过氧化氢敏感的共价环糊精骨架及其制备方法和应用

1.本发明涉及医学生物材料领域，具体地涉及过氧化氢敏感的共价环糊精骨架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.污染或空气质量下降，以及老龄化的加重，呼吸系统疾病的发病率越来越高。慢性阻塞性肺疾病，简称慢阻肺(copd)，是以持续性呼吸道症状和不完全可逆气流受限为特征的一种疾病。近年来，慢阻肺已成为全球重要的公共卫生问题，其患病率和病死率均呈现上升趋势。据世界卫生组织估计，至2030年，慢阻肺将成为全球第3大致死性疾病。目前，我国40岁以上慢阻肺患者人数已接近1亿人。copd的发病机制主要为气道和肺组织的慢性炎症反应、氧化抗氧化失衡、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、气道重塑、遗传等。其中，气道慢性炎症和氧化应激在copd病程中发挥着重要作用，也决定着病情恶化程度。急性肺损伤(ali)主要由炎症、氧化应激与肺功能障碍所引起，其特征是弥漫性肺泡肺间质水肿，难治性低氧血症及非心源性肺水肿。ali的临床表现为进行性低氧血症和呼吸困难。虽然已有公认的预防或治疗ali的方法，但也伴随着许多不良反应，死亡率高达40％。在肺部疾病的治疗中，肺部给药是重要的给药途径，因为肺有巨大的比表面积，且肺中的血管丰富，肺部给药还能避免口服给药的吸收屏障。肺部给药用于治疗呼吸系统类疾病能直接靶向病灶部位、增强药物的疗效、减少毒副作用，同时也能减少给药剂量，降低患者的经济负担。干粉吸入剂(dry powder inhaler,dpi)在肺部给药剂型中具有吸入效率高、易于使用、无抛射剂和大气污染、稳定性好等优点。
3.溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是一种结肠黏膜特发性的终生炎症性肠病且病程不可预测，其临床主要表现为腹痛、不可控的腹泻、黏液脓血便和体重减轻等，导致患者生活质量严重降低和残疾。然而，uc发病机制复杂且临床上至今没有特效药，目前常规治疗为每日服用高剂量的免疫抑制剂或抗炎药，通常会伴有严重的不良反应。因此，临床上迫切需要研发将药物靶向递送至发炎结肠病灶部位的智能载体，以实现药物的增效、减毒。
4.综上，本领域需要提供优异生物安全性、适宜生物可降解性、可靶向病灶部位、促进药物疗效的药物载体。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供具备优异生物安全性、适宜生物可降解性、可靶向病灶部位、促进药物疗效的过氧化氢敏感性的共价环糊精骨架材料(cof)。
6.本发明的共价环糊精骨架具有过氧化氢敏感性，能够降低过氧化氢的水平，在体内外均表现出良好的抗氧化、抗炎能力，还可与药物分子发挥协同治疗作用。本发明的共价环糊精骨架还具有适宜的生物可降解性、良好的生物安全性，还具有巨大的比表面积可用于负载药物，是一种性能优异的药物载体。
7.本发明第一方面，提供了一种过氧化氢敏感的共价环糊精骨架(cof)，其特征在于，所述共价环糊精骨架为具有一个或多个下述特征的环糊精-金属有机骨架(cd-mof)：
8.具有共价连接的过氧草酸酯基(-o-c(＝o)-c(＝o)-o-)；和/或
9.通过苯硼酸酯类交联剂共价修饰。
10.在另一优选例中，所述共价环糊精骨架为具有共价连接的过氧草酸酯基的环糊精-金属有机骨架(oc-cof)。
11.在另一优选例中，所述共价环糊精骨架为通过苯硼酸酯类交联剂共价修饰的环糊精-金属有机骨架(b-cof)。
12.在另一优选例中，所述苯硼酸酯类交联剂为brap
13.在另一优选例中，所述过氧草酸酯基为通过草酰类交联剂与环糊精-金属有机骨架反应产生的。
14.在另一优选例中，cd-mof与草酰类交联剂的摩尔比为为1:0.01-40，较佳地，1:0.1-30，较佳地，1:1-20，如1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
15.在另一优选例中，所述草酰类交联剂为草酰氯
16.在另一优选例中，cd-mof与苯硼酸酯类交联剂的摩尔比为为1:0.01-40，较佳地，1:0.1-30，较佳地，1:1-20，如1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
17.在另一优选例中，所述cd-mof为立方形cd-mof。
18.本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的共价环糊精骨架在制备药物组合物中的用途。
19.在另一优选例中，所述共价环糊精骨架在所述药物组合物中作为药物载体和/或ros清除剂和/或抗炎活性成分。
20.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为液体制剂或固体制剂。
21.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：片剂、含片、悬液、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆、酏剂、干粉吸入剂、喷雾剂、粉雾剂或气雾剂、溶液、灌肠剂、注射剂、贴剂、敷剂。
22.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服剂型、吸入剂型、直肠给药剂型。
23.在另一优选例中，所述药物组合物靶向h2o2水平上调的病灶部位，如炎症部位。
24.在另一优选例中，所述药物组合物用于治疗炎性疾病，如肺部炎性疾病、胃肠道炎性疾病。
25.本发明第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
26.(a)如权利要求1所述的共价环糊精骨架；和
27.(b)负载在所述的共价环糊精骨架上的第一活性成分。
28.在另一优选例中，所述第一活性成分为小分子化合物、蛋白药物、核酸等。
29.在另一优选例中，所述药物组合物中，所述第一活性成分与共价环糊精骨架的重
量比为0.001-40wt％，较佳地0.01-30wt％，更佳地0.1-20wt％，如1wt％、2wt％、5wt％、10wt％或15wt％。
