一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器

1.本发明属材料化学领域，涉及金属有机框架纳米粒，具体涉及一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz及其合成方法和应用。


背景技术：

2.现有技术公开了随着纳米技术的发展，纳米粒介导的药物递送系统已经促进了化疗在肿瘤治疗中的全面发展，其中，由金属离子和有机配体组成的金属有机框架(metalorganicframeworks，mof)具有结晶度高、比表面积大以及生物相容性好而备受关注。目前，基于mof设计的纳米递药策略主要是通过封装不同成分的药物如酶、化疗药物和光敏剂以及将特殊金属元素如fe和co等直接纳入其框架，形成新型的纳米递送系统，用于癌症联合治疗。然而，对传统mof的研究主要停留在载体递送水平，其载体成分在体内的生物效应仍然没有得到有效开发和探索，致使大多数mof纳米载体无法有效地向临床应用转化。而且，大多数 mof的合成方法复杂，对包载药物的活性影响较大。
3.近几年，基于传统mof的制备工艺基础，以锌离子(zn
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)介导的金属有机框架zif，因其合成条件简单温和、尺寸可控、孔容大以及结构均一等特点在肿瘤纳米医学中应用广泛而备受青睐。除了进行化疗药如阿霉素，紫杉醇等的靶向可控递送外，zif可以在不影响酶活性的前提下，进行生物酶的靶向递送，发展癌症治疗新策略。其中，葡萄糖氧化酶gox介导的饥饿治疗策略，在zif的介导下可以有效地通过氧化葡萄糖降低肿瘤细胞的能量供应。同时，产生活性氧ros在化疗药物的共递送策略下，实现肿瘤的联合治疗。而且，最新研究表明， zn
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可以干扰细胞还原性酶系统如谷胱甘肽还原酶gr和硫氧还蛋白还原酶trxr的抗氧化能力以及线粒体功能，诱导细胞凋亡。因此，进一步开发以zif为基础的纳米递送载体，研究其在肿瘤细胞水平的生物学功能，对于mof在肿瘤临床治疗的应用意义非凡。
4.基于现有技术的现状，本技术拟提供新的金属有机框架纳米粒，具体涉及一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器及其合成方法和应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是基于现有技术的现状，针对现有金属有机框架在制备及应用上的不足，提供新的金属有机框架纳米粒，具体涉及一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz的合成及应用。
6.本发明通过简单易执行的合成方法，将dox和gox同时封装到zif中，制备金属有机框架纳米酶反应器dgz，进行肿瘤联合治疗。dgz不仅对gox的活性具有保护作用，而且能通过ph的响应性降解，实现递送药物的可控释放。当dox和gox被有效递送到肿瘤组织后，dgz通过酸响应降解，释放化疗药和葡萄糖氧化酶，进行肿瘤饥饿协同化疗。同时，dgz 在降解过程中会释放zn
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，通过抑制干扰肿瘤细胞的线粒体功能和破坏肿瘤细胞的抗氧化平衡，进一步增强dgz介导的饥饿协同化疗的抗肿瘤效果。
7.本发明中涉及的金属有机框架纳米酶反应器dgz，是通过一步合成的自组装反应，
以醋酸锌为原料，二甲基咪唑的水溶液为反应介质，通过对化疗药阿霉素dox和葡萄糖氧化酶 gox的共包载制备所得。所述的dgz通过释放锌离子(zn
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)，干扰肿瘤细胞内稳态平衡，增强dox和gox介导的肿瘤饥饿协同化疗的治疗效果。
8.本发明中，以醋酸锌原料，二甲基咪唑的水溶液为反应介质制备金属有机框架zif；
9.本发明中，以阿霉素dox为化疗药，以葡萄糖氧化酶gox为酶，通过zif进行共包载递送，形成金属有机框架纳米酶反应器dgz；
10.本发明中，dgz的制备在常温下进行，药物的加入未影响到zif的结晶结构。
11.更具体的，本发明提供了一种金属有机框架纳米酶反应器dgz的合成方法并探讨其应用。
12.所述方法其包括如下反应步骤：
13.(1)将醋酸锌为原料，二甲基咪唑水溶液为反应介质，进行金属有机框架zif的制备；
14.(2)在反应(1)的体系中，加入dox和gox，进行金属有机框架纳米酶反应器dgz 的制备；
15.(3)将反应(2)中的dgz通过水洗和离心的交替操作，进行纯化，通过真空干燥得到高纯度的dgz；
16.本发明步骤(1)中，反应温度为室温，反应时间为0.5～2h。
17.本发明步骤(1)中，醋酸锌在反应体系中的浓度范围为1～3mg/ml。
18.本发明步骤(1)中，二甲基咪唑在反应体系中浓度范围为70～100mg/ml。
19.本发明步骤(2)中，阿霉素dox和葡萄糖氧化酶gox的质量比为1:2～3:1.
