酶b纳米凝胶依次缩写为gala2-gngs、gala4-gngs、gala6-gngs、gala8-gngs。在离心过滤管中采用pbs洗涤纯化所得的颗粒酶b纳米凝胶3次(截留分子量＝100kda)。
80.以相同的nhs-ss-nhs/细胞色素c＝15:1的摩尔比制备细胞色素c(cc)纳米凝胶(gala-cngs)。另，采用上述方法制备没有引入gala的颗粒酶b纳米凝胶(gngs)和没有引入gala的细胞色素c纳米凝胶(cngs)，与gala-gngs、gala-cngs的区别在于，制备过程中不引入gala。
81.使用micro bca蛋白试剂盒测量gala的包封率。按照现有技术的方法，将颗粒酶b用fitc标记(fitc-grb)，并以不同浓度的fitc-grb的荧光强度绘制一条标准曲线，从而计算出gala-gngs中grb的包封率。同理，以不同浓度的cc的紫外吸收绘制一条标准曲线，从而计算出gala-cngs中cc的包封率。用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测定gala-cngs和gala-gngs的包封效率。计算公式如下：制剂包封率(％)＝(被包载的药物质量)/(总的药物质量)
×
100％(图1c)。
82.使用tem透射电镜观察gala8-gngs的形貌特征，如图1a所示，纳米粒子的形貌为类球型，平均粒径为110nm，证明了颗粒酶b纳米凝胶的成功制备。gala是一种成孔肽，可在酸性ph(《6)下从无规卷曲结构转化为α-螺旋，促进药物的溶酶体逃逸。使用圆二色谱(cd)确定gala是否成功连接在蛋白纳米凝胶上，如图1b所示，gngs在ph 7.4和ph5.0下都显示出相似的cd光谱。然而与ph 7.4相比，gala-gngs在ph 5.0时显示出相对更强的负最大值，表明gala的结构在ph 5.0时从无规卷曲变为α-螺旋，这些结果表明gala肽成功地连接到蛋白质ngs。
83.通过mtt实验进行制剂筛选。将b16-f10细胞(2000个细胞/孔)接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内，贴壁培养12h，弃去旧的培养液，加入不同gala比例的gala-gngs(gala0-gngs，gala2-gngs，gala4-gngs，gala6-gngs，gala8-gngs)培养基，继续于37℃二氧化碳细胞培养箱内中孵育48h。每孔加入0.5mg/ml的mtt孵育4h，弃掉培养基后加入200μl二甲基亚砜，振荡10min，用多功能酶标仪测量490nm波长处的吸光度，如图1d所示，gala6-gngs表现出最强的细胞毒性，因此选择grb:gala＝1:0.06为最终处方，以下实施例中均采用grb:gala＝1:0.06制备gala6-gngs，并简述为gala-gngs，同样使用相同的蛋白与gala的摩尔比制备细胞色素c纳米凝胶gala6-cngs，并简述为gala-cngs。
84.实施例2：血小板表面修饰叠氮基团
85.为了将叠氮化物基团修饰到血小板膜上，小鼠富含血小板的血浆(prp)通过用udp-galnaz处理进行半乳糖基化，简而言之，小鼠prp通过200g离心4min从健康小鼠全血中获得，并与1.2mm udp-galnaz在37℃下孵育60min。孵育后，通过以800g离心10min收集叠氮
化物标记的血小板(n
3-血小板)。将n
3-血小板与dio一起孵育并用dpbs冲洗2次，然后在37℃下用dbco-cy5(20μm)处理血小板1h，然后再用dpbs冲洗3次。最后，将血小板悬浮在1ml pbs中并放入共聚焦培养皿中，用共聚焦显微镜(tcs sp2/aobs,leica,germany)和流式细胞仪(bd facscalibur)考察血小板叠氮是否成功，如图2a、2b所示，udp-galnaz处理的血小板显示出比未处理的血小板更高的cy5荧光强度，表明叠氮化物基团成功修饰在udp-galnaz处理的血小板的表面上。此外，如图2d所示3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt)测定表明，血小板在与1.2mm udp-galnaz共孵育超过1h，血小板的活力并未受到明显影响，表明血小板的活力不受酶促半乳糖基化的影响。同样血小板在叠氮前后形态并未改变(图2c)。
86.实施例3：肿瘤微环境响应性的生物工程化血小板背包系统(gala-gngs-p)的制备和表征