30.在另一优选例中，所述第一活性成分为治疗肺部疾病的药物，例如，支气管扩张剂、β2受体激动剂、抗胆碱药物，吸入性糖皮质激素、抗炎药物、抗菌药物、抗病毒药物，或其组合。
31.在另一优选例中，所述的第一活性成分选自下组：如糖皮质激素类氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、丙酸氟替卡松、二丙酸氯地米松、布地奈德、地塞米松、倍氯米松；β2受体激动剂如沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、福莫特罗、茚达特罗；胆碱能受体拮抗剂如噻托溴铵、异丙托溴铵等；茶碱类药物如氨茶碱、二羟丙茶碱、多索茶碱等、罗氟司特、西洛司特、awd-12-281、tofimilast、uk-500001、gsk256066、sch900182、chf 6001、org-9935、扎达维林、benzafentrine、pumafentrine、ensifentrine、川芎嗪、姜黄素、槲皮素、白藜芦醇、丹参酮ⅱa、丹皮酚、木犀草素、苦参碱、橙皮素、银杏内酯、穿心莲内酯、甜菊糖苷、芦丁、茶多酚、黄芩素，或其组合。
32.在另一优选例中，所述肺部疾病选自下组：慢阻肺、急性肺损伤、肺部感染。
33.在另一优选例中，所述第一活性成分为治疗胃肠道疾病(尤其是胃肠道炎性疾病，如炎症性肠病、急性溃疡性结肠炎)的药物，如糖皮质激素，氨基水杨酸类，中药活性成分或其组合。
34.在另一优选例中，所述第一活性成分选自下组：泼尼松龙、地塞米松、5-氨基水杨酸、柳氮磺胺吡啶、白藜芦醇、小檗碱，或其组合。
35.在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他药学上可接受的载体。
36.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为液体制剂或固体制剂。
37.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：片剂、含片、悬液、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆、酏剂、干粉吸入剂、喷雾剂、粉雾剂或气雾剂、溶液、灌肠剂、注射剂、贴剂、敷剂。
38.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服剂型、吸入剂型、直肠给药剂型。
39.在另一优选例中，所述药物组合物靶向h2o2水平上调的病灶部位，如炎症部位。
40.本发明第四方面，提供了一种如本发明第三方面所述的药物组合物的制备方法，包括步骤：
41.(i)提供所述第一活性成分的溶液；
42.(ii)加入所述共价环糊精骨架并分散，搅拌孵育，过滤并干燥，从而将所述第一活性成分负载在共价环糊精骨架上。
43.在另一优选例中，所述孵育的温度为25-80℃，较佳地，40-60℃。
44.在另一优选例中，所述孵育的时间为1-48h，较佳的，12-36h。
45.本发明第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的过氧化氢敏感的共价环糊精骨架的制备方法，包括步骤：
46.(1)提供cd-mof；和
47.(2)在惰性溶剂中，碱性催化剂存在下，使草酰类交联剂与cd-mof反应，从而得到具有过氧草酸酯基的共价环糊精骨架。
48.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(3)在有机溶剂中，催化剂和连接剂存在
下，使苯硼酸酯类交联剂与所述具有过氧草酸酯基修饰的共价环糊精骨架反应，从而得到有具过氧草酸酯基且被苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架。
49.在另一优选例中，所述cd-mof与草酰类交联剂和所述具有过氧草酸酯基修饰的共价环糊精骨架与苯硼酸酯类交联剂的摩尔比独立地为为1:0.01-40，较佳地，1:0.1-30，较佳地，1:1-20，如1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
50.在另一优选例中，所述步骤(2)的反应具有选自下组的一个或多个特征：
51.a)所述惰性溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
52.b)所述碱性催化剂选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
53.c)所述反应的温度为0-30℃，较佳地20-25℃；
54.d)所述反应的时间为3-72h，较佳地24-72h。
55.在另一优选例中，所述步骤(3)反应具有选自下组的一个或多个特征：
56.a)所述有机溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
57.b)所述催化剂为碱性催化剂，较佳地选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
58.c)所述连接体选自下组：碳酸二苯酯(dpc)；
59.d)所述连接体与苯硼酸酯类交联剂的摩尔比为1：0.2-1.2，较佳地1:0.5-0.9；
60.e)所述反应的温度为0-85℃，较佳地60-80℃；
61.f)所述反应的时间为10-36h，较佳地12-24h。
62.本发明第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的活性氧敏感的共价环糊精骨架的制备方法，包括步骤：
63.(1)提供cd-mof；和
64.(2)在有机溶剂中，催化剂和连接剂存在下，使苯硼酸酯类交联剂与cd-mof反应，从而得到苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架。
65.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(3)在惰性溶剂中，碱性催化剂存在下，使草酰类交联剂与步骤(2)得到苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架反应，从而得到具有过氧草酸酯基且被苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架。
