治疗和检测新型冠状病毒感染的抗体及其应用

1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及治疗和检测新型冠状病毒感染的抗体及其应用，更具体地，涉及抗体、核酸、表达载体、重组细胞、组合物、上述物质在制备药物中的用途、疫苗及试剂盒。


背景技术：

2.spike(简称s)蛋白的rbd结构域能够与宿主细胞上表达的ace2受体相结合，进而诱导新型冠状病毒的入侵。目前已经报道和进入临床试验阶段的中和性抗体绝大部分为靶向识别病毒s蛋白的rbd结构域，从而阻断其与ace2受体的结合。然而，针对非rbd结构域，尤其是s2亚基的中和性抗体的开发十分罕见。新型冠状病毒s蛋白的rbd结构域的氨基酸序列极易突变，持续的使用针对rbd结构域的中和抗体，会增加病毒的抗药性，导致这些抗体对新出现的突变体无效。突变后的s蛋白传播和治病能力可能会显著增加。因此急需开发出靶向s蛋白中非rbd的其他区域，尤其是针对序列相对保守、且在不同冠状病毒中序列相似性很高的s2的治疗性中和抗体。因此，开发针对新型冠状病毒(sars-cov-2)非rbd结构域的治疗型中和抗体以及用于检测新型冠状病毒感染的抗体具有重要意义。


技术实现要素：

3.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
4.本发明中，发明人通过高通量单细胞免疫组库测序技术，获得了针对于新型冠状病毒(sars-cov-2)的s蛋白的非rbd结构域的治疗型中和抗体，以及针对nucleocapsid(简称n)蛋白的用于检测新型冠状病毒感染的抗体，所述抗体相较于现有的针对于rbd结构域的抗体，具有良好的治疗或预防新型冠状病毒的效果，且不易产生耐药性。
5.因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，含有选自下列至少之一的cdr序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：轻链可变区cdr序列：seq id no:1～9；重链可变区cdr序列：seq id no:10～18。根据本发明实施例的抗体可以有效与新型冠状病毒的s蛋白非rbd区域或n蛋白进行结合，具有较强的体内、外结合活性，治疗或预防新型冠状病毒感染的效果显著。
6.在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的抗体。根据本发明实施例的核酸编码的抗体可以有效与新型冠状病毒的s蛋白非rbd区域或n蛋白进行结合，具有较强的体内、外结合活性，治疗或预防新型冠状病毒感染的效果显著。
7.在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述重组抗体，进而可有效用于对新型冠状病毒的治疗或预防。
neutralization表示中和假病毒的比例；
17.图3是根据本发明实施例的38号和39号抗体与sars-cov-2的wt毒株s蛋白三聚体(s-trimer)以及与s1亚基、rbd、s2亚基或奥密克戎变异株结合的elisa检测结果图，其中，横坐标concentration表示浓度，纵坐标o.d.value表示od值；
18.图4是根据本发明实施例的通过生物膜层干涉技术(biolayer interferometry，bli)检测38号和39号抗体的亲和力动力学的结果图，其中，横坐标times表示时间(s)，纵坐标response unit表示响应信号值(nm)；
19.图5是根据本发明实施例的假病毒中和试验测定38和39号抗体的半抑制浓度的检测结果图，其中，横坐标concentration(μg/ml)表示不同的浓度，纵坐标％of neutralization表示中和假病毒的比例。
20.图6是根据本发明实施例的32号抗体与n蛋白结合的elisa检测结果图；
21.图7是根据本发明实施例的生物信息蛋白分子对接模型预测39号抗体和s-trimer的结合位点结果图，其中：
22.a图表示s蛋白中的主要结构域以及起始和结束氨基酸序号，其中，ntd为s蛋白上第14-306位氨基酸，rbd为s蛋白上第331-528位氨基酸，fp为s蛋白上第816-834位氨基酸，hr1为s蛋白上910-985位氨基酸，hr2为s蛋白上1163-1211位氨基酸；
23.b图表示39号抗体和s-trimer的结合位点；
24.c和d图表示利用modeler程序模拟出的39号抗体蛋白结构；
25.图8是根据本发明实施例的流式细胞术验证39号抗体与不同sars-cov-2的s-trimer的结合位点的结果图，其中：
26.a图表示构建的包含s蛋白全长(full-length)的质粒、敲除了hr1(δhr1)、985-1162氨基酸(δs985-1162)以及hr2(δhr2)区域的s蛋白质粒，
27.b图表示包含s蛋白全长的质粒、敲除了hr1、985-1162氨基酸以及hr2区域的s蛋白质粒的hek293t细胞免疫印迹实验的检测结果，其中，s protein表示s蛋白，gapdh表示gapdh蛋白，control表示未转染质粒的hek293t细胞组；
28.c图表示抗体39号与转染包含s蛋白全长的质粒、敲除了hr1、985-1162氨基酸以及hr2区域的s蛋白质粒的hek293t细胞结合能力的检测结果图，其中，39表示39号抗体，％of max表示相对细胞数量的比例，control表示未转染质粒的hek293t细胞组；以及
29.图9根据本发明实施例的38号和39号抗体对s2亚基介导的膜融合过程的抑制作用，其中wt表示wt毒株，omicron表示奥密克戎变异株，isotype表示同型对照抗体，n.c.表示阴性对照，averagesize表示细胞面积的平均值。
具体实施方式
30.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
31.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
32.本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(h链)和轻链(l链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(n端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(v区)，羧基端(c端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(c区)。l链和h链的v区分别称为vl和vh。
33.在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(hypervariable region，hvr)，高变区位于分子表面，多则由20多个氨基酸残基构成，少则只有2～3个，高变区为抗原和抗体结合的位置，决定了该抗体结合抗原的特异性，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，cdr)。重链可变区和轻链可变区上均有三个cdr区。
