一种菌剂及其用途以及基于该菌剂的植物酸奶的制作方法

1.本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种菌剂及其用途以及基于该菌剂的植物酸奶。


背景技术：

2.植物酸奶为以含有一定蛋白质的植物和（或）其制品为原料，经杀菌、发酵后ph降低，发酵前或发酵后添加或不添加非动物来源配料，加工制成的植物蛋白饮料产品，包括活菌型产品。植物基酸奶作为酸奶的一种新品类，因其低脂肪，高蛋白，富含膳食纤维，且适合乳糖不耐症人群饮用等优势，越来越受到消费者的广泛喜爱。
3.据市场调查数据显示，2018年全球植物基酸奶市场规模为9.74亿美元，2018-2023年全球复合增长率高达17.8%，而中国消费者对植物基酸奶普遍接受程度不高，市场规模几乎空白，尚未诞生在消费者中有广泛知名度的领导性品牌。
4.植物酸奶通常以大豆、坚果、椰汁、红豆等其他豆类为原料进行发酵，蛋白质含量可达牛奶酸奶水平，同时植物酸奶还具有富含膳食纤维，饱和脂肪酸含量低，不饱和脂肪酸含量高，不含乳糖和不含胆固醇等优势，相对更健康，更适合乳糖不耐人群和减肥人群。但是植物酸奶常有豆腥味、酸馊味和苦味等问题，这不仅受酸奶原料配方和制备方法的影响，更受其发酵剂的影响。
5.目前市场上的酸奶发酵剂多为针对动物乳源底物，针对植物基底物的发酵剂较为少见。这是因为生产酸奶用的菌株均为乳酸菌，乳酸菌主要利用牛乳中的乳糖进行同型发酵或者异型发酵，发酵产生乳酸和其他物质，赋予酸奶独特的风味。而纯植物蛋白如大豆蛋白体系中，由于缺乏乳糖等可促进乳酸菌生长的营养因子，发酵过程中会出现发酵速度慢以及产酸不足等问题，导致在植物酸奶生产中出现发酵时间长和风味不足等现象。对此，人们也进行了多方位的研究，例如：
6.引用文献1公开了一种促进植物酸奶发酵的方法及其应用，该植物酸奶添加玉米浆加入发酵原料，有较好的促进凝乳和提升风味的效果，解决了植物酸奶因缺乏乳糖不易起酵的问题，同时在制备的过程中添加有酵母抽提物，可进一步加速植物酸奶发酵，将发酵时间减少2到5h，降低成本和减少污染风险。
7.引用文献2公开了一种新型植物基酸奶及其制备方法，新型植物基酸奶由以下原料组成：速溶豆粉、白砂糖、可溶性大豆多糖、异麦芽酮糖、净化水、乳酸菌发酵剂、浓缩苹果汁、柑橘膳食纤维、纯椰子粉和椰浆。通过以速溶豆粉和纯天然椰子粉为主要植物基原料和蛋白质来源，制备得到既能掩盖豆腥味等不愉悦风味，又有大豆本身豆香味和淡淡的椰子风味，同时状态比较细腻，富含膳食纤维的搅拌型植物基酸奶，克服植物基酸奶发酵后易出现的豆腥味等不愉悦风味，同时解决搅拌型植物酸奶质构不细腻的问题。
8.可见，针对植物酸奶生产中存在的发酵时间长和风味不足的问题，目前的解决方向主要聚焦于开发新的发酵工艺和选取更为合理的制作原料，而对于植物酸奶发酵用的菌剂方面则少有研究。
9.引用文献：
10.引用文献1：cn111602721a；
11.引用文献2：cn113749215a。


技术实现要素：

12.发明要解决的问题
13.针对现有技术中存在的，例如植物酸奶生产中存在的发酵时间长和风味不足的问题，本发明从发酵菌剂的角度出发，首先提供了一种产酸快的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株bc 30491，其为德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株ld17在大豆浆液中连续传代驯化得到，针对植物基原料，其能够快速完成发酵；进一步本发明提供了一种菌剂，其包含德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种ll9，菌株bc 30491通过复配菌株ll9得到的菌剂用于发酵植物酸奶时，可以得到质构佳、豆香味突出的产品。
14.用于解决问题的方案
15.为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下技术方案：
16.本发明第一方面提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）bc 30491，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491于2023年1月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26460。
17.本发明第二方面提供了一种菌剂，所述菌剂包含德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）ll9；
18.其中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9于2018年11月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.16714。
19.在本发明的一些实施方案中，在所述菌剂中，以活菌数计，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9的比为1:10~10:1。
20.在本发明的一些实施方案中，所述菌剂中包含的活菌数为10
10
~10
12 cfu/g。
21.本发明第三方面提供了一种根据本发明第二方面所述的菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