66.在另一优选例中，所述cd-mof与苯硼酸酯类交联剂和所述苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架与草酰类交联剂的摩尔比独立地为为1:0.01-40，较佳地，1:0.1-30，较佳地，1:1-20，如1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
67.在另一优选例中，所述步骤(2)的反应具有选自下组的一个或多个特征：
68.a)所述有机溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
69.b)所述催化剂为碱性催化剂，较佳地选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
70.c)所述连接体选自下组：碳酸二苯酯(dpc)；
71.d)所述连接体与苯硼酸酯类交联剂的摩尔比为1：0.2-1.2，较佳地1:0.5-0.9；
72.e)所述反应的温度为0-85℃，较佳地60-80℃；
73.f)所述反应的时间为10-36h，较佳地12-24h。
74.在另一优选例中，所述步骤(3)的反应具有选自下组的一个或多个特征：
75.a)所述惰性溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
76.b)所述碱性催化剂选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
77.c)所述反应的温度为0-30℃，较佳地20-25℃；
78.d)所述反应的时间为3-72h，较佳地24-72h。
79.在另一优选例中，本发明的活性氧敏感的共价环糊精骨架为本发明第五方面或第六方面的方法制备的。
80.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
81.图1为实施例1中μm-cd-mof与μm-oc-cof的扫描电镜图；
82.图2为实施例1中cd-mof与oc-cof的红外图谱；
83.图3为实施例1中cd-mof与oc-cof的粉末x射线衍射图谱；
84.图4为实施例1中cd-mof与oc-cof的热重分析图谱；
85.图5为实施例2中nano-cd-mof与nano-oc-cof的扫描电镜图；
86.图6为实施例4中oc-cof的细胞安全性结果；
87.图7为实施例4中oc-cof在水溶液中孵育不同时间的降解情况；
88.图8为实施例4中oc-cof水解不同时间点的扫描电镜图；
89.图9为实施例4中oc-cof降低过氧化氢含量的曲线图；
90.图10为实施例4中oc-cof提高氧化环境中细胞的存活率图；
91.图11为实施例4中oc-cof体外抗氧化效果；
92.图12为实施例4中oc-cof体外抗凋亡效果；
93.图13为实施例4中rhob-oc-cof大鼠肺部吸入后的降解情况；
94.图14为实施例6中lig@oc-cof的扫描电镜图；
95.图15为实施例6中lig@oc-cof的粉末x射线衍射图谱；
96.图16为实施例6中lig@oc-cof的热分析图；
97.图17为实施例6中lig@oc-cof的热重分析图；
98.图18为实施例6中lig@oc-cof的红外图；
99.图19为实施例6中lig@oc-cof的体外沉积分布图；
100.图20为实施例6中lig@oc-cof体外抗炎作用；
101.图21为实施例6中lig和lig@oc-cof在肺泡单层上皮细胞的吸收情况；
102.图22为实施例6中lig@oc-cof改善copd大鼠肺功能；
103.图23为实施例6中copd大鼠各组肺组织切片图；
104.图24为实施例6中copd大鼠各组炎症因子和抗氧化因子释放情况；
105.图25为实施例6中copd大鼠各组肺组织胞内蛋白sod、nrf2和nf-κb的表达情况；
106.图26为实施例6中急性肺损伤大鼠肺组织he染色切片图；
107.图27为实施例6中急性肺损伤大鼠各组炎症因子水平；
108.图28为实施例6中急性肺损伤大鼠各组抗氧化指标；
109.图29为实施例6中急性肺损伤大鼠各组肺组织蛋白sod、nf-κb，nrf2表达情况；
110.图30为实施例7中bcof的粒径分布(a)和扫描电镜图(b)；
111.图31为实施例7中brap(a)和bcof(b)的核磁共振氢谱，bcof的红外图谱(c)和bcof的pxrd图谱(d)；
112.图32为实施例7中bcof在不同浓度(0，1和10mm)h2o2介质中的水解曲线(a)和bcof在不同(1.2，6.8和7.4)ph介质中的裂解曲线(b)；
113.图33为实施例7中bcof的细胞毒性测定(a)和bcof对环境中细胞的保护作用(b)；
114.图34为实施例7中uc造模过程中体重(a)、dai评分(b)和结肠长度变化(c)；
115.图35为实施例7中灌胃bcof后的结肠炎小鼠在不同时间点时体内心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠及结肠组织的活体成像代表性图片(a)和定量荧光分析(b)，bcof在灌胃6小时后在健康和结肠炎小鼠结肠组织分布的活体成像代表性图片(c)和定量荧光分析(d)(n＝3)；
116.图36为实施例7中bcof药效评价的给药方案示意图(a)，各组小鼠7天内体重百分率变化情况(b)，各组小鼠7天内dai变化情况(c)，各组小鼠的代表性图片(d)和结肠长度定量(e)(n＝6)；
117.图37为实施例7中各组小鼠结肠组织he切片；
118.图38为实施例7中各组小鼠结肠心、肝、脾、肺和肾组织he切片；
119.图39为实施例9中ber@bcof在0mm、1mm和10mm h2o2介质中的释药曲线(n＝3)(a)和ber@bcof在ph 1.2和ph 6.8介质中的释药曲线(n＝3)(b)；
120.图40为实施例10中pd@bcof对于小鼠7天内体重百分率变化情况(n＝6)(a)和小鼠7天内dai变化情况(n＝6)(b)。