34.同一性，本发明，为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一序列中与相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目相除]来计算第一序列和第二序列之间的“序列同一性”的百分比。第二个序列中的核苷酸]减去[第一个序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中第二个核苷酸序列中每个核苷酸的缺失，插入，取代或添加-相对于第一核苷酸序列-被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。
[0035]
或者，可以使用标准设置，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如ncbi blast v2.0，计算两个或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。
[0036]
用于确定序列同一性程度的一些其他技术，计算机算法和设置例如在wo 04/037999，ep 0 967 284，ep 1 085 089，wo 00/55318，wo 00/78972，wo 98/49185和gb 2357768-a。
[0037]
同一性，本发明，为了比较两个或多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过将[第一氨基酸序列中的氨基酸残基数目除以与[第二个氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基]相同，为[第一个氨基酸序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中每个缺失，插入，取代或添加与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的“残基”被认为是单个氨基酸残基(位置)上的差异，即，如本文所定义的“氨基酸差异”。
[0038]
备选地，可以再次使用标准设置，使用已知的计算机算法来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度，例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法。
[0039]
通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸氨基酸序列，另一个氨基酸序列将作为“第二”氨基酸序列。
[0040]
同样，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为其中氨基酸残基被替换为的氨基酸取代。具有相似化学结构的另一个氨基酸残基，其对多肽的功能，活性或其他生物学特性几乎没有影响或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如，从wo 04/037999，gb-a-2357768，wo 98/49185，wo 00/46383和wo 01/09300；和wo 01/09300。可以基于来自wo 04/037999以及wo 98/49185的相关教导以及从其中引用的其他参考文献中选择和/或(优选)这种取代的类型和/或组合。
[0041]
抗体
[0042]
在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体，含有选自下列至少之一的cdr序列
或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列轻链可变区cdr序列：seq id no:1～9；重链可变区cdr序列：seq id no:10～18。根据本发明实施例的抗体可以有效与新型冠状病毒的s蛋白非rbd区域或n蛋白进行结合，具有较强的体内、外结合活性，治疗或预防新型冠状病毒感染的效果显著，且耐药性小。
[0043]
根据本发明的一些具体实施例，上述抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0044]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体包括：分别如seq id no:1、2和3或者与seq id no:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；或者分别如seq id no:4、5和6或者与seq id no:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；分别如seq id no:7、8和9或者与seq id no:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列。
[0045]
38号抗体具有如下所示的轻链cdr：
[0046]
qsvlyssnnkny(seq id no:1)。
[0047]
cas(seq id no:2)。
[0048]
qqyystplt(seq id no:3)。
[0049]
39号抗体具有如下所示的轻链cdr：
[0050]
vlakky(seq id no:4)。
[0051]
kds(seq id no:5)。
[0052]
ysaadnnvv(seq id no:6)。
[0053]
32号抗体具有如下所示的轻链cdr：
[0054]
ssdvggyny(seq id no:7)。
[0055]
gvt(seq id no:8)。
[0056]
tsyagnnnvl(seq id no:9)。
[0057]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体包括：分别如seq id no:10、11和12或者与seq id no:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；或者分别如seq id no:13、14和15或者与seq id no:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；分别如seq id no:16、17和18或者与seq id no:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列。
[0058]
38号抗体包括如下所示的重链cdr：
[0059]
gftfddya(seq id no:10)。
[0060]
iswnsgsl(seq id no:11)。
[0061]
akggsssswsspffnwyfdl(seq id no:12)。
[0062]
39号抗体包括如下所示的重链cdr：
[0063]
gftfddya(seq id no:13)。
[0064]
iswnsgsi(seq id no:14)。
[0065]
akdshsspriaasgidy(seq id no:15)。
[0066]
32号抗体包括如下所示的重链cdr：
[0067]
gytftnyy(seq id no:16)。
[0068]
inpsvgst(seq id no:17)。
[0069]
aregitmvrgafdy(seq id no:18)。
