从三七中提取分离的四环三萜类皂苷及其在抗肿瘤药物中的应用

1.本发明属于植物提取技术领域，涉及从三七中提取分离的四环三萜类皂苷及其在抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.三七又名田七、金不换，在著名著作《本草纲目》中就有关于三七的使用记载，曰：“止血、散血、定痛，
……
乃阳明厥阴血分之药，
……
金刃箭伤跌扑杖疮血出不止者，嚼烂涂，或为末掺之，其血即止。亦主吐血衄血
……”
。传统认为三七具有消肿定痛、止血散瘀、治疗跌打损伤、治妇科疾病等功效，现代药理学表明其具有抗炎、抗肿瘤、清除氧自由基、保护心肌细胞、保护脑组织、抗血栓、增强免疫力、止血、抗纤维化、抗氧化等作用。
3.三七有效成分主要是三七皂苷类化合物，目前对于三七中皂苷类化合物的提取分离不够充分，本发明针对三七中的皂苷类化合物进行提取分离，得到一些新的化合物单体，以此补充三七皂苷化合物库，并对分离得到的化合物进行细胞毒性试验，以期找到一些结构新颖，并具有良好抗毒性的三七皂苷，为后续深入研究提供科学依据。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供从三七中提取分离的四环三萜类皂苷及方法、在抗肿瘤药物中的应用，得到了三种新的四环三萜类皂苷。
5.本发明从三七中提取分离的四环三萜类皂苷，结构为下述结构式中的任意一种：
[0006][0007]
本发明提供了从三七中提取分离四环三萜类皂苷的方法，称取三七根粉末，用第一萃取剂在60℃下萃取，合并萃取液，减压蒸干，混悬于蒸馏水中，依次用ch2cl2和正丁醇萃取，得到ch2cl2萃取物和正丁醇萃取物；取正丁醇萃取物，用水饱和ch2cl
2-meoh进行硅胶柱层析，其中ch2cl2与meoh的体积比为10∶1～3∶1，分成10个流分fr.1～fr.10；流分fr.3经制备hplc分离，以体积浓度70％ch3oh和体积浓度90％ch3oh为洗脱剂，得到5个亚流分fr.3-1～fr.3-5；亚流分fr.3-3经制备型hplc，以体积浓度60％ch3oh洗脱，得到5个亚组分fr.3-3-1～fr.3-3-5；亚组分fr.3-3-4经半制备hplc，以体积浓度40％ch3cn洗脱，在保留时间tr＝25.7min纯化得到化合物2，在保留时间tr＝47.3min纯化得到化合物3；流分fr.5经制备
hplc分离，以体积浓度60％ch3oh洗脱分为4个亚流分fr.5-1～fr.5-4，亚流分fr.5-4经体积浓度35％ch3cn制备hplc进一步纯化，在保留时间tr＝38.3min得到化合物1。
[0008]
具体地，所述第一萃取剂是体积浓度80％meoh。
[0009]
具体地，所述第二萃取剂是ch2cl2。
[0010]
本发明还提供了从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0011]
特别地，本发明提供了从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备治疗人宫颈癌药物中的应用。
[0012]
更具体地是，发明提供了从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备抑制人宫颈癌hela细胞的药物中的应用。
[0013]
本发明从三七根部提取分离了三种新的四环三萜类皂苷。本发明提取分离的三个化合物能够有效抑制癌细胞增殖，具有明显的抗癌活性，可作为潜在的先导化合物开发相关抗癌药物。
附图说明
[0014]
图1为化合物1的1h-nmr谱；
[0015]
图2为化合物1的
13
c-nmr谱；
[0016]
图3为化合物1的hsqc谱；
[0017]
图4为化合物1的hmbc谱；
[0018]
图5为化合物1的tocsy谱；
[0019]
图6为化合物1的ir谱；
[0020]
图7为化合物1的hr-esi-ms谱；
[0021]
图8为化合物1部分水解产物的hr-esi-ms光谱。
[0022]
图9为化合物2的1h-nmr谱；