具体实施方式
121.本发明人经过长期而深入的研究，以环糊精金属有机骨架(cd-mof)作为模板，合成了过氧化氢敏感的共价环糊精骨架cof。该cof具有过氧化氢敏感性，体内外均表现出良好的抗氧化和抗炎作用，可以与药物产生协同效果，促进药物疗效。此外，本发明的cof还具有良好的生物相容性、适宜的生物可降解性，以及强大的载药能力非常适合作为药物载体负载活性分子，制备针对某些疾病或给药途径的药物递送系统。在此基础上，发明人完成了本发明。
122.术语
123.除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
124.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
125.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
126.如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25
±
5℃。
127.环糊精-金属有机骨架
128.如本文所用，术语“环糊精-金属有机骨架”、“cd-mof”可互换使用，是将环糊精作
为有机配体，金属离子作为无机金属中心形成的新型、安全性较高、可药用的立方形环糊精-金属有机骨架，即cd-mof。
129.cd-mof是一种绿色的，生物可降解的超分子材料，是由药用辅料环糊精和金属离子配位结合形成的一种多孔性骨架材料。cd-mof具有多孔、比表面积大、形态规则等特点，且绿色、可食用、适合于药用。此外，cd-mof含有大量的羟基可被功能化修饰。
130.典型地，所述环糊精-金属有机骨架为环糊精与碱金属盐形成的骨架材料；碱金属包括但不限于li
+
、k
+
、rb
+
、cs
+
、na
+
、mg
2+
、sn
2+
、ag
+
、yb
+
、ba
2+
、sr
2+
、ca
2+
、la
3+
，优选k
+
。
131.典型地，所述环糊精-金属有机骨架材料的平均粒径为50nm-50μm，较佳地为100-500nm(纳米级)或1-5μm(微米级)。
132.典型地，制备环糊精-金属有机骨架(cd-mof)(参考专利cn201610125456.x)：所述制备方法包括将金属盐溶液与环糊精水溶液混合后，预加一部分有机溶剂，一定温度下，通过溶剂蒸汽扩散方法，反应一定时间，再加入尺寸调节剂，从而得到所述基于环糊精的金属有机骨架材料；或将金属盐溶液与环糊精水溶液混合，预加一部分有机溶剂，用溶剂热/微波/超声波振动反应介质，使得反应物快速反应，反应一定时间后加入尺寸调节剂，从而得到所述基于环糊精的金属有机骨架材料。
133.典型地，所述金属盐溶液中金属盐的浓度为0.05-0.4m，优选0.2m。
134.典型地，所述环糊精水溶液中环糊精的浓度为0.013-0.05m，优选0.025m。
135.典型地，所述的环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、或其组合。
136.优选地，所述的环糊精为γ-环糊精。
137.优选地，所述环糊精-金属有机骨架为立方形。
138.h2o2敏感的共价环糊精骨架
139.本发明的共价环糊精骨架为具有一个或多个下述特征的环糊精-金属有机骨架(cd-mof)：具有共价连接的过氧草酸酯基(-o-c(＝o)-c(＝o)-o-)；和/或通过苯硼酸酯类交联剂共价修饰。
140.如本发明所用，术语“过氧化氢敏感的共价环糊精骨架”与“共价环糊精骨架”可互换使用，指本发明的过氧化氢敏感的共价环糊精骨架。
141.本发明通过对cd-mof进行共价修饰，从而提供了一种对h2o2敏感的共价环糊精骨架(cof)。具体地，通过交联剂对cd-mof进行特定基团的共价修饰，从而提供与cd-mof通过共价键连接的过氧草酸酯基和/或苯硼酸酯基。
142.如本发明所用，术语"草酸类交联剂"是指能够与cd-mof反应(如羟基)生成或提供过氧草酸酯基(-o-c(＝o)-c(＝o)-o-)的物质。
143.如本发明所用，术语"苯硼酸酯类交联剂"是指能够与cd-mof(如羟基)反应生成或提供苯硼酸酯基的物质。
144.其中，能够与cd-mof反应生成过氧草酸酯基的草酸类交联剂对本领域技术人员而言是已知的，包括但并不限于草酰氯
145.优选地，所述苯硼酸酯类交联剂包括但并不限于brap
146.本发明所述的共价环糊精骨架，不同于现有报道的共价环糊精骨架，碳酸二苯酯或环氧氯丙烷交联的共价环糊精骨架均无h2o2响应性，3,3
’‑
二巯基双丙酰氯交联的共价环糊精骨架具有谷胱甘肽响应性，尚无具有活性氧响应性的具有立方结构的共价环糊精骨架的报道。
147.用途、药物组合物
148.本发明的过氧化氢敏感的共价环糊精骨架具有抗炎和ros清除活性，可作为活性成分用于制备抗炎剂和ros清除剂，特别是对过氧化氢水平较高的病灶部位(如炎症部位)具有靶向性。
149.此外，本发明的共价环糊精骨架还具有强大且优异的载药能力，且对h2o2水平上调的部位(如炎症部位)具有靶向性，可作为药物载体，以实现高h2o2环境敏感性释药。
150.本发明的共价环糊精骨架还可以与其他治疗剂组合使用，所述其他治疗剂可以是与本发明的共价环糊精骨架简单混合使用，或独立地以单独的制剂分开使用，或者负载在本发明的共价环糊精骨架中。
151.进一步地，本发明人意外地发现，本发明的共价环糊精骨架载药后可与其负载的其他活性分子协同发挥治疗作用(包括但不限于抗氧化、抗炎)，从而能够更好的治疗疾病，优选地，所述疾病为存在h2o2水平上调的疾病。
152.如本发明所用，术语“h2o2水平上调的部位”指与正常对照/部位相比，所述部位的过氧化氢水平高出10％以上，20％以上，50％以上，甚至100％以上。
153.优选地，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
154.(a)如权利要求1所述的共价环糊精骨架；和
155.(b)负载在所述的共价环糊精骨架中的第一活性成分。
156.本发明的共价环糊精骨架可用于各种活性成分的负载，本领域技术人员可以根据需要选择所述第一活性成分，例如，(包括但并不限于)小分子化合物、蛋白药物、核酸等。通常，本发明的共价环糊精骨架既是一种药物递送载体，又能发挥其抗炎、ros清除活性和/或与第一活性成分发挥协同治疗作用。