87.将健康小鼠全血在200g转速下，离心4min分离出富含血小板的血浆。将1.2mm udp-galnaz添加到小鼠富含血小板的血浆中37℃孵育1min，然后将上清液重悬在含有前列腺素e1(pge1,1μm)的柠檬酸-柠檬酸盐-葡萄糖缓冲液中，并在800转速下离心混合物10min得到膜表面修饰叠氮的血小板(n
3-血小板)。随后，为了将gala-gngs与血小板连接，将gala-gngs与摩尔量100倍的bd-peg2000-nhs轻轻旋转2h，并通过离心过滤装置在10000g条件下离心20h去除未处理的bd-peg2000-nhs。然后将所得的反应物与摩尔量100倍的suflo dbco-peg4-amine在室温下再反应3h(即纳米粒与连接键的摩尔比为纳米粒:bd-peg2000-nhs:sulfo dbco-peg4-amine＝1:100:100)，并通过离心过滤装置纯化产物，然后悬浮在pbs中。最后，将n
3-血小板和gala-gngs在含有tyrode缓冲液pge1(pge1，1μm)的pbs中轻轻搅拌12h，制得gala-gngs-p。用离心装置收集gala-gngs-p并洗涤3次。分别将叠氮化血小板与一端修饰dbco的gala-cngs、cngs、cy5-nh2连接，分别命名为gala-cngs-p、cngs-p和cy5-p。
88.为了验证gala-gngs与n
3-血小板的成功连接，在脱水后使用扫描电子显微镜(sem)对所得物的形态进行成像。sem图像表明gala-gngs通过苯甲酰亚胺键成功连接在n
3-血小板上(图3a)。此外，选择fitc标记的细胞色素c背包(fitc-gala-cngs)来证明叠氮化血小板与一端连有dbco的gala-cngs的成功连接(图3e)。
89.流式细胞术分析(图3d)表明与初始血小板相比，叠氮化血小板在与fitc-gala-cngs反应后显示出更强的fitc荧光强度，同样共聚焦图像(图3e)也证明了dir标记的n
3-血小板与fitc-gala-cngs的荧光共定位，证明了gala-cngs和n
3-血小板之间的成功连接。
90.采用sds-page凝胶电泳观察gala-gngs-p的表达情况。简而言之，将血小板、n
3-血小板和gala-gngs-p用ripa蛋白裂解液冰上裂解15min后，在12000r/min的条件下离心10min，收集上清液并用bca蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。然后上述样品分别在sds-page凝胶中分离蛋白质并用考马斯蓝染色进行可视化。由图3b可知，gala-gngs-p和叠氮化血小板并没有影响血小板蛋白的表达情况。不仅如此，在凝胶电泳后，将所有蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。在5％脱脂牛奶中封闭2h后，将相应的条带与cd41、cd61、cd62p一抗在4℃下孵育过夜。最后，每条条带用tbst洗涤3次后，在室温下与二抗孵育2h。结果发现gala-gngs-p和叠氮化血小板并不会影响这三种血小板重要蛋白的表达(图3c)。
91.实施例4：对gala-cngs-p、gala-gngs-p、cy5-p的体外释放实验
92.为确定蛋白质纳米凝胶的释放动力学，将制得的gala-cngs-p、gala-gngs-p分散在含或不含5μm gsh的pbs中，在37℃摇床中摇晃，在不同时间间隔移取1/5的透析液，并更换相同体积的介质，用多功能酶标仪分析，计算释放蛋白浓度。由于细胞质中的高gsh浓度，nhs-ss-nhs连接键将被切割并导致蛋白的释放。正如预期的那样，如图所示(图4a)，在生理条件下2h内释放cc的含量小于10％，而在5mm gsh下2h内释放超过90％的cc。此外，释放的grb显示出与天然grb相似的圆二色光谱(图4c)，表明grb在形成蛋白质ngs和分解后保留了它们的二级结构。
93.为了测量苯甲酰亚胺键在不同ph条件下的断裂情况，将gala-gngs替换为cy5-nh2并与n3-血小板连接，制得cy5-p。然后将cy5-p置于ph6.5或ph7.4 pbs释放介质中，以不同的时间间隔移取透析液1/5，然后更换相同体积的介质。最后，用酶标仪测量释放的cy5的浓度。发现cy5在ph 6.5下比在ph 7.4下释放得更快，说明微酸性tme有利于苯甲酰亚胺键的断裂(图4b)。
94.实施例5：gala-gngs-p的体外粘附实验