22.（i）发酵培养的步骤：利用培养基对所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9分别进行发酵培养；
23.（ii）混合的步骤：对经过发酵培养的菌种进行混合；
24.任选地，在所述混合的步骤前，还包括冷冻干燥的步骤。
25.本发明第四方面提供了根据本发明第一方面所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据本发明第二方面所述的菌剂在植物酸奶的制作中的用途。
26.在本发明的一些实施方案中，所述植物酸奶的制作的方法包括：向灭菌后的植物基原料浆液中加入根据本发明第一方面所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据本发明第二方面所述的菌剂后进行发酵的步骤。
27.在本发明的一些实施方案中，所述菌剂在所述植物基原料浆液中的接种量为0.3%（w/v）~3.0%（w/v）。
28.本发明第五方面提供了一种植物酸奶，所述植物酸奶包含根据本发明第一方面所
述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据本发明第二方面所述的菌剂。
29.在本发明的一些实施方案中，所述植物酸奶还含有其他植物或其提取物、功能性添加组分、微量元素补充剂和/或任意的在食品上可接受的辅料。
30.发明的效果
31.通过以上技术方案的实施，本发明获得了以下技术效果：
32.本发明通过定向驯化，得到了德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，其用于发酵植物基原料时，具有产酸快的特性，能够极大的缩短发酵时间，用于制备植物酸奶时，可以有效节约发酵成本。
33.进一步本发明提供了一种包含德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种ll9的菌剂，其用于发酵植物基原料时，不仅能够快速完成发酵，缩短发酵时间，并且能够完好的保留发酵产品的风味，是适用于植物蛋白原料的优良发酵剂。
34.进一步，本发明提供了基于上述菌剂的植物酸奶，其豆香味突出、无苦味和酸馊味，质地较好，持水力强，同时兼具低脂、低糖、零乳糖、高蛋白等优点。
附图说明
35.图1为德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491菌株mrs琼脂培养基生长观察结果及显微镜下观察结果。
36.图2为本发明提供的植物酸奶的生产工艺流程图。
具体实施方式
37.以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
38.定义
39.除非另有说明，本发明术语具有如下含义：
40.本说明书中，使用“数值a~数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
41.本说明书中，术语“约”或“基本上”、“实质上”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值与理论模型或理论数据的标准偏差在3%、优选为2%、更优选为1%范围以内。
42.本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
43.本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。
44.本说明书中，如没有特殊说明，所使用的“常温”通常指的23
±
2℃时的温度。
45.本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等本领域能够使用的任何可行的水。
46.本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。
47.本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
48.另外，除非另有定义，本发明所用的其他的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
49.本发明主要基于如下见解而完成：
50.为了解决植物酸奶发酵时间长的问题，本发明对筛选得到的1株产酸能力强的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株ld17，在大豆浆液中连续传代实现定向驯化，使其更加适应植物（例如大豆）基生境，通过驯化后获得的菌株bc 30491能够快速完成发酵，经过鉴定，菌株bc 30491可确定为德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）。但菌株bc 30491单独发酵得到的植物基产品质构和风味欠佳。经过大量研究后，本发明发现当菌株bc 30491复配乳酸乳球菌乳酸亚种ll9制备成菌剂后可以有效解决上述问题，复配后发酵得到的植物基酸奶质构佳、豆香味更加突出，从而完成了本发明。
51.以下对本发明技术方案进行进一步具体说明：
52.菌种
53.本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）bc 30491，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491于2023年1月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26460。该菌株在发酵植物基原料时，可以快速完成发酵，极大地缩短了发酵时间，节省了发酵成本。