20.本发明步骤(2)中，醋酸锌与所投药物的质量比为6:1～2:1.
21.本发明步骤(2)中，dgz的固化为真空冷冻干燥，时长在10h以上。
22.本发明所提供的dgz，尺寸为115nm左右。与zif对比，晶格排布未受到包载药物的影响。
23.本发明所提供的dgz中，同时存在阿霉素dox和葡萄糖氧化酶的特征吸收峰，表明药物被成功包载。其中，对阿霉素dox载药量为23.45％，对葡萄糖氧化酶的载药量为4.81％。
24.本发明所提供的dgz中，葡萄糖氧化酶gox的活性稳定，能催化葡萄糖产生葡萄糖酸，降低溶液ph。而且，ph的降低与葡萄糖浓度成反比。
25.本发明中所提供的dgz中，具有ph响应降解特性，在弱酸条件下，降解迅速，可以实现化疗药物和zn
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的缓控释放。
26.本发明中所提供的dgz中，释放的zn
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可以干扰谷胱甘肽还原酶gr和硫氧还蛋白还原酶trxr的活性，破坏细胞内的抗氧化平衡；干扰线粒体的功能如诱导线粒体肿大，降低线粒体膜电位以及影响α酮戊二酸脱氢酶活性，破坏细胞内能量代谢和内稳态平衡，促进肿瘤细胞大面积凋亡。
附图说明
27.图1：透射电镜法表征dgz(bar＝100nm)。
28.图2：x射线衍射法表征dgz和zif。
29.图3：差示扫描量热法分析dgz。
30.图4：紫外分光光度法表征dgz对dox和gox的载药量。
31.图5：dgz中gox的稳定性研究。
32.图6：gox和dgz介导的不同葡萄糖浓度的水溶液ph值变化。
33.图7：dgz的降解形貌学分析。
34.图8：dgz介导的zn
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和dox释放。
35.图9：dgz介导zn
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的细胞内转运。
36.图10：zn
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干扰硫氧还蛋白还原酶trxr和谷胱甘肽还原酶gr的活性。
37.图11：zn
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干扰α酮戊二酸脱氢酶活性。
38.图12：zn
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诱导肿瘤细胞线粒体肿胀情况考察结果。
39.图13：zn
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诱导肿瘤细胞线粒体膜电位降低及凋亡。
40.图14：不同治疗策略下原位乳腺癌小鼠肿瘤体积变化曲线。
41.图15：不同治疗策略下原位乳腺癌小鼠肿瘤细胞凋亡特性。
具体实施方式
42.实施例1.
43.将44mg的醋酸锌加入到10ml的纯水中，超声10min后，再先后加入1ml的dox(4 mg/ml)水溶液和1ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
44.实施例2.
45.将44mg的醋酸锌，4mg的dox和3mg的gox，加入到12ml的纯水中，磁力搅拌10 min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
46.实施例3.
47.将44mg的醋酸锌加入到12ml的纯水中，超声10min后，再加入4mg的dox和3mg 的gox磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在 25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
48.实施例4.
49.将44mg的醋酸锌加入到10ml的纯水中，超声10min后，再先后加入1ml的dox(4 mg/ml)水溶液和1ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，在反应溶液快速加入2g二甲基咪唑，然后再加入15ml的纯水，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
50.实施例5.
51.将50mg的醋酸锌加入到10ml的纯水中，超声10min后，再先后加入1ml的dox(4 mg/ml)水溶液和2ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
52.实施例6.
53.将50mg的醋酸锌，4mg的dox和6mg的gox，加入到13ml的纯水中，磁力搅拌10 min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
54.实施例7.