157.在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他药学上可接受的载体。
158.优选地，本发明对药物组合物的剂型没有特别要求，例如以液体制剂或固体制剂形式；典型地包括(但并不限于)片剂、含片、悬液、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆、酏剂、干粉吸入剂、喷雾剂、粉雾剂或气雾剂、溶液、灌肠剂、注射剂、贴剂、敷剂等。此外，所述药物组合物可通过任意合适的途径施用，包括口服地、肠胃外地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、鼻地、含服地、阴道地或经由植入型药盒，将药物组合物施用给受试者，优选为口服地、吸入地、或直肠地给药。
159.向个体提供治疗有效量的活性成分的精确量将取决于给药方式、疾病和/或病症的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域普通技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。当与其他治疗剂组合施用时，任何其他治疗剂的“治疗有效量”将取决于所用药物的类型。合适的剂量对于批准的治疗剂是已知的，并且可以由本领域普通技术人员根据个体的状况、治疗的病症类型
和通过以下使用的本发明化合物的量进行调整，优选地，应如此配制组合物，使得可以将0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂剂量施用给接受这些组合物的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物提供了0.01mg至50mg的剂量。在其它实施方案中，提供了0.lmg-25mg或5mg-40mg的剂量。
160.本发明的药物组合物或治疗剂的给药对象的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。
161.制备方法
162.本发明的过氧化氢敏感的共价环糊精骨架可以以本领域常用的合成方法制备，只要能够在环糊精金属有机骨架上形成共价连接的过氧草酸酯基和/或苯硼酸酯基。
163.具体地，本发明的共价环糊精骨架的制备方法，可包括步骤：
164.(a)在惰性溶剂中，碱性催化剂存在下，使草酰类交联剂与cd-mof(或步骤(b)得到的苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架)反应，从而得到过氧草酸酯基修饰的共价环糊精骨架；和/或
165.(b)在有机溶剂中，催化剂和连接剂存在下，使brap与cd-mof(或步骤(a)获得的过氧草酸酯基修饰的共价环糊精骨架)反应，从而得到苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架。
166.在另一优选例中，所述步骤(a)的反应具有选自下组的一个或多个特征：
167.a)所述惰性溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
168.b)所述碱性催化剂选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
169.c)所述反应的温度为0-30℃，较佳地20-25℃；
170.d)所述反应的时间为3-72h，较佳地24-72h。
171.在另一优选例中，所述步骤(b)的反应具有选自下组的一个或多个特征：
172.a)所述有机溶剂选自下组：二氯甲烷、四氢呋喃、或其组合；
173.b)所述催化剂为碱性催化剂，较佳地选自下组：吡啶、三乙胺，或其组合；
174.c)所述连接体选自下组：碳酸二苯酯(dpc)；
175.d)所述连接体与brap的摩尔比为1：0.2-1.2，较佳地1:0.5-0.9；
176.e)所述反应的温度为0-85℃，较佳地60-80℃；
177.f)所述反应的时间为10-36h，较佳地12-24h。
178.本发明具有以下的主要优点：
179.本发明制备的环糊精骨架材料具有高度的过氧化氢响应性，作为药物载体，通过与过氧化氢反应降低炎症部位的活性氧浓度，缓解炎性疾病的进程，与药物分子协同发挥抗氧化和抗炎的治疗效果。在模拟胃肠道ph介质中保持稳定，有效提高氧化应激环境中细胞的生存率。制备工艺简单可控且生物相容性好，在生理条件下具有良好的可降解性，给药后不会造成蓄积毒性和炎症反应。
180.本发明所涉及的oc-cof作为可吸入载体所制备的干粉吸入剂具有优越的肺部沉积率，吸入后能到达肺泡部位，有助于降低给药剂量，促进药物在肺部的吸收，能大大提高肺部给药的治疗效果。例如，载体药物组合物lig@oc-cof干粉吸入剂用于治疗copd和急性肺损伤，给药后肺部的炎性细胞浸润减少，炎症因子的释放减少，氧化因子下降，抗氧化因子上升，肺功能得到改善。
181.本发明所涉及的载体材料bcof负载抗炎症性肠病药物，实现药物的增效减毒，大大提高溃疡性结肠炎的治疗效果。
182.与现有技术相比，本发明所述的载体兼具多重空腔负载药物能力、高度的过氧化氢响应性、以及规则颗粒形态特征。
183.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
184.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
185.实施例1
186.按摩尔比1:8分别称取γ-cd 14.584g和koh 5.049g，加入450ml的超纯水(18.2mω.cm)，超声溶解，经0.8μm水膜过滤，得到γ-cd-koh母液。以5:3(v/v)量取100ml母液和60ml甲醇于密闭容器中，剧烈振摇，混合均匀，置于60℃水浴中，待溶液澄清后，加热20min。每100ml母液加入640mg peg 20000，60℃加热使其溶解后，摇晃混匀，然后冷水浴静置2～3h，离心(4000rpm，5min)，下层沉淀用160ml无水乙醇和无水甲醇各洗涤2次，真空干燥(80℃，2h)，即得微米级γ-cd-mof(μm-cd-mof)。