95.将b16-f10细胞(5
×
104细胞)在共聚焦培养皿中于37℃培养过夜，然后用新鲜培养基替换细胞并在4℃放置20min。制备新鲜血小板和gala-gngs-p并用dir标记，然后将两者分别添加到各自的共聚焦培养皿中，在4℃下放置1h。然后将b16-f10细胞与4％多聚甲醛孵育10min。固定后，使用hoechst 33342对细胞核进行染色。通过clsm观察gala-gngs-p与b16-f10细胞的粘附，并用imagej软件分析荧光强度。如图5a所示，dir标记的血小板或dir标记的gala-gngs-p均成功附着于b16-f10细胞，在4℃共孵育1h后未观察到差异，表明连接的gala-gngs-p不影响血小板的生理活性。此外，gala-gngs-p与纯血小板的荧光强度无明显差异(图5b)。
96.实施例6：gala-cngs-p的体外摄取实验
97.用fitc给细胞色素c(cc)标记荧光制备fitc-cc。将b16-f10细胞(2
×
104细胞/孔)接种于24孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内贴壁培养24h。弃去旧的培养液，加入含有fitc-cc、fitc-cngs-p、fitc-gala-cngs-p的ph 6.5的培养基，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中分别孵育4h和8h。孵育结束后，弃去含药培养液，加入4℃的pbs(ph 7.4)清洗3次，终止细胞摄取过程。细胞用4％多聚甲醛固定10min，并在37℃条件下用hoechst 33342对细胞核染色10min，取出爬片，置于滴有防淬灭封片液的载玻片上。将载玻片取出于共聚焦显微镜下观察细胞内的绿色药物荧光。对于细胞摄取的流式定量分析，用24孔板进行培养，给药后，用0.05％胰酶将细胞消化下来，离心收集细胞，将其均匀分散于pbs(ph 7.4)后，用流式细胞仪定量分析细胞摄取情况。用共聚焦显微镜观察药物的摄取情况，如图6所示，fitc-gala-cngs-p组在孵育4h和8h后显示出明显比fitc-cngs-p组更亮的荧光，表明gala的存在增加了蛋白质ngs的细胞间运输能力，而相比之下，用游离fitc-cc处理的b16-f10细胞显示出最弱的fitc荧光，表明蛋白质ngs结构增加了细胞对蛋白质的摄取。
98.实施例7：gala-cngs-p的溶酶体逃逸实验
99.将b16-f10细胞(2
×
104细胞/孔)接种于24孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内贴壁培养24h。弃去旧的培养液，加入含有fitc-cngs-p、fitc-gala-gngs-p的ph 6.5的培养基，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中分别孵育4h和8h。孵育结束后，弃去含药培养液，加入4℃的pbs(ph 7.4)清洗3次，终止细胞摄取过程。用lysotracker red对溶酶体染色后，加
入4℃的pbs(ph 7.4)清洗3次，加入细胞用4％多聚甲醛固定10min，并37℃条件下用hoechst 33342对细胞核染色10min，取出爬片，置于滴有防淬灭封片液的载玻片上。将载玻片取出于共聚焦显微镜下观察细胞内的红色和绿色荧光。如在图7所示，孵育8h后，在fitc-gala-cngs-p处理的b16-f10细胞中绝大多数fitc-cc被递送到细胞质，而当用fitc-cngs-p处理时，发现绿色荧光与红色荧光大量共定位，证明将gala多肽增强了细胞色素c纳米凝胶的内体逃逸能力。
100.实施例8：gala-gngs-p的细胞毒实验
101.将b16-f10细胞(2000个细胞/孔)接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内培养12h。弃去旧的培养液，加入系列梯度浓度(grb：0.005μg/ml,0.010μg/ml,0.050μg/ml,0.1μg/ml,0.2μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml)的含有游离grb溶液、gngs纳米凝胶、gala-gngs纳米凝胶、gala-gngs-p的ph 7.4或ph 6.5培养基，继续于37℃二氧化碳细胞培养箱内孵育48h。每孔加入0.5mg/ml的mtt孵育4h，弃掉培养基后加入200μl二甲基亚砜，振荡10min，用多功能酶标仪测量490nm波长处的吸光度。如图8a所示，我们可以观察到gala-gngs组和ph 6.5时的gala-gngs-p表现出相似的抑制作用，ic