54.菌剂
55.本发明提供了一种菌剂，其包含上述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）ll9，其中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9于2018年11月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.16714。
56.在一些实施方案中，在所述菌剂中，以活菌数计，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9的比为1:10~10:1，优选为1:5~5:1，甚至更优选为1:3~3:1。
57.在一些实施方案中，所述菌剂中包含的活菌数为10
10
~10
12 cfu/g；示例性的，可以为1
×
10
10 cfu/g、3
×
10
10 cfu/g、5
×
10
10 cfu/g、7
×
10
10 cfu/g、9
×
10
10 cfu/g、1
×
10
11 cfu/g、3
×
10
11 cfu/g、5
×
10
11 cfu/g、7
×
10
11 cfu/g、9
×
10
11 cfu/g或1
×
10
12 cfu/g等；
优选为10
10
~10
11 cfu/g。
58.在一些实施方案中，本发明所述的菌剂为固体，示例性的，可以为冻干粉末等。
59.进一步地，所述菌剂中还可以包含冻干保护剂，所述冻干保护剂包括但不限于脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠和/或甘油等；优选冻干保护剂为脱脂乳粉。
60.在另一些实施方案中，本发明所述的菌剂为半固体，示例性的，可以为菌泥。所述菌泥是指包含少量水分的菌体。
61.在其他一些实施方案中，本发明所述的菌剂为液体，示例性的，可以为混悬液。进一步地，所述菌剂中还可以包含溶剂，所述溶剂包括但不限于水或培养基等。
62.菌剂的制备方法
63.本发明进一步提供了所述菌剂的制备方法，其包括如下步骤：
64.（i）发酵培养的步骤：利用培养基对所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9分别进行发酵培养；
65.（ii）混合的步骤：对经过发酵培养的菌种进行混合。
66.在一些实施方案中，所述发酵培养步骤得到的发酵培养液的活菌数为1.0
×
10
10 cfu/ml~1.0
×
10
12 cfu/ml；示例性的，可以为1.0
×
10
10 cfu/ml、2.0
×
10
10 cfu/ml、3.0
×
10
10 cfu/ml、4.0
×
10
10 cfu/ml、5.0
×
10
10 cfu/ml、6.0
×
10
10 cfu/ml、7.0
×
10
10 cfu/ml、8.0
×
10
10 cfu/ml、9.0
×
10
10 cfu/ml、1.0
×
10
11 cfu/ml、2.0
×
10
11 cfu/ml、3.0
×
10
11 cfu/ml、4.0
×
10
11 cfu/ml、5.0
×
10
11 cfu/ml、6.0
×
10
11 cfu/ml、7.0
×
10
11 cfu/ml、8.0
×
10
11 cfu/ml、9.0
×
10
11 cfu/ml或1.0
×
10
12 cfu/ml等，优选为1.0
×
10
10 cfu/ml~1.0
×
10
11 cfu/ml。
67.在一些实施方案中，在所述混合的步骤前，还包括冷冻干燥的步骤。通过冷冻干燥，为菌剂的运输和储存提供便利。
68.在一些实施方案中，在所述冷冻干燥的步骤前，还包括对通过所述发酵培养的步骤得到的发酵培养液进行离心收集菌泥的步骤，以及将菌泥与保护剂混合的步骤。通过离心可以提高菌体浓度，缩短冻干时间。通过添加保护剂，可以尽量避免菌种在冷冻干燥过程中的死亡或活性丧失，提高菌剂的发酵效果。
69.在一些具体的实施方案中，本发明所述的菌剂的制备方法包括如下步骤：
70.（1）将所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9分别接种至mrs培养基中，37℃培养24~48h，获得两种种子培养液；
71.（2）将所述两种种子培养液分别接种至灭菌后的mrs培养基中，37℃以100~120rpm转速连续发酵24~48h，发酵过程中将发酵液的ph维持为5-7，得到两种发酵培养液；
72.优选地，将所述两种种子培养液分别以0.5%（v/v）~2.0%（v/v）的比例接种至灭菌后的培养基中；
73.（3）将所述两种发酵培养液进行离心，收集两种菌泥沉淀，将两种菌泥分别与保护剂混合；
74.优选地，所述离心的条件为4500~5500rpm，20~30min；
75.优选地，所述保护剂为12%（w/v）的脱脂乳粉水溶液；
76.优选地，所述菌泥与保护剂的混合体积比为1:1~1:3；
77.（4）对与保护剂混合的菌泥进行冷冻干燥，并进行混合。
78.菌种或菌剂的用途
79.本发明提供了上述菌种或菌剂在植物酸奶的制作中的用途。
80.本发明对所述植物酸奶的制作的方法不做特别限定，其可以为本领域常规的植物酸奶制作方法。
81.在一些实施方案中，本发明所述的植物酸奶的制作的方法包括：向灭菌后的植物基原料浆液中加入上述菌种或菌剂后进行发酵的步骤。
