一种超声响应CO释放纳米制剂及其制备方法

一种超声响应co释放纳米制剂及其制备方法
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种超声响应co释放纳米制剂及其制备方法。


背景技术：

2.纳米医学的应用开创了肿瘤诊断和治疗的新时代。以亚细胞器为靶点的肿瘤治疗纳米制剂具有精确给药、治疗指数最大化和减少脱靶副作用等优势，因此受到越来越多的关注。线粒体是细胞能量的来源，对细胞的存至关重要。基于线粒体凋亡的策略为肿瘤治疗带来了良好的前景。目前的研究提出了几种线粒体凋亡的策略，包括一氧化碳(co)和活性氧(ros)产生等。
3.co是一种非常稳定的惰性气体分子，可以自由扩散到所有细胞中。其内源性来源主要为血红素，由于co对细胞功能和肿瘤微环境的调节作用，在癌症治疗中受到越来越多的关注。线粒体是co发挥生理功能的靶点。co通过与氧气激烈竞争结合细胞色素c氧化酶来抑制线粒体呼吸，从而破坏肿瘤细胞的线粒体能量，导致肿瘤细胞凋亡。co可以可逆地结合到具有特定氧化还原状态的过渡金属上，如锰、铁、钒、钼、钴、镍和铜等，从而生成co释放分子，co释放分子是co疗法中较为安全及具有潜力的策略。然而，高血药浓度和低肿瘤内蓄积分别会导致co中毒风险和co治疗效果受限。因此，co的靶向传递和控制释放对于提高co治疗的有效性和生物安全性至关重要。
4.目前的研究提出了多种非侵入性肿瘤治疗，包括光动力学疗法、声动力学疗法和化学动力学疗法。由于超声具有较高的组织穿透性，声动力学疗法的疗效通常优于光动力学疗法。然而，声动力学疗法通常缺乏理想的声敏剂，这阻碍了其在临床中的应用。二氧化钛是常用的无机声敏剂，由于其宽带隙和激发电子-空穴的的快速复合，ros量子产率较低。相比之下，窄带隙声敏剂需要较小的能量来实现电子激发。化学动力学疗法的原理是芬顿试剂与肿瘤微环境中较高浓度的过氧化氢反应生成高毒性的羟基自由基。除了铁相关的化学动力学策略外，还提出了基于铜、锰、钴、钛等多种金属元素的类芬顿反应。在这里，我们研究了声动力学疗法和化学动力学疗法过程中产生的ros以及co疗法产生的co用于肿瘤细胞线粒体凋亡。