50
值分别为0.198μg/ml和0.224μg/ml，表明苯甲酰亚胺键在低ph条件发生断裂释放蛋白质ngs。与gala-gngs相比，gngs处理的b16-f10细胞的抑制作用显着降低，表明gala多肽有利于颗粒酶b凝胶从溶酶体中逸出以增强抑制作用。相比之下，正常的ph 7.4条件阻碍了蛋白质ngs的释放，导致更高的ic
50
(0.886μg/ml)。而游离grb对b16-f10细胞的毒性可忽略不计。b16-f10细胞在经不同配方处理后，使用calcein-am/pi double stain kit(solarbio)对活细胞和死细胞进行染色，发现gala-gngs组和ph 6.5时的gala-gngs-p表现出相似的细胞杀伤效果(图8b)。
102.实施例9：gala-gngs-p的凋亡实验
103.将b16-f10细胞(1
×
105细胞/孔)接种于6孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内贴壁培养24h。弃去旧的培养液，分别加入pbs、含有游离grb、gngs、gala-gngs、gala-gngs-p的ph 7.4或ph 6.5培养基，grb浓度为50mg/ml。然后用胰蛋白酶消化b16-f10细胞，重悬于缓冲液中，然后加入5μl annexin v-fitc和5μl pi。通过流式细胞仪分析结果。与预期一致，如图9a和9b所示，gala-gngs对b16-f10细胞的凋亡率最高，为52.3％，这与ph 6.5时的gala-gngs-p相似(51.1％)。同样，将b16-f10细胞(1
×
105细胞/孔)接种于6孔板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱内贴壁培养24h。弃去旧的培养液，分别加入pbs、含有游离grb、gngs、gala-gngs、gala-gngs-p的ph 7.4或ph 6.5培养基，grb浓度为50mg/ml。然后用胰蛋白酶消化b16-f10细胞，用ripa裂解液裂解细胞冰上裂解15min后，在12000r/min的条件下离心10min，收集上清液并用bca蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。在凝胶电泳后，将各组所有蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。在5％脱脂牛奶中封闭2h后，将相应的条带与caspase-3，caspase-9，ripa，gtbid，bax一抗在4℃下孵育过夜。最后，每条条带用tbst洗涤3次后，在室温下与二抗(hrp山羊抗兔)孵育2h。结果发现ph 6.5的gala-gngs-p和gala-gngs切割前半胱天冬酶并产生更多活性半胱天冬酶，以及增强的bax和gtbid表达，协同导致细胞凋亡(图9c)。总的来说，这些证据表明，引入酸敏感键和gala有利于纳米凝胶在tme中的释放，并增强了对肿瘤细胞的抑制作用。
104.实施例10：gala-cngs-p的肿瘤渗透考察
105.将1
×
104个b16-f10细胞分散到15μl的细胞培养基中，接种于含有琼脂糖的96孔
板中每2天换新的培养液，第6天加入含有gala-cngs-p的ph 7.4和ph 6.5培养液，置于37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育24h。而后弃去旧的培养液，清洗细胞球，于共聚焦显微镜下通过z轴扫描，以40μm扫描间隔观察药物渗透情况。在ph 6.5的gala-cngs-p组中，在肿瘤部发现fitc-cc，而在ph 7.4的gala-cngs-p组中，仅3d肿瘤球体的外围时显示出显着暗淡的荧光(图10a和10b)，这意味着微酸性条件增强了蛋白质ngs从血小板中的释放，而纳米级尺寸的gala-cngs促进了瘤内迁移。
106.实施例11：gala-gngs-p的组织分布探究
107.将生长状态良好的b16-f10细胞经0.05％胰酶消化后，重新均匀分散于pbs(ph 7.4)中，浓度为5
×