82.进一步地，在一些实施方案中，所述菌剂在所述植物基原料浆液中的接种量为0.3%（w/v）~3.0%（w/v）；示例性的，可以为0.3%（w/v）、0.5%（w/v）、0.7%（w/v）、0.9%（w/v）、1.0%（w/v）、1.3%（w/v）、1.5%（w/v）、1.7%（w/v）、1.9%（w/v）、2.0%（w/v）、2.3%（w/v）、2.5%（w/v）、2.7%（w/v）、2.9%（w/v）或3.0%（w/v）等；优选为0.3%（w/v）~2.0%（w/v）。
83.在一些实施方案中，所述植物基原料浆液包含植物基原料和溶剂，以及任选地食品上可接受的添加剂。
84.在一些实施方案中，所述植物基原料包含由豆类、麦类和坚果类组成的组中的一种或多种。
85.在一些具体的实施方案中，所述植物基原料包含大豆、榛子、燕麦、藜麦和红豆；优选地，其在所述质量比为（25~35）:（0.5~5）:（0.5~1）:（0.5~10）:（0.5~7）。
86.在一些实施方案中，所述溶剂包括水。
87.在一些实施方案中，所述食品上可接受的添加剂包括甜味剂。
88.在一些具体的实施方案中，所述甜味剂包括三氯蔗糖、麦芽糖醇或赤藓糖醇；优选地，所述三氯蔗糖在所述植物基原料浆液中的含量为0.002%（w/v）~0.007%（w/v）；所述麦芽糖醇在所述植物基原料浆液中的含量为1%（w/v）~4%（w/v）；所述赤藓糖醇在所述植物基原料浆液中的含量为2%（w/v）~6%（w/v）。
89.在一些具体的实施方案中，本发明所述的植物酸奶的制作的方法包括如下步骤：
90.研磨的步骤：对植物基原料进行研磨；优选在含水且无氧的环境下研磨；优选的研磨温度为80~95℃；优选在研磨后进行过滤；
91.任选的调配的步骤：将任选的食品上可接受的添加剂加入研磨后的浆液中，搅拌均匀至添加剂溶解；
92.均质的步骤：对调配后的浆液进行均质；优选的均质压力为40~400bar，优选100~400bar，更优选200~400bar；优选的均质温度为50~70℃；优选均质2~3次；
93.灭菌的步骤：对均质后得到的浆液进行灭菌，得到植物基原料浆液；优选的灭菌温度为90~95℃；优选的灭菌时间为5~10min；
94.接种的步骤：将所述菌剂接种至灭菌后的植物基原料浆液中；
95.发酵的步骤：控制发酵温度为40~45℃，优选42℃条件下发酵；发酵终点ph值为4.5~4.8；
96.后熟的步骤：对发酵后的产品进行冷藏后熟，优选冷藏温度为4~10℃；优选后熟时间为20~48h。
97.植物酸奶
98.本发明提供了一种植物酸奶，其包括上述菌种或菌剂。
99.此外，本发明所述的植物酸奶除了用于发酵的植物基原料外，还可以根据最终产
品的需要，含有其他任选的成分，可以例举的包括：
100.植物或植物提取成分，包括无花果、石榴、猕猴桃、橘子、橙子、菠萝、草莓、苹果、橡胶、葡萄、梨、樱桃、蓝莓、黑莓、黑加仑、蔓越莓、覆盆莓、甜瓜、余甘子和山桑子等水果或它们的提取物；洋蔥、黄瓜、番茄、花椰菜、红萝卜、菠菜、芥蓝、球芽甘蓝、大蒜、罗勒、奧勒冈草等果蔬类物质或它们的提取物；稻类（籼稻、粳稻、糯稻）、麦类（小麦、大麦、燕麦、黑麦）、玉米、高粱、粟、黍、黄米、荞麦、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、红小豆、芸豆等谷物或它们的提取物；核桃、开心果、腰果、榛子、扁桃、杏仁、松子、花生、瓜子、板栗、夏威夷果、白果等坚果类物质或它们的提取物；咖啡或其提取物。
101.功能性添加组分，包括维生素（维生素a、β-胡萝卜素、维生素d3、维生素e、维生素k1、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12、维生素c、泛酸、叶酸、烟酸、胆碱、肌醇、生物素中的一种或多种）、淀粉、改性淀粉、氨基酸（l-赖氨酸-l-谷氨酸、l-谷氨酸、l-精氨酸、l-色氨酸、l-谷氨酰胺、牛磺酸、l-缬氨酸、l-异亮氨酸或l-亮氨酸等）、中药或中药提取物、膳食纤维（菊粉、魔芋粉、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆多糖、环糊精、抗性糊精或大豆纤维等）。
102.微量元素补充剂，可以包括有机酸类的金属离子盐，例如柠檬酸钙、l-乳酸钙、磷酸氢钙、葡萄糖酸钾、柠檬酸钠、葡萄糖酸亚铁、碘化钾、葡萄糖酸锌、亚硒酸钠、葡萄糖酸铜、硫酸铬、葡萄糖酸锰和葡萄糖酸镁中的一种或多种。
103.任意食品或保健品上可接受的辅料，包括但不限于溶剂、抗氧剂、抗菌剂、增稠剂、稀释剂、助溶剂、稳定剂、乳化剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料、抗结块剂、矫味剂、甜味剂、食用香精、食用色素等。
104.本发明提供的植物酸奶原则上适合所有人群，例如婴幼儿、青少年、成人、老年人等，尤其适合于患有乳糖不耐症的人群，对于针对不同特性的人群也可以对植物酸奶组分进行相应的调整。
105.本发明涉及的核苷酸序列