187.以cd-mof为模板，草酰氯为交联剂合成活性氧敏感的共价环糊精骨架oc-cof。称取合成好的cd-mof 422.4mg于圆底烧瓶中，在5ml二氯甲烷中，338μl三乙胺为催化剂，在25℃下使草酰氯与cd-mof以1:12摩尔比充分反应24h，反应完成后，4000rpm离心5min得到沉淀物，将沉淀物分别用75％乙醇，50％乙醇，水各洗一遍，离心，沉淀-80℃预冻4h，冷冻干燥24h得到过氧草酸酯键连接的共价环糊精骨架(oc-cof)。
188.扫描电镜结果(图1)显示cd-mof为规则的立方体形态，粒径均一(2～3μm)；交联后得到的oc-cof仍保持原有的规则形态和粒径。
189.ft-ir结果(图2)显示在1750cm-1
处出现了草酰键二酮的特征峰，而cd-mof在此无峰出现，证实了以草酰氯为交联剂已成功制备出了交联oc-cof。
190.pxrd结果(图3)显示交联后的oc-cof失去了原有cd-mof的结晶性，为无定型聚合物。
191.热重分析结果(图4)表明cd-mof在0～200℃时失重约10％，失去的主要为游离水分子，因为cd-mof吸湿性较强，而oc-cof在0-200℃时较为稳定，说明oc-cof基本不含水分，当温度高于200℃时，oc-cof和cd-mof开始分解，说明在日常储存和使用过程中，oc-cof的热稳定性较好，是一种较为稳定的药物递送载体。
192.实施例2
193.按摩尔比1:8分别称取γ-cd 14.584g和koh 5.049g，加入450ml的超纯水(18.2mω.cm)，超声溶解，经0.8μm水膜过滤，得到γ-cd-koh母液。以5:3(v/v)量取100ml母液和60ml甲醇于密闭容器中，剧烈振摇，混合均匀，置于60℃水浴中，待溶液澄清后，加热20min。然后每100ml的母液加入80ml含有尺寸调节剂peg 20000的甲醇溶液(8mg/ml)，继续加热1h，冷水浴静置2h，离心(4500rpm，5min)，弃上清液，下层沉淀使用160ml的无水乙醇和无水甲醇各洗涤2次，真空干燥(80℃，2h)，即得纳米级γ-cd-mof(nano-cd-mof)。
194.以cd-mof为模板，草酰氯为交联剂合成活性氧敏感的共价环糊精骨架oc-cof。称取合成好的cd-mof 422.4mg于圆底烧瓶中，在5ml二氯甲烷中，338μl三乙胺为催化剂，在25℃下使草酰氯与cd-mof以1:12摩尔比充分反应24h，反应完成后，4000rpm离心5min得到沉淀物，将沉淀物分别用75％乙醇，50％乙醇，水各洗一遍，离心，沉淀-80℃预冻4h，冷冻干燥24h得到过氧草酸酯键连接的共价环糊精骨架(oc-cof)。
195.纳米级显微结果见图2，nano-cd-mof和nano-oc-cof的粒径约为500nm。具有规则立方体形态的oc-cof粒径可调控以适应不同的递药需求。立方体形态相比于球形，能有效逃避巨嗜细胞的吞噬和清除。
196.实施例3
197.按照实施例1制备cd-mof。以cd-mof为模板，草酰氯为交联剂合成活性氧敏感的共价环糊精骨架oc-cof。称取合成好的cd-mof 422.4mg于圆底烧瓶中，在一定体积的有机溶剂中，催化剂存在的条件下，在25℃下使草酰氯与cd-mof以一定的摩尔比充分反应24h，反应完成后，4000rpm离心5min得到沉淀物，将沉淀物分别用75％乙醇，50％乙醇，水各洗一遍，离心，沉淀-80℃预冻4h，冷冻干燥24h得到过氧草酸酯键连接的共价环糊精骨架(oc-cof)。具体制备参数见表1。
198.表1 oc-cof的制备参数
199.摩尔比(cd-mof:oc)有机溶剂及体积催化剂及用量1:8二氯甲烷5ml三乙胺225μl1:12二氯甲烷5ml三乙胺338μl1:16二氯甲烷5ml三乙胺450μl1:12四氢呋喃5ml三乙胺338μl1:12二氯甲烷5ml吡啶290μl1:12四氢呋喃5ml吡啶290μl
200.实施例4
201.(1)oc-cof(实施例1制备)的生物安全性
202.将处于对数生长期的a549
‑ⅱ
型肺泡上皮细胞、wi26-va4
‑ⅰ
型肺泡上皮细胞，mhs-肺泡巨噬细胞和calu-3支气管上皮细胞等肺部细胞以一定的密度接种于96孔板，每孔体积200μl，培养12h，弃去完全培养液，然后加入180μl不含血清的培养基，再加入20μl用pbs稀释的不同浓度的oc-cof，使得孔板内oc-cof终浓度为1000、400、160、64、25.6、10.24、4.096、1.6384μg/ml。同时设置空白组仅含培养液，对照组加入细胞和培养液。在培养箱中继续培养24h后，每孔加cck-8溶液15μl，37℃继续孵育一定时间。终止培养，酶标仪检测450nm处的吸光度(a)值，计算细胞存活率(各组实验n＝6)。根据细胞种类不同调节种板密度及加入cck8溶液后的孵育时间。
[0203][0204]
结果如图6，表明交联oc-cof对a549、wi26-va4、mhs和calu-3细胞均无明显的细胞增殖抑制效应和细胞毒性，即使在最高浓度1000μg/ml的作用下，细胞仍有95％以上的存活率，证明oc-cof作为肺部给药的药物载体具有良好的生物相容性与生物安全性。
[0205]
(2)生物可降解性评价
[0206]
配制oc-cof 20mg/ml的pbs溶液，在37℃，100rpm的摇床上孵育不同的时间，拍照记录不同时间点溶液的情况，评价oc-cof的体外生理介质中的降解情况。同时取不同时间点的水解样品进行扫描电镜观察。
[0207]
oc-cof在pbs介质中孵育不同的时间的图片(图7)可以看出oc-cof在体外生理介质中会慢慢水解，在pbs中孵育12h时可发现混悬液的颜色有明显变化，24h时已基本澄清，证明了oc-cof是一种生物降解性良好的载体材料。如图8，取不同时间点水解的样品进行sem成像观察，可发现在4h之前，oc-cof均能在水溶液中保持完好的形态，8h时，其立方体的边缘已经不明显，整个结构变得圆滑，出现了明显的水解，12h时，水解的小颗粒聚集成较大颗粒。一种可能的原因是过氧草酸酯键在含水环境中会水解，从而实现了oc-cof的生物可降解。
[0208]
(3)oc-cof的h2o2清除实验
[0209]