[0070]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体具有如seq id no:19所示的轻链可变区，和seq id no:20所示的重链可变区，或者与seq id no:19和seq id no:20所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
[0071]
38号抗体轻链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0072]
mvlqtqvfislllwisgaygdivmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppkllincastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpltfgggtkveik(seq id no:19)。
[0073]
38号抗体重链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0074]
melglswifllailkgvqcevqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgslgyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycakggsssswsspffnwyfdlwgrgtlvtvss(seq id no:20)。
[0075]
根据本发明的一些具体实施例，具有如seq id no:21所示的轻链可变区，和seq id no:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与seq id no:21和seq id no:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
[0076]
39号抗体轻链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0077]
mawiplllpllilctvsvasyeltqpssvsvspgqtaritcsgdvlakkyarwfqqkpgqapvlviykdserpsgiperfsgsssgttvtltvsgaqvedeadyycysaadnnvvfgggtkltvlgq(seq id no:21)。
[0078]
39号抗体重链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0079]
melglswifllallkgvqcevqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycakdshsspriaasgidywgqgtlvtvss(seq id no:22)。
[0080]
根据本发明的一些具体实施例，具有如seq id no:23所示的轻链可变区，和seq id no:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与seq id no:23和seq id no:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
[0081]
32号抗体轻链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0082]
mawalllltlltqgtgswaqsaltqppsasgspgqsvtvsctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklviygvtkrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaedeadyyctsyagnnnvlfgggtkltvlgq(seq id no:23)。
[0083]
32号抗体重链可变区包括如下所示的氨基酸序列：
[0084]
mdwtwrvfcllavapgahsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnyymhwvrqapgqglewmgiinpsvgstssaqkfqdrvtltrdtststvylelsslrsedtavyycaregitmvrgafdywgqgtlvtvss(seq id no:24)。
[0085]
根据本发明的一些具体实施例，还含有fc区，所述fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
[0086]
根据本发明的一些具体实施例，所述fc区的至少一部分来自人源igg或其突变体。
[0087]
根据本发明的一些具体实施例，所述fc区的至少一部分来自人源igg1或其突变体。
[0088]
根据本发明的一些具体实施例，所述fc区具有如seq id no:25和26所示的氨基酸序列。
[0089]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:25)。
[0090]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:26)。
[0091]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体用于结合sars-cov-2的s蛋白或n蛋白。
[0092]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体用于结合s1蛋白的第14-330或528-685位氨基酸。
[0093]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体用于结合s2蛋白的第910-985或985-1162位氨基酸。
[0094]
根据本发明的一些具体实施例，所述s1蛋白具有如seq id no:27所示的氨基酸序列。
[0095]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrar(seq id no:27)。
[0096]
根据本发明的一些具体实施例，所述s2蛋白具有如seq id no:28所示的氨基酸序列。
[0097]
svasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:
28)。
[0098]
根据本发明的一些具体实施例，所述n蛋白具有如seq id no:29所示的氨基酸序列。
[0099]
msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa(seq id no:29)。
[0100]
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体具有如seq id no：30-35所示的氨基酸序列。
[0101]
38号抗体轻链包括如下所示的氨基酸序列：
[0102]
mvlqtqvfislllwisgaygdivmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppkllincastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:30)。