106.菌株bc 30491的16s rdna 测序结果（seq id no.1）：agggcggctggagagcgcgcacgagcaagtcgagcgagctgaattcaaagatcccttcggggtgatttgttggacgctagcggcggatgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctaaagactgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataacaacatgaatcgcatgattcaagtttgaaaggcggcgtaagctgtcactttaggatgagcccgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcaatgatgcgtagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaggatagaggcagtaactggtctttatttgacggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaatgataagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggaactgcatcggaaactgtcattcttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagcgctaggtgttggggactttccggtcctcagtgccgcagcaaacgcattaagcgctccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctgtgctacacctagagataggtggttcccttcggggacgcagagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtccc
gcaacgagcgcaacccttgtctttagttgccatcattaagttgggcactctaaagagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgagaagcgaacccgcgagggtaagcggatctcttaaagctgttctcagttcggactgcaggctgcaactcgcctgcacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggaagtctgcaatgcccaaagtcggtgggatcacctttattgaccagccgcgcgcgacgcccccgccgccgc。
107.引物27f的核苷酸序列（seq id no.2）：5
′‑
agagtttgatcmtggctcag-3
′
。
108.引物1492r的核苷酸序列（seq id no.3）：5
′‑
accttgttacgactt-3
′
。
109.生物材料保藏信息
110.保藏编号：cgmcc no.26460；
111.分类命名：德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）bc 30491；
112.保藏日期：2023年1月12日；
113.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
114.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
115.保藏编号：cgmcc no.16714；
116.分类命名：乳酸乳球菌乳酸亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）ll9；
117.保藏日期：2018年11月6日；
118.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
119.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
120.实施例
121.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。
122.实施例1
123.本实施例用于说明菌剂及其制备方法。
124.德氏乳杆菌保加利亚亚种ld17菌株分离自新疆喀什地区牧民家的自制酸牛乳，具有发酵牛乳产酸快的特性，将其接种大豆浆液后发现能够发酵产酸但是发酵速度较慢，因此将其接种至大豆浆液中进行持续传代实现定向驯化，直至菌株能够利用大豆浆液进行快速发酵。具体过程如下：
125.将德氏乳杆菌保加利亚亚种ld17菌株接种至mrs液体培养基中，37℃培养24h后得到种子培养液，将所述种子培养液按照1.0%（v/v）的接种量接种至无氧研磨和筛网过滤的黄豆浆（w/v=1:5）中，37℃发酵并定期检测其ph，待ph达到4.8时终止发酵并记录发酵时间，第一代的发酵时间为10.5h。发酵完成的黄豆浆作为种子液进行后续发酵，并分别检测发酵结束后发酵液的活菌数。
126.将第一代种子液按照接种量1.0%（v/v）接种至无氧研磨和筛网过滤的黄豆浆中，37℃发酵至ph达到4.8时终止发酵，第二代的发酵时间为10.4h，将二代发酵液作为第三代发酵的种子液。
127.以此类推，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种ld17菌株共完成20代不间断的适应性定向驯化，最终经过驯化的菌株达到发酵终点所需的发酵时间下降至6.2h。每一代所需发酵的时间和发酵液的活菌数结果见表1。
128.第20代的发酵大豆浆液通过分离筛选和鉴定获得产酸快的驯化菌株bc 30491（保藏编号：cgmcc no.26460），利用驯化菌株bc 30491以及同样分离自牧民自制酸牛乳的乳酸乳球菌ll9菌株（保藏编号：cgmcc no.16714）制备本发明所述的菌剂。
129.将驯化得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491菌株和乳酸乳球菌ll9菌株分别接种至mrs液体培养基中，在37℃下培养24h，得到种子培养液。