55.将50mg的醋酸锌加入到13ml的纯水中，超声10min后，再加入4mg的dox和6mg 的gox磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入15ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在 25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
56.实施例8.
57.将50mg的醋酸锌加入到10ml的纯水中，超声10min后，再先后加入1ml的dox(4 mg/ml)水溶液和2ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，在反应溶液快速加入2g二甲基咪唑，然后再加入15ml的纯水，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
58.实施例9.
59.将44mg的醋酸锌加入到8ml的纯水中，超声10min后，再先后加入2ml的dox(4 mg/ml)水溶液和1ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入10ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
60.实施例10.
61.将44mg的醋酸锌，8mg的dox和3mg的gox，加入到11ml的纯水中，磁力搅拌10 min后，将反应溶液快速加入10ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
62.实施例11.
63.将44mg的醋酸锌加入到11ml的纯水中，超声10min后，再加入8mg的dox和3mg 的gox磁力搅拌10min后，将反应溶液快速加入10ml含2g二甲基咪唑的水溶液中，在 25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
64.实施例12.
65.将44mg的醋酸锌加入到8ml的纯水中，超声10min后，再先后加入2ml的dox(4 mg/ml)水溶液和1ml的葡萄糖氧化酶gox水溶液(3mg/ml)。磁力搅拌10min后，在反应溶液快速加入2g二甲基咪唑，然后再加入10ml的纯水，在25℃下搅拌10h。最后，通过水洗和离心操作纯化最终产物，通过真空冷冻干燥得到固体产物。
66.实施例13.
67.通过jem-2010透射电镜观察实施例1所制备的dgz，结果显示该纳米点具有均一的尺寸，粒径在115nm左右，如图1所示。
68.实施例14.
69.通过xrd衍射仪观察实施例1所制备的dgz，结果显示，与zif对比，药物的加入并未破坏dgz的结晶体结构，如图2所示。
70.实施例15.
71.通过差示扫描量热法分析实施例所制备的dgz，结果显示，dgz中同时存在dox和
gox 的特征吸收峰，表明dgz成功负载dox和gox，如图3所示。
72.实施例16.
73.通过紫外分光光度法考察实施例1制备的dgz中载药量情况，结果显示dgz中阿霉素 dox载药量为23.45％，对葡萄糖氧化酶的载药量为4.81％，结果如图4所示。
74.实施例17.
75.通过检测溶液ph值，考察实施例1制备的dgz对gox活性的保护，结果显示，与游离的gox相比，在加入胰蛋白酶之后，dgz可以保护gox的活性，其能够正常进行葡萄糖的氧化反应，产生葡萄糖酸，导致溶液ph下降，结果如图5所示
76.实施例18.
77.通过检测溶液ph值，考察实施例1制备的dgz和gox中氧化酶活性考察，结果显示，与游离的gox相比，dgz实现了gox的控制释放，溶液中葡萄糖酸的产出没有gox那样激烈。而且，随着葡萄糖浓度的升高，gox介导的葡萄糖氧化反应更激烈，结果如图6所示
78.实施例19.
79.通过tem，考察不同介质中dgz的降解特性，结果显示，随着ph的降低，dgz的降解速率升高。而且，在含有葡萄糖的酸性介质中，由于葡萄糖氧化产生的葡萄糖酸，溶液ph 进一步下降，进而促进dgz进一步降解，结果如图7所示。
80.实施例20.
81.通过对溶液中zn
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和游离dox的检测，考察dgz对dox和zn
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的释放特性。结果如图 8所示，在弱酸条件下，dgz可以明显加速dox和zn
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的释放。
82.实施例21.
83.通过荧光探针标记，借助于激光共聚焦显微镜，考察不同处理条件下的zn
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在细胞中的分布情况。结果所示，zif介导的纳米粒能释放zn
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，其中，dgz中在葡萄糖氧化产酸的作用，由于zif的迅速降解，促使大量zn
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被释放。这些释放的zn
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可以分部到细胞各处，包括线粒体，结果如图9所示。
84.实施例22.