107个/ml。取100μl上述细胞悬液注射于雌性c57小鼠右后侧腰腹部皮下。待小鼠黑色素瘤(b16-f10)异位瘤小鼠模型的肿瘤体积长至约300mm3时，通过尾静脉注射给予dir标记的血小板和gala-gngs-p，dir等效给药剂量为1mg/kg。在2、4、6、12、24和48h静脉注射后，将小鼠麻醉并使用小动物成像系统进行活体成像。注射24h后处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等器官，进行离体组织荧光成像。如图11a所示，与游离dir相比，dir标记的gala-gngs-p在肿瘤中具有更高的荧光强度。在注射后6h观察到dir的最高积累并保持在48h内，这表明gala-gngs-p具有很强的肿瘤靶向能力。然后我们对携带b16-f10的小鼠实施安乐死，并在6h和48h收集残留的肿瘤和主要器官进行荧光成像。用dir标记的gala-gngs-p处理的小鼠在注射后6h或48h显示出肿瘤的高荧光强度，分别比用游离dir给药的小鼠高14.8倍或11.5倍(图11b和11c)。
108.实施例12：gala-gngs-p的药效学检测
109.建立c57小鼠(4-5周周龄，平均体重18-22g)皮下异位黑色素瘤(b16-f10-luc)模型，待第10天荷瘤鼠身上的肿瘤体积长至500mm3时，将其随机分成6组，每组6只。将每只鼠的肿瘤切除剩余1％，并用伤口夹夹住手术部位，同时立即尾静脉注射生理盐水、游离grb、gngs、gala-gngs，gala-gngs与血小板物理混合物(gala-gngs+p)和gala-gngs-p，grb等效给药剂量为3.17mm/kg，并在第13、16、19天连续尾静脉注各制剂。开始给药后，每天测量荷瘤鼠的肿瘤大小和体重，绘制体重随时间的变化曲线，评价给药后荷瘤鼠的体重变化。结果如图12a和12b所示，gala-gngs-p处理的小鼠显示出最轻微的肿瘤复发，而在用gala-gng或gala-gngs+p处理的小鼠中，肿瘤的生长依旧迅速，说明生物工程血小板具有很强的肿瘤靶向能力。与gala-gngs相比，gala-gngs+p没有增加治疗效果。此外，gngs的治疗效果比gala-gngs差，这进一步证明了在蛋白质ngs中负载gala可以增强抗肿瘤复发。值得注意的是，用gala-gngs-p处理的小鼠显示出更长的寿命并且体重没有异常变化(图12c和12d)。
110.同属建立c57小鼠(4-5周周龄，平均体重18-22g)皮下异位黑色素瘤(b16-f10)模型，待第10天荷瘤鼠身上的肿瘤体积长至500mm3左右时，将其随机分成6组，每组6只。将每只鼠的肿瘤切除剩余1％，并用伤口夹夹住手术部位，同时立即尾静脉注射生理盐水、游离grb、gngs、gala-gngs，gala-gngs与血小板物理混合物和gala-gngs-p,grb等效给药剂量为3.17mm/kg，并在第13、16、19天连续尾静脉注各制剂。在第22天处死小鼠，剥离复发肿瘤组织，拍照并对其称重，gala-gngs-p制剂组能够有效地抑制肿瘤的复发(图12e和12f)。将称重后的肿瘤组织用4％多聚甲醛进行固定，并进行肿瘤组织切片，用h&e染色评价组织形态学，将石蜡切片用二甲苯和系列浓度的乙醇溶液进行脱蜡，使用tunel凋亡检测试剂盒和ki67细胞增殖检测试剂盒对肿瘤组织切片进行染色，并用共聚焦显微镜进行拍照。同时，复
发肿瘤组织依照上面描述处理收集全部蛋白。结果如图12g所示，另外h&e染色、ki 67染色、以及tunel染色的结果表明，gala-gngs-p可以引起广泛的细胞凋亡、抑制了肿瘤的复发；同样蛋白印迹实验也证明gala-gngs-p可以通过诱导凋亡相关蛋白的产生来促进凋亡行为(图13)。

技术特征：
1.一种肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，其特征在于，所述肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统通过酸敏感键将蛋白纳米凝胶与生物工程化血小板连接，酸敏感键在肿瘤的微酸环境下发生断裂，实现可控地响应性释药；所述生物工程化血小板是血小板与叠氮试剂反应后膜表面表达叠氮基团的叠氮化血小板；所述背包为蛋白纳米凝胶，是由细胞内治疗蛋白和穿孔肽通过二硫键交联而成，所述细胞内治疗蛋白选自颗粒酶b、细胞色素c，所述穿孔肽为gala，所述二硫键为nhs-ss-nhs。