oc-cof作用于h2o2水溶液的浓度依赖性：用pbs稀释30％的h2o2溶液至100μm，将其分别配制成浓度为1、2、3、4、5、6、7mg/ml的不同质量的oc-cof溶液，以不加oc-cof的含100μm h2o2的pbs水溶液作为对照组，纯pbs溶液作为空白组，摇床(37℃，100rpm)分别孵育1、2、4、8、12、24h，取样(n＝3)，12000rpm离心，取上清，用过氧化氢试剂盒检测不同浓度的oc-cof于不同时间点作用于h2o2的消耗情况。
[0210]
从图9可知同等浓度的oc-cof在含100μm h2o2的pbs水溶液不同时间降解，孵育2h后，h2o2浓度开始下降；4h后，h2o2浓度明显下降，随着作用时间的延长，h2o2的浓度逐渐降低；24h后h2o2浓度已趋于0，证明oc-cof与h2o2的作用具有时间依赖性，随着作用时间的延长，oc-cof使h2o2的浓度逐渐降低。此外，随着oc-cof浓度的升高，oc-cof消耗h2o2的量也逐步增加，呈现明显的h2o2含量的浓度依赖性。充分验证了oc-cof具有过氧化氢响应性，可以降低溶液中h2o2的浓度。
[0211]
(4)oc-cof在过氧化氢环境中对细胞的保护作用
[0212]
采用h2o2损伤mhs细胞作为氧化应激损伤的细胞模型。mhs细胞是小鼠肺泡巨噬细胞，为半悬浮细胞，具有典型的巨噬细胞特征。将处于对数生长期的mhs细胞以一定的浓度(3
×
105/ml)接种于96孔板中，每孔200μl1640完全培养基，37℃，5％co2条件下培养12h，吸走完全培养基，然后加入160μl1640培养基，再加入20μl用pbs稀释的不同浓度oc-cof，使得孔板内oc-cof的终浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μg/ml，再加入20μl用pbs稀释的h2o2，孔板内h2o2终浓度为100μm，每孔终体积为200μl。将细胞继续放在37℃，5％co2培养箱内培养24h。取出细胞，加入15μl cck8试剂，继续孵育一定时间，在检测波长450nm下测定od值。检测相应浓度h2o2条件下，不同浓度的oc-cof对细胞的保护作用。
[0213]
如图10，100μm的h2o2环境中，阳性对照组(即oc-cof为0μg/ml)细胞的存活率仅有45％，当加入oc-cof浓度为200μg/ml时，其细胞的存活率与正常对照组相当。而最低浓度6.25μg/ml oc-cof时，细胞的存活率显著比阳性对照组高，说明oc-cof能降低细胞环境中h2o2的浓度，保护细胞免受ros的氧化刺激。
[0214]
(5)体外抗氧化作用
[0215]
将处于对数生长期的mhs细胞以3
×
105/ml接种于6孔板中，每孔2ml，孵育12h，吸走原有培养基，加入含有100μm h2o2的1640培养基，同时加入用pbs稀释的不同浓度的oc-cof，使得皿内oc-cof的终浓度为1000、500、250μg/ml，不加oc-cof的作为阳性对照，设置不
加100μm h2o2和oc-cof的作为阴性对照，孵育24h，吸走原有培养基，每孔加入1ml用无酚红1640培养基配制的10mm二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)，37℃，5％co2孵育30min，每10min轻轻摇晃一次，使dcfh-da与细胞充分作用，孵育结束后，吸走培养基，再用无酚红1640培养基轻轻摇晃洗涤细胞6次，充分除去未进入细胞的游离dcfh-da分子，最后一次洗涤1000rpm，5min离心收集下层沉淀，用0.5ml pbs悬浮细胞，30min内用bd calibur流式细胞仪检测细胞内的荧光情况。
[0216]
用流式细胞仪检测mhs细胞内的活性氧荧光强度进行定量分析，如图11当细胞加了100μm h2o2时，与阴性对照组相比，荧光位移明显，当加入oc-cof后，荧光位移减弱，定量分析后可发现，250μg/ml oc-cof即可使细胞内的荧光强度减弱75％，500μg/ml oc-cof可使细胞内的荧光强度减弱88％，1000μg/ml oc-cof可使细胞内的荧光强度减弱92％，说明oc-cof可显著降低细胞内活性氧水平。
[0217]
(6)oc-cof的体外抗凋亡作用
[0218]
将处于对数生长期的mhs细胞以3
×
105/ml接种于6孔板中，每孔2ml，孵育12h，吸走原有培养基，加入含有1800μl 1640培养基，再加入100μl用pbs稀释的h2o2，使得孔内h2o2终浓度为100μm，同时加入100μl用pbs稀释的不同浓度的oc-cof，使得孔内oc-cof的终浓度为1000、500、250μg/ml，不加oc-cof的作为阳性对照，同时设置不加100μm h2o2和oc-cof的作为阴性对照，加入10％dmso的作为凋亡诱导的阳性对照，同时设立经过凋亡诱导后不染色的细胞组，annvexin v单染细胞组，pi单染细胞组，孵育24h，吹打细胞悬液，1000rpm，3min离心收集细胞，用1ml 4℃预冷的pbs洗涤细胞两次，在最后一次洗涤好的细胞沉淀中加入100μl的1
×
binding buffer工作液，加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀，室温避光染色30min，再加入10μl pi，轻轻混匀，室温避光染色10min，每管加入400μl 1
×
binding buffer工作液，混匀后1小时内使用流式细胞仪检测。
[0219]
流式细胞仪分析结果显示，如图12，当细胞在h2o2的环境中时，受活性氧的刺激，细胞的凋亡明显增强，在100μm h2o2环境中24h，肺泡巨噬细胞mhs的凋亡率为33.3％，而正常细胞的凋亡率为4.82％，说明活性氧的刺激会诱导细胞凋亡，当加入oc-cof后，250μg/ml oc-cof使细胞的凋亡率减少6％。1000μg/ml oc-cof使细胞凋亡率减少26％，说明oc-cof消耗了h2o2，使得细胞外的活性氧刺激减弱，细胞凋亡率减少。
[0220]
(7)oc-cof的肺部沉积与降解
[0221]