130.在发酵罐中加入mrs液体培养基，121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却至室温，以1.0％（v/v）的比例分别加入上述种子培养液，在37℃下110rpm连续发酵24h，发酵过程中将发酵液的ph维持为5.0~7.0，分别得到两种菌种发酵液。
131.对菌种发酵液以5000rpm转速离心25min并收集菌泥，将菌泥与12%（w/v）的脱脂乳粉保护剂按1:3的体积比进行混合，充分混合后置于-80℃预冻过夜，并经真空冷冻干燥分别制成冻干粉。在对含植物蛋白的原料浆液进行发酵时，将上述两种菌株的冻干粉按照质量比例（w/w）为1:1混合即为所述发酵剂，所述发酵剂中包含的活菌数为3.2
×
10
10 cfu/g，以活菌数计，德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌ll9的比为1:3。
132.表1 菌株ld17传代驯化的发酵时间及发酵液活菌数结果
[0133][0134]
实施例2
[0135]
本实施例用于说明驯化后发酵大豆浆液中德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491菌株分离、筛选和鉴定。
[0136]
以驯化至第20代的发酵大豆浆液作为样品来源，采用梯度稀释法将样品进行稀释并制备10-1
~10-8
的梯度稀释液，选取10-6
、10-7
、10-8
三个浓度的稀释液，分别取100μl均匀涂布至含1%（w/v）碳酸钙的mrs琼脂培养基表面，37℃培养48h，观察溶钙圈的大小，挑取溶钙圈直径大的菌落并在同样的培养基上进行划线分纯，直至菌落在颜色以及形态等方面完全一致，将纯化后的单菌落接种至mrs斜面培养基上，并置于4℃冰箱保存。
[0137]
菌株的鉴定：
[0138]
（1）形态学鉴定：将分离得到的钙溶圈最大即产酸能力最强的菌株命名为bc 30491，其在mrs平板上的菌落为乳白色的规则圆形，湿润、光滑、不透明，在显微镜下为长杆状，单个或呈短链状排列，如图1所示。
[0139]
（2）16s rdna鉴定：对菌株bc 30491提取基因组dna，利用引物27f（核苷酸序列如seq id no.2所示）和1492r（核苷酸序列如seq id no.3所示）分别对其16s rdna序列进行
测序，测序结果标记为seq id no.1。然后将该序列在ncbi数据库进行比对，发现菌株bc 30491的16s rdna序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种nbrc 13953t的16s rdna序列的相似性最高，序列相似性为99.79%。
[0140]
基于以上鉴定结果，菌株bc 30491可确定为德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）。所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491菌株于2023年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为cgmcc no.26460。
[0141]
实施例3
[0142]
本实施例用于说明本发明所述的植物酸奶的制备方法。
[0143]
制备方法流程如图2所示，具体操作步骤如下：
[0144]
将制备植物酸奶的植物基原料清洗干净后放入研磨机中，按料液比为1:9加入蒸馏水，水温为90℃，将氮气冲入研磨机内，进行无氧研磨，即制备得到原料浆液，将原料浆经200目的网筛过滤，收集过滤后的原料浆，加入糖，然后均质，均质条件为压力300 bar，温度为60℃，均质2次，然后在95℃下灭菌10min，灭菌结束后冷却至42℃，接种bc 30491与ll9菌株复配质量比例为1:2的菌剂，其中总活菌数为6.0
×
10
10
cfu/g，bc 30491与ll9的活菌数比为1:5，接种量为0.3%（w/v），在无菌条件下进行灌装，灌装好的产品置于42℃条件下发酵至ph 4.5，4℃后熟24h。
[0145]
实施例4
[0146]
本实施例用于说明本发明所述的植物酸奶及其制备方法。
[0147]
准确称取大豆25.0 g，榛子0.5 g，藜麦0.5 g，红豆0.5 g，将清洗干净的大豆、藜麦以及红豆与脱壳去皮的榛子放入研磨机中，料液比为1:9，先加入2/3的蒸馏水，水温为80℃，将氮气冲入研磨机内，进行无氧研磨，所得原料浆备用，量取燕麦浆0.5ml并加入剩余1/3蒸馏水稀释，然后将研磨的原料浆与稀释后燕麦浆混合均匀，即制备得到原料浆液，将原料浆液经200目的网筛过滤，收集过滤后的原料浆液，加入0.002%（w/v）的三氯蔗糖，然后均质，均质条件为压力300 bar，温度为60℃，均质2次后 95℃下灭菌5min，灭菌结束后冷却至42℃，接种bc 30491与ll9菌株复配质量比例为1:1的菌剂，其中总活菌数为3.2
×
10
10
cfu/g，bc 30491与ll9的活菌数比为1:3，接种量为1.5%（w/v），在无菌条件下进行灌装，42℃条件下发酵至ph 4.6，4℃后熟24h即制备得到植物酸奶。
[0148]
实施例5
[0149]
本实施例用于说明本发明所述的植物酸奶及其制备方法。
[0150]