2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，其特征在于，所述肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，由颗粒酶b纳米凝胶通过苯甲酰亚胺键连接到叠氮化血小板膜表面制备得到；所述的颗粒酶b纳米凝胶由颗粒酶b和gala通过nhs-ss-nhs交联合成；所述的叠氮化血小板是由血小板和udp-galnaz孵育后收集而得。3.根据权利要求2所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，其特征在于，所述颗粒酶b纳米凝胶中各组分及摩尔配比为：颗粒酶b:gala＝1:(0-0.08)；颗粒酶b与nhs-ss-nhs的摩尔比为：颗粒酶b:nhs-ss-nhs＝1:15；所述的叠氮化血小板是由血小板与1.2mm udp-galnaz孵育60min后收集而得；所述的苯甲酰亚胺键由bd-peg2000-nhs与sulfo dbco-peg4-amine反应而成。4.根据权利要求3所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统，其特征在于，颗粒酶b与gala摩尔比为1:0.06。5.一种权利要求1-4任一项所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)按颗粒酶b纳米凝胶组分摩尔配比：颗粒酶b:gala:nhs-ss-nhs＝1:(0-0.08):15，备料；(2)将颗粒酶b、gala和nhs-ss-nhs分别溶解于试剂或有机溶剂中，充分搅拌，获得颗粒酶b纳米凝胶；(3)颗粒酶b纳米凝胶与bd-peg2000-nhs于试剂中反应后，去除多余bd-peg2000-nhs，再与sulfo dbco-peg4-amine于缓冲液中反应，使颗粒酶b一端连有dbco；(4)富含血小板的血浆与1.2mm udp-galnaz在37℃条件下孵育后，离心提取血小板，获得膜表面修饰叠氮的血小板；(5)步骤(3)中制得的颗粒酶b纳米凝胶与bd-peg2000-nhs、sulfo dbco-peg4-amine的反应产物与步骤(4)中制得的叠氮化血小板在室温搅拌获得血小板颗粒酶b背包系统。6.根据权利要求5所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，制得的颗粒酶b纳米凝胶为球状，平均粒径为110nm。7.根据权利要求5所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，颗粒酶b纳米凝胶与bd-peg2000-nhs反应条件为室温反应2-3h，与sulfo dbco-peg4-amine反应条件为室温缓慢搅拌3-4h，试剂为pbs，缓冲液为ph 6.0的0.01m柠檬酸缓冲液。8.根据权利要求5所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，培养基中加入1μm pge e1，抑制血小板活化。9.一种权利要求1-4任一项所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统在细胞内治疗蛋白药物递送领域的应用。
10.一种权利要求1-4任一项所述的肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，所述的黑色素瘤药物靶向b16-f10细胞。

技术总结
肿瘤微环境响应性生物工程化血小板背包系统及其制备方法和应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域，该肿瘤微环境响应性血小板系统可以在肿瘤微酸环境中断裂酸敏感连接键释放颗粒酶B背包，纳米级的尺寸有利于肿瘤细胞对蛋白的摄取，也增强了蛋白向肿瘤深部递送的能力。GALA的引入增强了纳米凝胶的溶酶体逃逸能力，而在高浓度谷胱甘肽的肿瘤细胞质环境中，纳米凝胶的二硫键断裂，释放颗粒酶B从而引起细胞凋亡。本发明为解决血小板递送系统载药量低，微环境智能释药能力差等瓶颈提供了新的策略和更多的选择，满足了临床中对高效化疗制剂的迫切需求。的迫切需求。


技术研发人员：孙进 王开元 范孝园 何仲贵 路奇 卢雨彤 刘凤祥
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：2022.07.19
技术公布日：2023/7/22