一种大麻二酚-2-（5-乙炔酸）酯及其应用的制作方法

一种大麻二酚-2-(5-乙炔酸)酯及其应用
技术领域
1.本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种新型大麻二酚衍生物，大麻二酚-2-(5-乙炔酸)酯(以下简称a1)的制备方法及其对于防治糖尿病的应用。


背景技术：

2.大麻二酚(cbd)是从植物大麻中提取的一种主要的非精神药物。自临床前的细胞和啮齿动物研究表明，cbd可能具有神经保护、心脏保护和抗炎作用。
3.高纯度的cbd是一种白色或淡黄色结晶，熔点为66-67℃，几乎不溶于水，易溶于乙醇、甲醇、乙醚、苯、氯仿及石油醚等有机溶剂。cbd的这种酯溶性特点使其在进行药物开发和寻找准确药物靶点时具有很大的局限性。基于大麻二酚的结构，设计合成大麻二酚衍生物，是获得更高活性化合物的重要途径，对于寻找cbd的靶点及制备新型的药物具有重要意义。
4.糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，当胰腺不再能够产生胰岛素，或者当身体不能很好地利用胰腺产生的胰岛素时就会发生。糖尿病主要分为一型糖尿病、二型糖尿病和妊娠糖尿病。其中二型糖尿病是最为常见的类型，主要占所有糖尿病类型的90％。《中国2型糖尿病防治指南(2020版)》指出按世界卫生组织(who)标准，我国的糖尿病患病率已高达11.2％，其中2型糖尿病患者占90％以上。
5.目前治疗二型糖尿病的药物或多或少都具有一定的副作用。其中，二甲双胍作为治疗二型糖尿病的一线药物，可以缓解胰岛素抵抗，但二甲双胍最常见的不良反应为胃肠道反应，表现为上腹部不适、腹痛、腹泻、恶心、呕吐、胃胀、乏力、消化不良等。另外，还有10％的糖尿病病人在服用二甲双胍后出现乳酸性酸中毒。使得一部分病人因对二甲双胍不耐受而放弃。因此找到更加安全有效的治疗二型糖尿病的药物是十分重要的。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种新型大麻二酚衍生物a1及其制备方法。本发明还提供了上述化合物在制备治疗二型糖尿病药物中的应用。
7.本发明的化合物具有式i所示的结构：
[0008][0009]
本发明提供的大麻二酚衍生物的制备方法，包括以下步骤：将式ii所示结构的大麻二酚与式iii所示结构的5-乙炔酸在溶剂和催化剂存在下进行反应得到式i所示结构的化合物。
[0010]
根据本发明的一种优选的实施方式的制备方法，至少具有以下有益效果：
[0011][0012]
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为二氯甲烷。
[0013]
在本发明的一些实施方式中，所述5-乙炔酸、大麻二酚的摩尔比1.2:1。
[0014]
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法，具体为将反应混合物先0℃反应20min,再常温反应16h，旋蒸浓缩，柱层析分离纯化。
[0015]
所述药物的制剂形式为油状物。
[0016]
本发明还提供了式i化合物在缓解二型糖尿病症状中的应用。
附图说明
[0017]
图1.大麻二酚、大麻二酚衍生物a1的化学结构式；
[0018]
图2.大麻二酚衍生物a1的合成示意图；
[0019]
图3：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠空腹血糖的检测结果；
[0020]
图4：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠葡萄糖耐量的检测结果；
[0021]
图5：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠胰岛素敏感性的检测结果；
[0022]
图6：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物谷胱甘肽含量的检测结果；
[0023]
图7：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物丙二醛含量的检测结果；
[0024]
图8：大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物超氧化物歧化酶含量的检测结果；
[0025]
图9：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的结果；
[0026]
图10：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞氧化应激相关基因nrf2的mrna表达的结果；
[0027]