准确称取大豆35.0 g，榛子5.0 g，藜麦10.0 g，红豆7.0 g，将清洗干净的大豆、藜麦以及红豆与脱壳去皮的榛子放入研磨机中，料液比为1:9，先加入2/3的蒸馏水，水温为80℃，将氮气冲入研磨机内，进行无氧研磨，所得原料浆备用，量取燕麦浆1ml并加入剩余1/3蒸馏水稀释，然后将研磨的原料浆与稀释后燕麦浆混合均匀，即制备得到原料浆液，将原料浆经200目的网筛过滤，收集过滤后的原料浆，加入4.0%（w/v）的麦芽糖醇，然后均质，均质条件为压力300 bar，温度为60℃，均质2次后 95℃下灭菌5min，灭菌结束后冷却至42℃，接种bc 30491与ll9菌株复配质量比例为1:3的菌剂，其中总活菌数为8.3
×
10
10
cfu/g，bc 30491与ll9的活菌数比为1:8，接种量为2.0%（w/v），在无菌条件下进行灌装，42℃条件下发酵至ph 4.8，4℃后熟24h即制备得到植物酸奶。
[0151]
实施例6
[0152]
本实施例用于说明本发明所述的植物酸奶及其制备方法。
[0153]
准确称取大豆30.0 g，榛子2.5 g，藜麦5.0 g，红豆3.5 g，将清洗干净的大豆、藜麦以及红豆与脱壳去皮的榛子放入研磨机中，料液比为1:9，先加入2/3的蒸馏水，水温为80℃，将氮气冲入研磨机内，进行无氧研磨，所得原料浆备用，量取燕麦浆0.8ml并加入剩余1/3蒸馏水稀释，然后将研磨的原料浆与稀释后燕麦浆混合均匀，即制备得到原料浆液，将原料浆经200目的网筛过滤，收集过滤后的原料浆，加入6.0%（w/v）的赤藓糖醇，然后均质，均质条件为压力300 bar，温度为60℃，均质2次后 95℃下灭菌5min，灭菌结束后冷却至42℃，接种bc 30491与ll9菌株复配质量比例为2:1的菌剂，其中总活菌数为5.4
×
10
10
cfu/g，bc 30491与ll9的活菌数比为1:2，接种量为1.0%（w/v），在无菌条件下进行灌装，42℃条件下发酵至ph 4.6，4℃后熟24h即制备得到植物酸奶。
[0154]
对比例1
[0155]
利用原始未驯化菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种ld17按照实施例5中的制备方法进行植物酸奶的制备，ld17接种量为2.0%（w/v），其余工艺不变。
[0156]
对比例2
[0157]
利用原始未驯化菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种ld17与乳酸乳球菌ll9菌株按照1:3质量比例混合后，以接种量为2.0%（w/v），按照实施例5中的制备方法进行植物酸奶的制备，其余工艺不变。
[0158]
对比例3
[0159]
利用市售菌剂（包括德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌）按照实施例5中的制备方法进行植物酸奶的制备，市售菌剂接种量为2.0%（w/v），其余工艺不变。
[0160]
实施例7
[0161]
本实施例对本发明实施例4~6和对比例1~3的发酵时间、发酵后的活菌数进行检测并分别进行质地及风味描述，结果如表2所示。
[0162]
表2 植物酸奶的发酵时间、活菌数结果及其质地及风味描述
[0163][0164]
实施例8
[0165]
1.1植物酸奶营养成分检测
[0166]
按照gb 5009.5-2016和gb 5009.6-2016对本发明的实施例4~6、对比例1~3中的植物酸奶以及市售牛乳酸奶（君乐宝简醇）中蛋白质、脂肪、膳食纤维、碳水化合物以及胆固醇等的含量进行检测，营养成分结果见表3。
[0167]
表3 植物酸奶及牛乳酸奶营养成分表
[0168][0169]
本发明的植物酸奶的蛋白质含量接近于牛乳酸奶的蛋白含量，但其在脂肪、膳食纤维、胆固醇、以及碳水化合物含量方面存在较明显差异，相对来说，本发明中的植物酸奶含有更低的脂肪、胆固醇以及碳水化合物，热量低于牛乳酸奶。同时，本发明的植物酸奶含有一定量的膳食纤维，而牛乳酸奶不含膳食纤维。从营养成分方面来看本发明的植物基酸奶的营养配比牛乳酸奶更健康、具有更低热量。
[0170]
1.2 植物酸奶的质构及持水力检测
[0171]
利用ta.tx.plus型质构仪测定本发明实施例4~6和对比例1~3中的植物酸奶样品的硬度、粘性、胶粘性和内聚性。仪器的参数设定：探头选用p/36r，测试模式为tpa（texture profile analysis），触发力为5 g。测定前速度、测定时速度及测定后速度均为2 mm/s，测试距离为20 mm。
[0172]
取10 g (m0) 酸奶于15 ml离心管内，5000 r/min条件下离心10 min。移除上清液并称量其质量（m1）。
[0173]
持水力（%） =(m
0-m1)/m0×
100。
[0174]
各样品质构以及持水力检测结果见表4。
[0175]
表4 植物酸奶的质构及持水力
[0176][0177]
质构特性是衡量酸奶品质的重要指标，酸奶的口感、组织状态及质量稳定性都与之密切相关。过高的硬度和黏性会影响酸奶的感官品质，降低消费者对产品的接受程度。从结果可以看出实施例4~6中的硬度和稠度均低于对比例，说明这些实施例的酸奶质地更为柔软，在一定程度上其感官品质得到了提升。
[0178]
酸奶的持水力与产品的组织状态密切相关，受酸奶中总固形物含量和总蛋白含量的影响。由表4可知，随着植物基原料比例的变化，酸奶的持水力也随之变化，实施例4~6中样品的含水量都在90%以上，制备得到的酸奶持水力均较高，表明酸奶的稳定性较好。而对比例1~3中样品的持水力均低于90%，说明酸奶的品质状态和稳定性与实施例样品相比均较差。