[0103]
38号抗体重链包括如下所示的氨基酸序列：
[0104]
melglswifllailkgvqcevqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgslgyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycakggsssswsspffnwyfdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:31)。
[0105]
39号抗体轻链包括如下所示的氨基酸序列：
[0106]
mawiplllpllilctvsvasyeltqpssvsvspgqtaritcsgdvlakkyarwfqqkpgqapvlviykdserpsgiperfsgsssgttvtltvsgaqvedeadyycysaadnnvvfgggtkltvlgqrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:32)。
[0107]
39号抗体重链包括如下所示的氨基酸序列：
[0108]
melglswifllallkgvqcevqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycakdshsspriaasgidywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:33)。
[0109]
32号抗体轻链包括如下所示的氨基酸序列：
[0110]
mawalllltlltqgtgswaqsaltqppsasgspgqsvtvsctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklv
iygvtkrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaedeadyyctsyagnnnvlfgggtkltvlgqrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:34)。
[0111]
32号抗体重链包括如下所示的氨基酸序列：
[0112]
mdwtwrvfcllavapgahsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnyymhwvrqapgqglewmgiinpsvgstssaqkfqdrvtltrdtststvylelsslrsedtavyycaregitmvrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:35)。
[0113]
预防或治疗组合物
[0114]
在本发明的一个方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码前面所述的抗体。根据本发明实施例的核酸编码的抗体可以有效与新型冠状病毒的s蛋白非rbd区域或n蛋白进行结合，具有较强的体内、外结合活性，治疗或预防新型冠状病毒感染的效果显著。
[0115]
根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有seq id no：36-41所示的核苷酸序列。
[0116]
编码38号抗体轻链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0117]
atggtgctccagactcaggttttcatctcactgctcctgtggatctctggtgcttacggagacatcgtgatgactcagtctcctgatagcctggctgtgagcctcggtgagagagccaccatcaactgtaagtcatcccagagtgtgctgtactcaagcaacaacaagaactacctggcctggtatcagcagaagcctggacagccacctaagctcctcattaactgcgcttctacccgcgaaagtggagtccctgacaggttctcagggtccggttctggaactgacttcacactgaccatcagcagtctccaggctgaagacgtggccgtgtattactgtcagcaatactacagcactccactgaccttcggaggcggcacaaaggttgaaattaagcggacagtggccgctcctagcgtgttcatctttccacctagcgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt(seq id no:36)。
[0118]
编码38号抗体重链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0119]
atggaactgggtctgtcatggatctttctcctggctattctgaagggcgtgcagtgtgaggtccaactggtggaaagtggcggaggcctcgtgcaacctgggagaagtctgcggctgagctgtgccgcaagtggcttcaccttcgacgactatgctatgcactgggtcagacaagcacccggaaaaggcctggaatgggtctctggcatatcttggaacagtgggagcctgggatacgctgactctgtgaaaggaaggttcaccatcagcagggataatgctaagaactcactgtacctgcagatgaactctctgcgcgctgaggacacagctctgtactattgcgccaagggaggttcctccagttcatggtcatcacccttcttcaactggtactttgacctgtggggtagaggaactctggtgactgtcagctctgctagcacaaagggccccagcgttttcccactggctcctagcagcaagagcacaagcggaggaacagccgctctgggctgtctggtcaaggactactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaattctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgccaagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaa
gacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgccaccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagccagagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacacagaagtccctgtctctgagccccggcaaa(seq id no:37)。
[0120]
编码39号抗体轻链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0121]