技术实现要素：

5.本发明首先制备了一种四硫化钒纳米制剂(vs4)，然后用vs4负载co释放分子以制备一种超声响应co释放纳米制剂(v-mn)。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.步骤1：将普朗尼克f127与偏钒酸铵中溶于超纯水，加热搅拌，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液，继续搅拌，然后将反应液加入水热反应釜中，在加热条件下反应，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到四硫化钒纳米制剂；
8.步骤2：将步骤1所得四硫化钒纳米制剂分散于乙二醇中，加入co释放分子的乙醇
溶液，加热搅拌一定时间，冷却后进行离心得到超声响应co释放纳米制剂。
9.作为本发明进一步改进，步骤1具体为：将50～100mg普朗尼克f127与35～140mg偏钒酸铵中溶于5～15ml超纯水，在25～75℃条件下加热搅拌15～60min，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液(0.2～0.6m，5～15ml)，继续搅拌15～60min，然后将反应液加入水热反应釜中，在120～180℃条件下加热反应2～12h，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到四硫化钒纳米制剂；
10.作为本发明的进一步改进，步骤2具体为：将步骤1所得四硫化钒纳米制剂(10～40mg)分散于10～20ml乙二醇中，加入co释放分子的乙醇溶液(0.5～4mg/ml，10～20ml)，在25～75℃条件下加热搅拌2～5h，冷却后进行离心得到超声响应co释放纳米制剂。
11.本发明的创新之处如下:
12.1.首次构建了一种基于超声响应的co释放纳米制剂，该纳米制剂可在超声激发下释放co分子，实现时空可控的co治疗。
13.2.vs4是一种新型窄带隙声敏剂，具有高ros产率，而且我们首次发现其具有类芬顿效应，因此能够实现声动力学疗法与化学动力学疗法的双重治疗作用。
14.3.v-mn能够在定时定位的超声作用下释放co、产生ros，并且能够利用肿瘤微环境中高浓度的h2o2产生羟基自由基，从而能够导致肿瘤细胞线粒体凋亡。
附图说明
15.图1v-mn的外观
16.图2vs4与五羰基溴化锰反应不同时间所得产物的紫外可见吸收光谱图
17.图3vs4的声动力学效应考察图
18.图4v-mn的声动力学效应考察图
19.图5v-mn的超声响应co释放考察图
20.图6vs4的化学动力学效应考察图
21.图7mtt法考察vs4及v-mn的细胞相容性及细胞毒性
具体实施方式
22.以下通过实施例对本发明进一步详细说明：
23.实施例1
24.本实施例为vs4的制备方法，包括以下步骤：
25.将50mg普朗尼克f127与35mg偏钒酸铵中溶于15ml超纯水，在25℃条件下加热搅拌15min，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液(0.2m，15ml)，继续搅拌15min，然后将反应液加入水热反应釜中，在180℃条件下加热反应2h，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到vs4。
26.实施例2
27.本实施例为vs4的制备方法，包括以下步骤：
28.将100mg朗尼克f127与140mg偏钒酸铵中溶于5ml超纯水，在75℃条件下加热搅拌30min，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液(0.6m，5ml)，继续搅拌30min，然后将反应液加入水热反应釜中，在120℃条件下加热反应12h，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，
得到vs4。
29.实施例3
30.本实施例为vs4的制备方法，包括以下步骤：
31.将100mg普朗尼克f127与70mg偏钒酸铵中加入15ml超纯水，在60℃条件下加热搅拌60min，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液(0.2m，15ml)，继续搅拌60min，然后将反应液加入水热反应釜中，在160℃条件下加热反应6h，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到vs4。
32.实施例4
33.本实施例为v-mn的制备方法，包括以下步骤：
34.将10mg vs4分散于20ml乙二醇中，加入五羰基溴化锰的乙醇溶液(0.5mg/ml，20ml)在75℃条件下加热搅拌2h，冷却后进行离心得到v-mn。
35.实施例5
36.本实施例为v-mn的制备方法，包括以下步骤：
37.将40mg vs4分散于10ml乙二醇中，加入五羰基溴化锰的乙醇溶液(4mg/ml，10ml)，在25℃条件下加热搅拌5h，冷却后进行离心得到v-mn。
38.实施例6
39.本实施例为v-mn的制备方法，包括以下步骤：
40.将20mg vs4分散于15ml乙二醇中，加入五羰基溴化锰的乙醇溶液(1.33mg/ml，15ml)，在75℃条件下加热搅拌3h。冷却后进行离心得到v-mn。
41.实施例7
42.本实施例为v-mn的外观考察：
43.将v-mn分散于水中，拍照记录其外观，如图1所示，该纳米制剂混悬液为棕黑色，分散性较好。
44.实施例8
45.本实施例为vs4及其与五羰基溴化锰反应不同时间，所得的v-mn的紫外可见吸收光谱图考察：
46.取vs4与五羰基溴化锰反应不同时间的反应液，进行离心，将沉淀分散于水中，采用紫外可见分光光度计测定各样品的紫外可见吸收光谱图。如图2所示，vs4与五羰基溴化锰反应2～5h后，在200nm处均出现五羰基溴化锰的特征吸收峰，表明了v-mn的成功制备。
47.实施例9
48.本实施例为vs4及v-mn的声动力学效应的考察：
49.利用1,3-二苯基异苯并呋喃作为ros指示剂，采用紫外可见分光光度法考察vs4及v-mn的细胞外声动力学效应。将纳米混悬液与1,3-二苯基异苯并呋喃溶液以等体积混合，超声(1.0w/cm2)不同时间，取样测定各样品的紫外可见吸收光谱图。图3、图4分别为vs4与v-mn的声动力学效应图。研究结果表明超声时间越长，吸收峰降低越明显，证明了声动力学效应，且表现出功率依赖性。
50.实施例10
51.本实施例为v-mn在超声激发下的co释放考察：
52.将超声响应co纳米释放系统的混悬液与脱氧血红蛋白等体积混合，超声(1.0w/
cm2)不同时间，取样测定各样品的紫外可见吸收光谱图。图5为v-mn在超声激发下的co释放图。实验结果表明随着超声时间增加，吸收峰逐渐移动至420nm，说明在超声激发下v-mn能够释放co。上述实验结果进一步证明了v-mn的成功制备。
53.实施例11
54.本实施例为vs4的化学动力学效应考察：
55.将3,3',5,5'-四甲基联苯胺与待测液混合，加入ph5.5的磷酸盐缓冲液和h2o2，于不同时间点，采用紫外可见分光光度计测定羟基自由基的生成。图6为vs4的化学动力学效应的检测图。实验结果显示vs4具有类芬顿活性，表现出时间依赖性的羟基自由基的生成，证明了vs4的化学动力学效应。
56.实施例12
57.本实施例为vs4及v-mn的细胞相容性及细胞毒性考察：
58.以相对细胞存活率作为考察指标，采用mtt法考察vs4及v-mn在有无超声激发下对4t1细胞的杀伤作用。实验结果如图7所示，vs4及v-mn在无超声激发时，细胞活力接近100％。然而在超声激发后，细胞活力显著降低，表现出浓度依赖性，且v-mn+超声组的细胞活力低于vs4+超声组。可见各纳米制剂具有较好的生物相容性，在给予超声后，vs4的声动力学效应对细胞具有杀伤作用，而v-mn的声动力学效应联合co治疗对细胞的杀伤作用增强。