[0023]
图10为化合物2的
13
c-nmr谱；
[0024]
图11为化合物2的hsqc谱；
[0025]
图12为化合物2的hmbc谱；
[0026]
图13为化合物2的ir谱；
[0027]
图14为化合物2的hr-esims谱。
[0028]
图15.为化合物3的1h-nmr谱；
[0029]
图16为化合物3的
13
c-nmr谱；
[0030]
图17为化合物3的1h-1
h cosy谱；
[0031]
图18为化合物3的hsqc谱；
[0032]
图19为化合物3的hmbc谱；
[0033]
图20为化合物3的ir谱；
[0034]
图21为化合物3的hr-esims谱。
具体实施方式
[0035]
本实施采用的三七根茎购买于成都市荷花池中药材市场，经成都生物研究所李甫
副研究员鉴定为三七根茎，保存于中国科学院成都生物研究所709实验室。实验仪器与试剂如表1所示。
[0036]
表1实验仪器与试剂
[0037][0038][0039]
本发明提供了从三七中提取分离四环三萜类皂苷的方法，称取三七根(100.0kg)粉末，用200l 80％meoh(所用百分比为体积浓度，下同)在60℃下萃取3次，合并萃取液，减压蒸干，混悬于20l蒸馏水中，依次用ch2cl2(3
×
15l，指提取3次，每次溶剂用量为15l，下同)和n-buoh(3
×
15l)萃取，得到ch2cl2萃取物(1.58kg)和n-buoh萃取物(11.34kg)。取正丁醇萃取部分(2.0kg)，用水饱和ch2cl
2-meoh(ch2cl2与meoh的体积比为10∶1～3∶1)进行硅胶柱层析(cc)，分成10个流分(fr.1～fr.10)。fr.3(50.00g)经制备hplc分离，以70％和90％ch3oh为洗脱剂，得到5个亚流分(fr.3-1～fr.3-5)。fr.3-3(11.2g)经制备型hplc，60％ch3oh洗脱，得到5个亚组分(fr.3-3-1～fr.3-3-5)。fr.3-3-4(0.67g)经半制备hplc(40％ch3cn)进一步纯化得到化合物2(tr＝25.7min,20.4mg)和化合物3(tr＝47.3min,1.6mg)。fr.5(20.00g)经制备hplc分离，以60％ch3oh洗脱分为4个亚流分(fr.5-1～fr.5-4)。fr.5-4(5.97g)经35％ch3cn制备hplc进一步纯化得到化合物1(tr＝38.3min,6.3mg)。
[0040]
化合物1-3为新化合物，对化合物1-3的结构鉴定结果见表2和图1-图21。
[0041]
表2.化合物1-3在c5d5n中的1h(600mhz)和
13
c nmr(150mhz)数据
[0042][0043][0044]
化合物1，白色无定形粉末，分子式为c
42h72o13
，[α]
2d0
+20.7
°
(c0.07，meoh)；ir
(kbr)λ
max
3418，2928，1060和632cm
–1。hr-esi-ms给出阳离子准分子离子峰为m/z 807.4871(c
42h72o13
na
+
的计算值，807.4865)。红外特征吸收带表明存在羟基(3418cm-1
)和烯烃(1634cm-1
)。化合物1的1h nmr(c5d5n，600mhz)谱图显示八个甲基质子的信号δh0.81(3h，s，h-30)，1.03(3h，s，h-19)，1.16(3h，s，h-18)，1.55(3h，s，h-21)，1.62(6h，s，h-27，h-29)，1.64(3h，s，h-26)，2.08(3h，s，h-28)，一个烯烃质子信号δh5.29(1h，t，j＝6.9hz，h-24)，和三个氧取代质子信号δh3.51(1h，brd，h-3，j＝8.7hz)，4.43(1h，m，h-6)，4.13(1h，m，h-12)。1h nmr和
13
c nmr数据(见表2)也证明了两个异头质子的信号δh4.96(1h，d，j＝7.7hz，h-1
″
)，5.03(1h，d，j＝7.8hz，h-1
′
)和δc98.4(c-1
″
)，106.0(c-1
′