atggcttggataccactgctgctccctctcctcattctctgtactgtcagtgtggccagctatgaactgactcagccctcatccgtgagtgtcagccctggtcaaacagctcgcattacctgctctggagacgtgctggccaagaagtacgctcgctggtttcagcagaaaccaggccaggctcctgtgctcgtgatctacaaggattccgaaagaccttcaggtatccctgaacggttcagcggcagtagcagtggtacaaccgtgaccctgacagtcagcggagcccaagtggaggacgaggcagactactactgctattctgcagcagataacaacgtggtgtttggcggaggcaccaagctgaccgtcctcggacagcggacagtggccgctcctagcgtgttcatctttccacctagcgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt(seq id no:38)。
[0122]
编码39号抗体重链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0123]
atggaactcggtctgtcttggatctttctgctcgcactgctgaagggagtccagtgcgaggtgcagctcgtggaatccggaggtggactggtgcagccaggtaggtcactgagactgtcctgtgccgcctctggattcacatttgatgactacgccatgcattgggttcgccaggcaccaggaaaagggctggagtgggtgtcaggcatctcttggaacagtggttccatcggttacgccgacagcgtgaaaggtaggtttacaatcagtagagacaatgcaaagaacagcctctacctccaaatgaatagcctgcgcgccgaggataccgctctctattattgcgccaaggatagccacagtagtccacgcattgcagcaagcgggatcgactactggggacaagggaccctggtcaccgtgtccagtgctagcacaaagggccccagcgttttcccactggctcctagcagcaagagcacaagcggaggaacagccgctctgggctgtctggtcaaggactactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaattctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgccaagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgccaccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagccagagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggc
tcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacacagaagtccctgtctctgagccccggcaaa(seq id no:39)。
[0124]
编码32号抗体轻链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0125]
atggcctgggctctgctcctgctgacactgctgactcaaggaacaggatcttgggctcagtcagctctcacacagccacccagcgcctccggctctccagggcagtcagtgaccgtcagctgtactgggacatcaagcgacgtgggaggctacaactatgtgagctggtaccaacaacacccaggtaaagctcccaagctggtgatctacggtgtcaccaagaggcccagtggtgttcctgacagattctccggaagtaagagtggcaatacagcttccctgaccgtgagtggtctgcaggccgaagacgaagccgactactattgcacatcttacgcagggaacaacaacgtcctcttcggtggtggaacaaagctcaccgtcctcggacagcggacagtggccgctcctagcgtgttcatctttccacctagcgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt(seq id no:40)。
[0126]
编码32号抗体重链的基因包括如下所示的核苷酸序列：
[0127]
atggattggacttggagagttttctgtctgctggctgttgcaccaggcgctcactctcaggttcagctcgttcagagcggagccgaagtgaagaagcctggtgcctctgttaaagtttcttgcaaggctagtgggtacactttcactaactattatatgcactgggtgcgccaggcaccaggacagggcctggagtggatgggaatcataaacccttctgtcgggtccacaagcagtgcccagaagttccaagacagagtgacactcaccagggataccagcacaagcaccgtctacctggagctgtcttctctgcgcagtgaggatacagccgtgtattactgcgcaagagagggcattactatggttagaggagcattcgactattgggggcagggaactctggtgacagtgtcctccgctagcacaaagggccccagcgttttcccactggctcctagcagcaagagcacaagcggaggaacagccgctctgggctgtctggtcaaggactactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaattctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgccaagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgccaccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagccagagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacacagaagtccctgtctctgagccccggcaaa(seq id no:41)。
[0128]
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
[0129]
在本发明的另一方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作
地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，进而可有效用于对新型冠状病毒的治疗或预防。
[0130]