技术特征：
1.一种超声响应co释放纳米制剂，其制备方法包括以下步骤：(1)将普朗尼克f127与偏钒酸铵中溶于超纯水，加热搅拌，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液，继续搅拌，然后将反应液加入水热反应釜中，在加热条件下反应，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到四硫化钒纳米制剂；(2)将步骤(1)所得四硫化钒纳米制剂分散于乙二醇中，加入co释放分子的乙醇溶液，加热搅拌一定时间，冷却后进行离心得到超声响应co释放纳米制剂。2.如权利要求1所述的超声响应co释放纳米制剂，其制备步骤(1)具体为：将50～100mg普朗尼克f127与35～140mg偏钒酸铵中溶于5～15ml超纯水，在25～75℃条件下加热搅拌15～60min，加入硫代乙酰胺的乙二醇溶液(0.2～0.6m)，继续搅拌15～60min，然后将反应液加入水热反应釜中，在120～180℃条件下加热反应2～12h，冷却后进行离心，将得到的沉淀用乙醇和水洗涤，得到四硫化钒纳米制剂。3.如权利要求1所述的超声响应co释放纳米制剂，其制备步骤(2)具体为：将步骤1所得四硫化钒纳米制剂(10～40mg)分散于10～20ml乙二醇中，加入co释放分子的乙醇溶液(0.5～4mg/ml，10～20ml)，在25～75℃条件下加热搅拌2～5h，冷却后进行离心得到超声响应co释放纳米制剂。4.如权利要求1所述的超声响应co释放纳米制剂，其特征在于所选用的co释放分子为包括五羰基溴化锰、羰基锰、十羰基二锰、五羰基铁中的一种或两种以上的混合物。

技术总结
本发明公开了一种超声响应CO释放纳米制剂及其制备方法。本发明首先制备了具有声动力学效应和化学动力学效应的四硫化钒纳米制剂。然后进行了CO释放分子的负载，构建了一种超声响应CO释放纳米制剂，实现了CO的可控释放。该超声响应CO释放纳米制剂制备过程简单，能够实现肿瘤的CO疗法/声动力学疗法/化学动力学疗法的联合，将其用于肿瘤治疗具有安全性和有效性，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：张良珂 陈欢
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2023.02.17
技术公布日：2023/7/25