图11：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞氧化应激相关基因homx1的mrna表达的结果；
[0028]
图12：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞氧化应激相关基因nqo1的mrna表达的结果；
[0029]
图13：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞炎症相关基因il6的mrna表达的结果；
[0030]
图14：检测大麻二酚和大麻二酚衍生物a1对min6细胞炎症相关基因tnfα的mrna表
达的结果。
具体实施方式
[0031]
下面结合具体实施例对本发明的构思及产生的技术效果作进一步阐述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
[0032]
实施例1、大麻二酚衍生物a1的制备
[0033]
合成路线如下式所示：
[0034][0035]
在25ml的圆底烧瓶中加入5-己炔酸(13mg,0.12mmol,1.2equiv)和大麻二酚(31.5mg,0.1mmol)以及一个磁力搅拌子。并使用2ml无水二氯甲烷(dcm)来将原料溶解，随后在氮气保护下加入dcc(22mg，0.11mmol，1.10equiv)和dmap(6.1mg，0.05mmol,0.5equiv),在加入dcc和dmap的过程中圆底烧瓶应处于0℃的环境下并用磁力搅拌混合。20min后将反应从0℃的环境移出，让反应在室温下继续进行。反应16小时。待反应完成后，使用旋蒸浓缩有机相获得初产物，再用硅胶柱分离收集产物。将收集到的产物用旋蒸、干燥后送核磁共振氢谱确认产物结构。
[0036]
产物的核磁氢谱表征如下：
[0037]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ6.70(s,1h),6.55(s,1h),6.39(d,j＝1.7hz,2h),5.99(s,1h),5.54(s,1h),4.61(t,j＝1.8hz,2h),4.44(s,1h),3.52
–
3.45(m,2h),2.70
–
2.63(m,5h),2.51(tt,j＝14.4,7.2hz,8h),2.33(td,j＝6.9,2.6hz,6h),2.28
–
2.12(m,3h),2.11
–
2.05(m,2h),2.05
–
1.98(m,4h),1.98
–
1.94(m,2h),1.94
–
1.86(m,4h),1.86
–
1.68(m,11h),1.66(t,j＝1.8hz,2h),1.60
–
1.52(m,8h),1.37
–
1.23(m,11h),0.91
–
0.84(m,8h).
[0038]
上述核磁氢谱检测结果说明，本发明提供的制备方法，可有效制备a1。
[0039]
实施例2、大麻二酚衍生物a1对降低二型糖尿病小鼠血糖作用的测定
[0040]
实验动物使用4周龄c57bl雄鼠，小鼠分为四组(对照组，二型糖尿病模型组，大麻二酚治疗组，a1治疗组)，每组五只，对照组小鼠饲喂普通饲料八周，其它组小鼠饲喂高脂饲料八周，在第八周小鼠禁食10-12h后，对照组小鼠腹腔注射等量的链脲佐菌素(stz)溶剂，其它组小鼠腹腔注射50mg/kg stz，连续注射4天，一周后检测小鼠空腹血糖值是否诱导成功(以空腹血糖大于11.1mmol/l为诱导成功)。二型糖尿病模型诱导成功后大麻二酚治疗组每天每只灌胃给予50mg/kg大麻二酚，a1治疗组每天每只灌胃给予50mg/kg a1。连续给药八周，每隔两周禁食10-12h后，用血糖试纸检测小鼠空腹血糖。
[0041]
实验结果如图3所示。
[0042]
图3是大麻二酚和a1对二型糖尿病模型小鼠空腹血糖的检测结果。结果表明，a1可以降低二型糖尿病模型小鼠的空腹血糖。
[0043]
实施例3、对改善二型糖尿病小鼠糖耐量和胰岛素耐量的测定
[0044]
各组小鼠糖耐量的测定
[0045]
在给药第六周将小鼠晚上禁食12-16h,次日早上进行检测，先检测空腹血糖，再按照1g体重注射10μl的标准给各组小鼠注射20％葡萄糖,自此开始计时,分别于30min、60min、90min、120min检测小鼠血糖,实验结束后给各组小鼠加上饲料。
[0046]
实验结果如图4所示。
[0047]
图4是cbd和a1对二型糖尿病模型小鼠葡萄糖耐量的检测结果。结果表明，a1可以缓解二型糖尿病模型小鼠的葡萄糖不耐受。
[0048]
各组小鼠胰岛素敏感性的测定。
[0049]
在给药第七周将各组小鼠早上禁食5-7h,下午进行检测,先称量体重并检测初始血糖,再按照每千克体重注射0.75u的标准给各组小鼠注射胰岛素,自此开始计时,分别于30min、60min、90min、120min检测小鼠血糖,实验结束后给各组小鼠加上饲料。