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子、表达载体或抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述抗体，所述重组细胞可有效用于新型冠状病毒的治疗或预防。
[0131]
需要说明的是，本技术说明书中所述的“适合条件”，是指适合本技术所述抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体表达的条件。
[0132]
根据本发明的具体实施例，所述重组细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
[0133]
在本发明的一个方面，本发明提出了一种组合物，包括前面所述的抗体、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，本发明实施例的抗体可以有效与新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白进行结合，进而可特异性识别新型冠状病毒，包含所述抗体及相应一系列物质的组合物，如食品组合物或药物组合物，同样具有显著的治疗或预防表达新型冠状病毒感染的作用，且耐药性更小。
[0134]
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物，包括：前面所述的抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物，所述药物用于治疗或预防新型冠状病毒感染。如前所述，本发明实施例的抗体可以有效与新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白进行结合，进而可特异性识别新型冠状病毒，包含所述抗体及其相应一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防新型冠状病毒感染的作用，且其耐药性更小。
[0135]
根据本发明的一些具体实施例提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
[0136]
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0137]
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0138]
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
[0139]
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用
率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0140]
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
[0141]
在本发明的再一方面，本发明提出了一种疫苗，包括：前面所述的抗体、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，本发明一些具体实施方案提供的核酸分子、表达载体或重组细胞在合适的条件下表达前面所述的抗体。本发明实施例所提出的疫苗具有显著的治疗或预防新型冠状病毒感染的作用，且耐药性更小。
[0142]
根据本发明的一些具体实施例，上述疫苗还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0143]
根据本发明的一些具体实施例，所述疫苗呈适于吸入或者注射方式给药的形式。
[0144]
根据本发明的一些具体实施例，还包含至少一种佐剂。所述佐剂不受特别限制，本领域技术人员所使用的常规佐剂均可使用。
[0145]
用途
[0146]
在本发明的一个方面，本发明提出了前面所述的抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防新型冠状病毒感染。如前所述，本发明一些具体实施例提供的抗体可以有效与新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白进行结合，进而可特异性识别特异所述新型冠状病毒，利用所述抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防新型冠状病毒感染的作用，且耐药性更小。
[0147]
试剂盒
[0148]
在本发明的一个方面，本发明提出了一种试剂盒，包括：前面所述的抗体。本发明的一些具体实施例提供的所述抗体可与新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白进行结合，因此，包含所述抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测高表达所述新型冠状病毒、新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样品中的新型冠状病毒、新型冠状病毒s蛋白的非rbd区域或n蛋白。
[0149]
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0150]
实施例1抗体的筛选
[0151]
本实施例的具体实验操作如下：
[0152]
1.1获得淋巴细胞
[0153]
收集5个新冠感染后康复期的病人外周血15-20ml，分离血清，并用ficoll密度梯度离心法从病人外周血中分离淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)。
[0154]
1.2康复期患者体内病毒特异性抗体的确认
[0155]
1)采用酶联免疫反应(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)检测血清中的抗体滴度。首先用wt毒株s-trimer(s蛋白三聚体)、s1亚基、rbd、s2亚基或奥密克戎变异株s-trimer以2ug/ml浓度铺elisa板，4℃过夜包被。5％牛奶室温封闭1小时后，将梯度稀释
trimer的结合能力有所下降。此外，抗体38的结合位点在s1亚基上的非rbd区域；而抗体39的结合位点在s2亚基上。
[0166]
2.2蛋白质相互作用仪测定抗体38和39亲和动力学
[0167]
将生物素化的s-trimer以10μg/ml的浓度上样链霉亲和素包被过的蛋白质相互作用仪的生物传感器上，然后再将5倍梯度稀释(浓度为：50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm)的抗体38或39上样到传感器上，检测抗体与s-trimer的亲和力，并计算解离常数(kd值)。具体的实验结果如图4所示，抗体38和39的kd值分别为7.15nm和0.10nm，表明38号抗体和39号抗体与wt毒株的s-trimer的亲和力极高。抗体38对奥密克戎变异株的s-trimer的亲和力(8.97nm)与wt毒株相近，但是抗体39对奥密克戎变异株的s-trimer的亲和力下降较多。
[0168]
2.3假病毒中和试验测定38和39号抗体的半抑制浓度
[0169]
使用hek293t细胞转染4种质粒：sars-cov-2s蛋白、荧光素酶、rsv-rev和pmdl g/p rre vectors，于48和72小时后收集含有大量假病毒颗粒的细胞上清。