[0179]
1.3 感官评测
[0180]
招募20名消费者，目标人群为平时常喝植物酸奶且注重养生的人群，从酸奶的色泽、气味、滋味、组织状态等4个方面进行评价。感官评价标准参照gb 19302-2010《食品安全国家标准 发酵乳》略作修改，感官评价表见表5。
[0181]
表5 感官评价表
[0182][0183]
不同植物酸奶产品感官评价结果见表6。
[0184]
表6 感官评价结果
[0185][0186]
从表6可以看出，实施例4~6样品的感官评价总分均在88分以上，对比例1~3样品的感官评价得分均低于实施例。说明利用本发明制备得到的植物基酸奶从色泽、风味、滋味以及组织状态四个维度来说均较好，消费者对该植物基酸奶产品接受度较高。
[0187]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
[0188]
产业上的可利用性
[0189]
本发明所述的菌种、菌剂、植物酸奶及其制备方法可以在工业上实施。

技术特征：
1.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）bc 30491，其特征在于，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491于2023年1月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26460。2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）ll9；其中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9于2018年11月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.16714。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，以活菌数计，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9的比为1:10~10:1。4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中包含的活菌数为10
10
~10
12 cfu/g。5.一种根据权利要求2~4中任一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（i）发酵培养的步骤：利用培养基对所述德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491和所述乳酸乳球菌乳酸亚种ll9分别进行发酵培养；（ii）混合的步骤：对经过发酵培养的菌种进行混合；在所述混合的步骤前，还包括任选地冷冻干燥的步骤。6.根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据权利要求2~4中任一项所述的菌剂在植物酸奶的制作中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物酸奶的制作的方法包括：向灭菌后的植物基原料浆液中加入根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据权利要求2~4中任一项所述的菌剂后进行发酵的步骤。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述菌剂在所述植物基原料浆液中的接种量为0.3%（w/v）~3.0%（w/v）。9.一种植物酸奶，其特征在于，所述植物酸奶包含根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种bc 30491，或根据权利要求2~4中任一项所述的菌剂。10.根据权利要求9所述的植物酸奶，其特征在于，所述植物酸奶还含有其他植物或其提取物、功能性添加组分、微量元素补充剂和/或任意的在食品上可接受的辅料。

技术总结
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种菌剂及其用途以及基于该菌剂的植物酸奶。本发明首先提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种BC 30491，其于2023年1月12日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26460。该菌株用于发酵植物基原料时，具有产酸快的特性，能够极大的缩短发酵时间。本发明进一步将德氏乳杆菌保加利亚亚种BC 30491和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9复配，得到一种菌剂。利用该菌剂发酵豆类等植物基原料时，不仅能够更快速完成发酵，且发酵后得到的植物酸奶豆香味突出，无酸馊味和苦味，具有质地好且低脂低糖、零乳糖、高蛋白等特点。高蛋白等特点。高蛋白等特点。


技术研发人员：马洪江 王雪 杨娟 王莹 尹秀莹 云超 焦琳 孙玉婷 郑晓卫 陆思宇 张永久 冷友斌
受保护的技术使用者：黑龙江北纬四十七绿色有机食品有限公司 中粮营养健康研究院有限公司 黑龙江飞鹤乳业有限公司北京分公司
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/7/22