)。根据文献报道的方法，确定了糖基为d-葡萄糖和d-岩藻糖。异头质子较大的耦合常数表明它们均为β构型。c-5的化学位移出现在61.4，表明化合物1是原人参三醇型皂苷。比较化合物1的糖苷配基与20(s)-sanchirhinosidea4的糖苷配基的化学位移表明它们具有相同的糖苷配基，并且都在c-6和c-20处被糖基化。用5％甲酸水溶液在70℃下选择性水解c-20糖残基30分钟，根据[m+h]
+
和[m+na]
+
离子得到分子式为c
36h62
o9的主要产物，在正离子模式的hr-esi-ms谱图中的m/z 639.4441和661.4276，表明d-岩藻糖部分位于糖苷配基的c-20。在hmbc谱图中h-1'与c-6相关，h-1”与c-20的相关证实了糖残基的位置。hsqc、hmbc和tocsy谱图的综合分析显示化合物1的结构为6-o-β-d-吡喃葡萄糖基-3β，6α，12β，20s-四羟基达玛烷-24-烯20-o-岩藻吡喃糖苷(6-o-β-d-glucopyranosyl-3β，6α，12β，20s-tetrahydroxydammarane-24-ene20-o-fucyranoside)，命名为20(s)-sanchirhinoside a7。
[0045]
化合物2，白色无定形粉末，[α]
2d0
+38.1
°
(c0.11，meoh)；ir(kbr)λ
max
3672，2972，1058，891和542cm
–1。hr-esi-ms给出阳离子准分子离子峰为m/z659.4136(c
36h60
o9na
+
的计算值，659.4130)，得到分子式为c
36h60
o9。1h nmr数据(见表2)显示八个甲基质子的信号δh0.91(3h，s，h-19)，1.02(3h，s，h-18)，1.03(3h，s，h-30)，1.42(3h，s，h-28)，1.60(6h，s，h-26，27)，1.63(3h，s，h-21)，1.64(3h，s，h-29)和一个烯烃质子信号δh5.27(1h，t，j＝6.9hz，h-24)。1h nmr和
13
c nmr数据(见表2)给出了异头质子δh5.21(1h，d，j＝7.7hz，h-1
′
)和δc98.3(c-1
′
)的信号。通过上述文献方法显示糖残基为d-葡萄糖，hmbc谱图中h-1
′
和c-20之间的强交叉峰，确定与糖苷配基的c-20连接。将化合物2的nmr数据与人参皂苷f1的nmr数据对比，发现不同之处在于化合物2中存在羰基δc212.2(c-6)，而不是人参皂苷f1中的含氧仲碳。从h-5和h-7到hmbc谱图中碳的相关性表明羰基位于c-6。因此，化合物2被鉴定为3β，12β，20s三羟基-6-氧代-达玛烷-24-烯20-o-葡萄糖苷(3β，12β，20s-trihydroxy-6-oxo-dammarane-24-ene 20-o-glucopyranoside)，命名为20(s)-sanchirhinoside a8。
[0046]
化合物3，白色粉末，分子式为c
40h66o10
，[α]2
d0
+38.1
°
(c0.05，meoh)；ir(kbr)λ
max
3451，2921，1634，1002和544cm
–1。根据hr-esi-ms光谱中m/z729.4563处的[m+na]
+
离子(c
40h66o10
na
+
的计算值，729.4548)。1hnmr数据(见表2)显示八个甲基质子的信号δh0.81(3h，s，h-30)，1.02(3h，s，h-19)，1.22(3h，s，h-18)，1.35(3h，s，h-29)，1.42(6h，s，h-21)，1.65(3h，s，h-27)，1.68(3h，s，h-26)，1.82(3h，s，h-28)和三个烯烃质子信号δh5.35(1h，t，j＝6.5hz，h-24)，6.10(1h，d，j＝15.5hz，h-2
″
)，7.08(1h，m，h-3
″
)。1h nmr和
13
c nmr数据(见表2)也证明了异头质子δh5.16(1h，m，h-1
′
)和δc103.4(c-1
′
)的信号。h-4