85.通过检测不同处理条件下谷胱甘肽还原酶gr和硫氧还蛋白还原酶trxr活性，考察dgz 对细胞抗氧化能力的干扰。结果如图10所示，zif介导的纳米粒能够降低gr和trxr酶的活性。其中，dgz在葡萄糖氧化产酸的作用下，促使zif的迅速降解，释放大量zn
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，干扰更多的抗氧化酶活性。
86.实施例23.
87.通过检测不同处理条件下α酮戊二酸脱氢酶的酶活性，考察dgz对线粒体酶的活性影响。结果如图11所示，zif介导的纳米粒能够降低线粒体酶的活性。其中，dgz在葡萄糖氧化产酸的作用下，促使zif的迅速降解，释放大量zn
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，进而更多的去干扰线粒体酶活性。
88.实施例24.
89.通过荧光探针标记，借助于激光共聚焦显微镜，考察不同处理条件下的细胞线粒体的状态和细胞凋亡情况。结果所示，zif介导的纳米粒能够降低肿瘤线粒体的膜电位(图13)，促使线粒体肿胀(图12)。其中，dgz在葡萄糖氧化产酸的作用下，促使zif的迅速降解，释放大量zn
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，诱导更多的线粒体功能障碍。同时，dgz在zn
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介导的抗氧化失衡的基础上，通过饥饿协同化疗，诱导更多的肿瘤细胞发生凋亡(图13)。
90.实施例25.
91.通过原位乳腺癌小鼠，考察dgz的抗肿瘤效果。结果显示(图14)，zif介导的纳米粒在一定程度上抑制了肿瘤的生长。其中，dgz由于联合dox介导的化疗和gox介导的饥饿疗法，再加上zn
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介导的细胞内抗氧化失衡和线粒体功能障碍，促使更多的肿瘤细胞发生凋亡 (图15)，化疗协同饥饿治疗的抗肿瘤效果得到明显改善。

技术特征：
1.一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz，其特征在于，按下述方法制备，室温条件下，通过一步合成的自组装反应，以醋酸锌为原料，二甲基咪唑的水溶液为反应介质，通过对化疗药阿霉素dox和葡萄糖氧化酶gox的共包载制备所得；其中，醋酸锌在反应体系中的浓度范围为1～3mg/ml，二甲基咪唑在反应体系中浓度范围为70～100mg/ml，阿霉素dox和葡萄糖氧化酶gox的质量比为1:2～3:1，醋酸锌与dox和gox的总质量比为6:1～2:1。2.根据权利要求1所述的增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz，其特征在于，所述方法中，其固化方法为真空冷冻干燥，时间在10h以上。3.根据权利要求1所述的增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz，其特征在于，所述的反应器dgz，其具有ph响应降解特性，在弱酸条件下可快速降解，能有效维持葡萄糖氧化酶的活性，控制dox和zn
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释放。4.权利要求1所述的增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器dgz在用于制备肿瘤饥饿协同化疗的治疗药物制剂中的用途。5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的反应器dgz通过zn
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干扰细胞的抗氧化稳态和线粒体功能，增强dox和gox介导的肿瘤饥饿协同化疗的治疗效果。6.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的反应器dgz，降解后释放的zn
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干扰细胞的抗氧化酶活性，破坏细胞的抗氧化平衡，实现活性氧的有效蓄积；同时，释放的zn
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损害线粒体的功能如诱导线粒体肿大，降低线粒体膜电位以及影响线粒体酶活性，破坏细胞能量供应链，增强dgz介导肿瘤饥饿协同化疗的治疗效果。

技术总结
本发明属材料化学领域，涉及金属有机框架纳米粒，具体涉及一种增强肿瘤饥饿协同化疗的金属有机框架纳米酶反应器及其合成方法及应用。本发明通过一步合成的自组装反应，将阿霉素DOX和葡萄糖氧化酶GOX同时封装到金属有机框架ZIF中，形成金属有机框架纳米酶反应器DGZ。DGZ具有大小均一的粒径，高的载药量以及对GOX活性的有效保护。在肿瘤微环境中，DGZ可以响应弱酸刺激发生降解，从而控制释放DOX和GOX，实现肿瘤的饥饿协同化疗治疗策略。同时，ZIF降解过程中释放的Zn


技术研发人员：黄容琴 霍涛涛
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2023/7/25