[0170]
稳定表达人ace2受体的hek293t细胞(hek293t-ace2)接种在96孔板中包被过夜培养，假病毒与梯度稀释(10-1
、100、101、102、103μg/ml)的38或39号抗体在37℃共培养1小时，然后加入96孔板中。24小时后去掉上清，检测荧光素酶信号强度，并计算抗体的半抑制浓度(ic50)。具体实验结果如图5所示，两种抗体均能抑制假病毒感染hek293t-ace2细胞，抗体38和39对模拟wt毒株的假病毒的ic50分别为10.1和2.1μg/ml，而对奥密克戎的假病毒的ic50分别为15.6和5.7μg/ml。结果说明两个抗体对于wt毒株和奥密克戎变异株均有较强的中和能力。
[0171]
2.4elisa检测32抗体与sras-cov-2病毒的n蛋白的结合能力
[0172]
96孔板中加入n蛋白包被过夜，5％牛奶封闭后，将纯化好的抗体按比稀释(10-2
、10-1
、100、101μg/ml)加入不同5％牛奶室温封闭1小时后，将梯度稀释后的患者血清加入elisa板中室温孵育1小时45分钟。pbst(含0.05％吐温20)洗板三遍，加入二抗温孵育1小时20分钟。最后加入3，3，5，5，-四甲基联苯胺，在450nm波长下记录读数。抗体32与n蛋白结合的od450测定值如图6所示，32号抗体具有较高的结合能力，表明该抗体能够用于检测n蛋白。
[0173]
实施例3抗体的识别位点检测
[0174]
3.1生物信息预测39号抗体的识别位点
[0175]
根据39号抗体的氨基酸序列(序列号)，利用modeler程序模拟出其蛋白结构，如图7中c和d图所示。再从蛋白质数据库(protein data bank，pdb)下载分辨率为的s-trimer电子显微结构，通过h-dock程序进行39号抗体与s-trimer的蛋白对接分析。具体实验结果如图7所示，图7中a图标注出了s蛋白中的主要结构域以及起始和结束氨基酸序号；图7中b图标注出了39号抗体和s-trimer的结合位点。可以看出，39号抗体主要结合在hr1区域内的n953、q954和q957和临近hr1区域的y1007、v1040、d1041和g1044位点。此外，靠近s1/s2裂解位点区域内的d614、c649、e661、i670和i726也是39的结合位点。
[0176]
3.2验证39号抗体的识别位点
[0177]
为了验证生物信息蛋白分子对接模型的预测结果，发明人构建了包含wt毒株s蛋白全长的质粒、敲除了hr1、985-1162氨基酸以及hr2区域的s蛋白质粒，其中，s蛋白全长的
氨基酸序列如seq id no:42所示，具体构建方式如图8中a图所示。将这些质粒分别转染hek293t细胞，并设置未转染质粒的hek293t细胞为对照组，于48小时后收集转染质粒和未转染质粒的hek293t细胞。通过免疫印迹实验，首先验证了s蛋白在细胞内正常表达(图8中b图)。再通过流式细胞术，分别检测抗体39号与未转染质粒和转染了不同质粒的hek293t细胞结合能力。具体实验结果如图8中c图所示，抗体39可以识别全长s蛋白和敲除了hr2结构域的s蛋白。但是，当敲除了985-1162区间的氨基酸序列，或者敲除hr1结构域后，39号抗体不能识别细胞表达的s蛋白，证明39号抗体与s蛋白的结合位点在这两个区域内，与分子对接模型预测结果相符。
[0178]
wt毒株s蛋白全长氨基酸序列：
[0179]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:42)。
[0180]
实施例4抗体对s2蛋白亚基介导的细胞膜融合过程的抑制作用
[0181]
将表达gfp蛋白的质粒单独或者和wt毒株s蛋白或者奥密克戎变异株s蛋白的质粒共同转染hek293t细胞。将其与同型对照抗体、38或39号抗体于37℃培养箱共孵育1小时。做为阴性对照，只转染表达gfp蛋白的质粒不添加任何抗体。然后将细胞加入到提前一晚以每孔10000个细胞的密度铺板96孔板的hek293t-ace2细胞中共同培养8小时。通过荧光显微镜拍照记录细胞融合情况并计算细胞平均面积(减去只转染表达gfp蛋白的质粒细胞面积的平均值)。实验结果如图9所示，38和39号抗体均能对wt毒株或者奥密克戎毒株的s2蛋白亚基介导的膜融合过程产生抑制作用。
[0182]
wt毒株s蛋白全长氨基酸序列：
[0183]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgf
saleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:42)。
[0184]
奥密克戎毒株s蛋白全长氨基酸序列：
[0185]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhvisgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasieksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpfldhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpiivrepedlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfdevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynlapfftfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnkldskvsgnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagnkpcngvagfncyfplrsysfrptygvghqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfnglkgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqgvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaeyvnnsyecdipigagicasyqtqtkshrrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlkraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikyfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfkgltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnhnaqalntlvkqlsskfgaissvlndifsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:43)。
[0186]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结
合和组合。