″
和c-2
″
之间、h-3
″
和c-1
″
之间以及h-2
″
和c-4
″
之间的相关表明存在丁烯酰基。化合物3的1h nmr和
13
cnmr数据与20(s)-sanchirhinoside a1的数据相似，不同之处在于c-6
′
在化合物3中的化学位移为
62.8，而不是在20(s)-sanchirhinosidea1中的65.2，这表明两个化合物丁烯酰基的位置不同。对1h-1
hcosy、hsqc分析并结合hmbc谱图中从h-2
′
到c-1
′
，c-3
′
和c-1
″
的相关性支持丁烯酰基与葡萄糖的c-2
′
相连。对化合物3结构进行了确认，并命名为20(s)-sanchirhinoside a9。
[0047][0048][0049]
细胞毒性实验结果如表3所示，化合物1-3在浓度为50μm时对人宫颈癌hela细胞具有较强的细胞毒性，其抑制率分别为87.43％，79.56％，84.53％。该实验结果表明，本发明提取分离的三个化合物能够有效抑制癌细胞增殖，具有明显的抗癌活性，可作为潜在的先导化合物开发相关抗癌药物。
[0050]
表3化合物1-3的细胞毒性
[0051][0052]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.从三七中提取分离的四环三萜类皂苷，其特征在于，结构为下述结构式中的任意一种：2.从三七中提取分离权利要求1所述的四环三萜类皂苷的方法，其特征在于，称取三七根粉末，用第一萃取剂在60℃下萃取，合并萃取液，减压蒸干，混悬于蒸馏水中，依次用ch2cl2和正丁醇萃取，得到ch2cl2萃取物和正丁醇萃取物；取正丁醇萃取物，用水饱和ch2cl
2-meoh进行硅胶柱层析，其中ch2cl2与meoh的体积比为10∶1～3∶1，分成10个流分fr.1～fr.10；流分fr.3经制备hplc分离，以体积浓度70％ch3oh和体积浓度90％ch3oh为洗脱剂，得到5个亚流分fr.3-1～fr.3-5；亚流分fr.3-3经制备型hplc，以体积浓度60％ch3oh洗脱，得到5个亚组分fr.3-3-1～fr.3-3-5；亚组分fr.3-3-4经半制备hplc，以体积浓度40％ch3cn洗脱，在保留时间t
r
＝25.7min纯化得到化合物2，在保留时间t
r
＝47.3min纯化得到化合物3；流分fr.5经制备hplc分离，以体积浓度60％ch3oh洗脱分为4个亚流分fr.5-1～fr.5-4，亚流分fr.5-4经体积浓度35％ch3cn制备hplc进一步纯化，在保留时间t
r
＝38.3min得到化合物1。3.根据权利2所述的从三七中提取分离四环三萜类皂苷的方法，其特征子在于，第一萃取剂是体积浓度80％meoh。4.根据权利2所述的从三七中提取分离四环三萜类皂苷的方法，其特征子在于，第二萃取剂是ch2cl2。5.如权利要求1所述的从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。6.如权利要求1所述的从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备治疗人宫颈癌药物中的应用。7.如权利要求1所述的从三七中提取分离的四环三萜类皂苷在制备抑制人宫颈癌hela细胞的药物中的应用。

技术总结
本发明属于植物提取技术领域，公开了从三七中提取分离的四环三萜类皂苷及其在抗肿瘤药物中的应用，本发明从三七根提取分离得到了20(S)-sanchirhinoside A7、20(S)-sanchirhinoside A8、20(S)-sanchirhinoside A9。本发明提取分离的三个化合物具有抑制人宫颈癌Hela细胞的作用，能够用于制备抗肿瘤药物，特别是用于制备治疗人宫颈癌药物。特别是用于制备治疗人宫颈癌药物。特别是用于制备治疗人宫颈癌药物。


技术研发人员：张迹 李甫 胡卫成 宁志恒
受保护的技术使用者：淮阴师范学院
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/7/25