[0050]
实验结果如图5所示。
[0051]
图5是大麻二酚和a1对二型糖尿病模型小鼠胰岛素敏感性的检测结果。结果表明，a1可以缓解二型糖尿病模型小鼠的胰岛素抵抗。
[0052]
实施例4、大麻二酚衍生物a1对降低二型糖尿病小鼠氧化应激作用的测定
[0053]
在给药第八周时将各组小鼠过夜禁食12-16h，后眼球取血，静置后取血清，分别用总超氧化物歧化酶(t-sod)测定试剂盒，丙二醛(mda)测试盒，还原型谷胱甘肽(gsh)测定试剂盒检测血清中的氧化应激标志物sod、mda、gsh的含量。
[0054]
实验结果如图6，7，8所示。
[0055]
图6是大麻二酚和a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物谷胱甘肽含量的检测结果。
[0056]
图7是大麻二酚和a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物丙二醛含量的检测结果。
[0057]
图8是大麻二酚和a1对二型糖尿病模型小鼠血清中氧化应激标志物超氧化物歧化酶含量的检测结果。
[0058]
结果表明，a1可以缓解二型糖尿病小鼠机体的氧化应激水平。
[0059]
实施例5、大麻二酚衍生物a1对提高胰岛β细胞系min6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的测定
[0060]
将min6细胞按1
×
106个/ml铺板于六孔细胞培养板中，设三组(对照组，大麻二酚处理组，a1处理组)，每组三个重复，待细胞贴壁后，分组处理细胞。对照组每孔加完全培养基2ml，大麻二酚处理组每孔加含有10μm大麻二酚的完全培养基2ml，a1处理组每孔加含有30μm a1的完全培养基2ml，处理24h后弃上清，用pbs缓冲液清洗细胞三次，每孔加入1ml无糖krb缓冲液，37℃孵育1h。1h后弃上清，每孔加入1ml的含有16.7mm葡萄糖的krb缓冲液，37℃孵育1h。1h后收集上清，冷冻干燥后加100μl无糖krb缓冲液，放射免疫法检测每组胰岛素浓度。细胞收集后bsa法检测蛋白浓度。
[0061]
实验结果如图9所示。
[0062]
图9是检测大麻二酚和a1对min6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的结果。结果表明，用大麻二酚和a1处理min6细胞24h后可以显著提高min6细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
[0063]
实施例6、大麻二酚衍生物a1对降低min6细胞氧化应激作用的测定
[0064]
a1对min6细胞氧化应激相关基因的mrna表达的研究。
[0065]
将min6细胞按2.5
×
105个/ml铺板于24孔细胞培养板中，设六组(对照组，高糖处理组，大麻二酚处理组，高糖加大麻二酚处理组，a1处理组，高糖加a1处理组)，每组三个重复，每组待细胞贴壁后分组处理细胞。对照组每孔加完全培养基0.5ml，高糖处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖的完全培养基0.5ml，大麻二酚处理组每孔加含有10μm大麻二酚的完全培养基0.5ml，高糖加大麻二酚处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖和10μm大麻二酚的完全培养基0.5ml，高糖加a1处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖和30μm a1的完全培养基0.5ml。每隔24h细胞换液，处理48h。收细胞，提总rna，反转成cdna后运用荧光定量pcr技术检测氧化应激相关基因nrf2,hmox1,nqo1的mrna的表达。
[0066]
实验结果如图10，11，12所示。
[0067]
图10是检测对min6细胞氧化应激相关基因nrf2的mrna表达的结果；
[0068]
图11是检测对min6细胞氧化应激相关基因homx1的mrna表达的结果；
[0069]
图12是检测对min6细胞氧化应激相关基因nqo1的mrna表达的结果；
[0070]
结果表明，用大麻二酚和a1处理min6细胞48h后可以显著改善高糖处理引起的min6细胞氧化应激水平的提高。
[0071]
实施例7、大麻二酚衍生物a1对降低min6细胞高糖处理引起炎症作用的测定
[0072]
a1对降低min6细胞高糖处理引起炎症作用的测定
[0073]
将min6细胞按2.5
×