[0187]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种抗体，其特征在于，含有选自下列至少之一的cdr序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：轻链可变区cdr序列：seq id no:1～9；重链可变区cdr序列：seq id no:10～18。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括：分别如seq id no:1、2和3或者与seq id no:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；或者分别如seq id no:4、5和6或者与seq id no:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；分别如seq id no:7、8和9或者与seq id no:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列。3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括：分别如seq id no:10、11和12或者与seq id no:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；或者分别如seq id no:13、14和15或者与seq id no:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；分别如seq id no:16、17和18或者与seq id no:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列。4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，具有如seq id no:19所示的轻链可变区，和seq id no:20所示的重链可变区，或者与seq id no:19和seq id no:20所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；具有如seq id no:21所示的轻链可变区，和seq id no:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与seq id no:21和seq id no:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；具有如seq id no:23所示的轻链可变区，和seq id no:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与seq id no:23和seq id no:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，还含有fc区，所述fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述fc区的至少一部分来自人源igg或其突变体；任选地，所述fc区的至少一部分来自人源igg1或其突变体。7.根据权利要求5或6所述的抗体，其特征在于，所述fc区具有如seq id no:25和26所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1-7任一项所述的抗体，其特征在于，用于结合sars-cov-2的s蛋白或n蛋白；任选地，用于结合s1蛋白的第14-330或528-685位氨基酸；任选地，用于结合s2蛋白的第910-985或985-1162位氨基酸；
任选地，所述s1蛋白具有如seq id no:27所示的氨基酸序列，所述s2蛋白具有如seq id no:28所示的氨基酸序列，所述n蛋白具有如seq id no:29所示的氨基酸序列。9.根据权利要求1-8任一项所述的抗体，其特征在于，具有如seq id no：30-35所示的氨基酸序列。10.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-9任一项所述的抗体。11.根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，具有seq id no：36-41所示的核苷酸序列。12.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求10或11所述的核酸分子。13.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体或权利要求1-9任一项所述的抗体。14.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求1-9任一项所述的抗体、权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体或权利要求13所述的重组细胞。15.权利要求1-9任一项所述的抗体、权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体、权利要求13所述的重组细胞或权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防新型冠状病毒。16.一种药物，其特征在于，包括：1-9任一项所述的抗体、权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体、权利要求13所述的重组细胞或权利要求14所述的组合物，所述药物用于治疗或预防新型冠状病毒感染。17.一种疫苗，其特征在于，包括：权利要求1-9任一项所述的抗体、权利要求10或11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体或权利要求13所述的重组细胞。18.根据权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗呈适于吸入或者注射方式给药的形式。19.根据权利要求17所述的疫苗，其特征在于，还包含至少一种佐剂。20.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-9任一项所述的抗体。21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于诊断或检测新型冠状病毒。

技术总结
本发明提出了一种治疗和检测新型冠状病毒感染的抗体及其应用，该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～9；重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:10～18。本发明所制备的抗体能靶向新型冠状病毒的S蛋白非RBD区域以及N蛋白，持续使用所述抗体较RBD抗体增加病毒抗药性的概率显著降低，可以有效治疗或预防新型冠状病毒。治疗或预防新型冠状病毒。


技术研发人员：张素平 苏杭 移振飞
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2022.06.02
技术公布日：2023/7/25