105个/ml铺板于24孔细胞培养板中，设六组(对照组，高糖处理组，大麻二酚处理组，高糖加大麻二酚处理组，a1处理组，高糖加a1处理组)，每组三个重复，每组待细胞贴壁后分组处理细胞。对照组每孔加完全培养基0.5ml，高糖处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖的完全培养基0.5ml，大麻二酚处理组每孔加含有10μm大麻二酚的完全培养基0.5ml，高糖加大麻二酚处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖和10μm大麻二酚的完全培养基0.5ml，高糖加a1处理组每孔加含有33.3mm葡萄糖和30μm a1的完全培养基0.5ml。每隔24h细胞换液，处理48h。收细胞，提总rna，反转成cdna后运用荧光定量pcr技术检测炎症相关基因il6,tnfα的mrna的表达。
[0074]
实验结果如图13，14所示。
[0075]
图13是检测a1对min6细胞炎症相关基因il6的mrna表达的结果；
[0076]
图14是检测a1对min6细胞炎症相关基因tnfα的mrna表达的结果；
[0077]
结果表明，用大麻二酚和a1处理min6细胞48h后可以显著改善高糖处理引起的min6细胞炎症水平的提高。

技术特征：
1.一种大麻二酚衍生物，其特征在于，所述衍生物为大麻二酚-2-(5-乙炔酸)酯，具体化学结构式如式i所示：2.一种制备权利要求1所述大麻二酚衍生物的方法，其中，所述方法包括以下反应路线：所述方法包括以下步骤：将式ii所示结构的大麻二酚与式iii所示结构的5-乙炔酸在溶剂和催化剂存在下进行反应得到式i所示结构的化合物。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水二氯甲烷。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大麻二酚、5-乙炔酸的摩尔比为1:1.2。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应催化剂为n,n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，所述大麻二酚、dcc、dmap的摩尔比分别为1：1.1，2：1。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应先在0℃的环境下并用磁力搅拌混合,20min后将反应从0℃的环境移出，让反应在室温下继续进行,反应16小时,待反应完成后，使用旋蒸浓缩有机相获得初产物，再用硅胶柱分离收集、纯化产物。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所得产物具有以下核磁氢谱表征：1h nmr(500mhz,cdcl3)δ6.70(s,1h),6.55(s,1h),6.39(d,j＝1.7hz,2h),5.99(s,1h),5.54(s,1h),4.61(t,j＝1.8hz,2h),4.44(s,1h),3.52
–
3.45(m,2h),2.70
–
2.63(m,5h),2.51(tt,j＝14.4,7.2hz,8h),2.33(td,j＝6.9,2.6hz,6h),2.28
–
2.12(m,3h),2.11
–
2.05(m,2h),2.05
–
1.98(m,4h),1.98
–
1.94(m,2h),1.94
–
1.86(m,4h),1.86
–
1.68(m,11h),1.66(t,j＝1.8hz,2h),1.60
–
1.52(m,8h),1.37
–
1.23(m,11h),0.91
–
0.84(m,8h)。8.权利要求1～7任一项所述大麻二酚衍生物在制备缓解二型糖尿病高血糖、氧化应激药物，减轻胰岛β细胞氧化应激、炎症药物以及提高胰岛β细胞胰岛素分泌药物和/或研究大麻二酚作用靶点的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种大麻二酚-2-(5-乙炔酸)酯(以下简称a1)的制备方法及其应用，具体地，本发明涉及式I所示化合物，该a1对二型糖尿病小鼠的血糖具有降低作用，能够缓解二型糖尿病小鼠的氧化应激。对于小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞的胰岛素分泌具有促进作用，对于高糖引起的MIN6细胞的氧化应激和炎症具有缓解作用。对于大麻二酚的靶点寻找和二型糖尿病药物的开发具有一定的意义。具有一定的意义。具有一定的意义。具有一定的意义。


技术研发人员：李向东 贾晓萌 罗迈 谭昕
受保护的技术使用者：汉义生物科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/25