将荧光分子罗丹明b(rhob)共价连接到oc-cof分子上，得到rhob-oc-cof。将rhob-oc-cof以40mg/kg的剂量给大鼠肺部吸入，分别与给药前0min，给药后5min,15min,30min,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h后解剖取肺组织，然后在小动物活体成像仪上观察肺部的荧光情况，以荧光强弱来评价oc-cof在肺内的沉积与降解情况。
[0222]
如图13所示，给药前0min时，肺内无荧光，给药后5min，肺内的荧光强度最强，表明oc-cof能顺利沉积到肺部，随着给药时间的延长，肺内的荧光强度减弱，表明oc-cof在肺部被逐渐水解代谢，24h，肺内的荧光强度已很微弱，表明oc-cof有良好的生物可降解性。
[0223]
实施例5
[0224]
(1)负载川芎嗪oc-cof干粉吸入剂的制备：称取4g川芎嗪，加入5ml无水乙醇，50℃加热溶解，然后加入1g oc-cof(实施例1制备)，50℃，400rpm搅拌24h，用布氏漏斗抽滤，用适量无水乙醇洗涤，50℃真空干燥12h，即得载川芎嗪的oc-cof粉末，记为lig@oc-cof。用高
效液相色谱，液相条件为水：甲醇＝40％:60％，0.6ml/min，35℃，检测波长为280nm，进样量为10μl。测得lig@oc-cof的载药量为24.68
±
0.65％。
[0225]
(2)负载罗氟司特oc-cof干粉吸入剂的制备：称取150mg罗氟司特，加入5ml无水乙醇，40℃加热溶解，然后加入500mg oc-cof(实施例4制备)，50℃，400rpm搅拌24h，用布氏漏斗抽滤，用适量无水乙醇洗涤，40℃真空干燥12h，即得载罗氟司特的oc-cof粉末，记为rof@oc-cof。用高效液相色谱，液相条件为5mm nah2po4/h2o：acn＝20％:80％，1ml/min，25℃，检测波长为214nm，进样量为10μl。测得rof@oc-cof的载药量为5.66
±
0.05％。
[0226]
(3)负载槲皮素oc-cof干粉吸入剂的制备：称取100mg槲皮素，加入5ml无水乙醇，60℃加热溶解，然后加入500mg oc-cof(实施例4制备)，60℃，400rpm搅拌24h，用布氏漏斗抽滤，用适量无水乙醇洗涤，60℃真空干燥12h，即得载槲皮素的oc-cof粉末，记为que@oc-cof。用高效液相色谱，液相条件为甲醇：0.4％磷酸水溶液＝60％:40％，0.6ml/min，35℃，检测波长为370nm，进样量为20μl。测得que@oc-cof的载药量为8.94.
±
0.07％。
[0227]
(4)负载姜黄素oc-cof干粉吸入剂的制备：称取50mg姜黄素，加入5ml无水乙醇，40℃加热溶解，然后加入382mg oc-cof(实施例4制备)，40℃，400rpm搅拌24h，用布氏漏斗抽滤，用适量无水乙醇洗涤，40℃真空干燥12h，即得载姜黄素的oc-cof粉末，记为cur@oc-cof。用紫外可见分光光度计在428nm下测得cur@oc-cof的载药量为6.57.
±
0.08％。
[0228]
实施例6
[0229]
(1)lig@oc-cof的表征
[0230]
采用场发射电镜能谱一体机对样品lig@oc-cof(实施例5)的表面形态进行扫描电镜观察。如图14，sem结果表明载药后的粉末颗粒仍为2～3μm粒径均一的立方体颗粒，载药过程并没有改变原有oc-cof颗粒的形态和大小，该载药粉末的粒径在1～5μm内，符合干粉吸入剂的粒径要求。
[0231]
使用x射线粉末衍射仪测定lig、oc-cof、lig@oc-cof、lig和oc-cof的物理混合物的pxrd图谱。由图15可知，川芎嗪在10.01
°
、16.56
°
、17.22
°
、20.20
°
、21.15
°
、22.35
°
、24.80
°
、27.40
°
、27.88
°
、29.05
°
存在衍射峰，说明药物为结晶态。而oc-cof几乎无衍射峰，说明oc-cof为无定型态。载药后的粉末lig@oc-cof也无衍射峰，而川芎嗪与oc-cof的物理混合物却有与纯药物一样的衍射峰，证明lig@oc-cof并不是简单的物理混合物，经过载药后药物分子可能进入了oc-cof的空腔内。
[0232]
使用差式扫描量热仪对lig、oc-cof、lig@oc-cof、lig和oc-cof的物理混合物进行热分析。如图16，dsc曲线表明川芎嗪在86.30℃和118.93℃有特征的吸热峰，说明川芎嗪原料药呈一定的晶型存在。oc-cof几乎无吸热峰，进一步表明其无定型态。lig/oc-cof物理混合物中，oc-cof对lig的吸热峰产生影响，使其原先在118.93℃的吸热峰稍右移。而载药后的粉末lig@oc-cof几乎无吸热峰，进一步证实了lig与oc-cof有相互作用，lig可能被包载进oc-cof空腔中，并非简单的物理混合。
[0233]
使用热重分析仪对lig、oc-cof、lig@oc-cof、lig和oc-cof的物理混合物进行热重分析。如图17，川芎嗪原料药在100～150℃范围内失重约为100％，是因为川芎嗪熔点低，为77～80℃，且易升华，故其在高温条件下不稳定。而oc-cof在0～200℃均较稳定，高于200℃时开始慢慢分解。载药后粉末lig@oc-cof在100～150℃范围内失重约25％，为川芎嗪受热后的损失，高于150℃的失重为oc-cof的分解，而物理混合物lig/oc-cof的失重曲线基本与
川芎嗪的原料药一致，进一步证实了载药后的粉末与单纯的物理混合物不一样。oc-cof与川芎嗪之间有相互作用。
[0234]
如图18，原料药川芎嗪红外图谱中，3000～2850cm-1
范围内强吸收是甲基与亚甲基c-h伸缩振动吸收，2850～2700cm-1
范围内中等强度的吸收是与哌嗪环上氮原子相连亚甲基(n-ch2)的吸收谱带，1500左右cm-1
范围内的是c＝n吸收谱带。oc-cof的红外谱图中3650～3200cm-1
范围内的吸收为羟基o-h的伸缩振动；1750处为c＝o的特征吸收峰。载药后的粉末lig@oc-cof的红外谱图中川芎嗪的特征吸收峰基本消失或减弱了，而物理混合物lig/oc-cof的红外谱图中，川芎嗪的特征吸收峰依然存在，证明载药后药物分子与载体材料之间有相互作用，药物是被载进oc-cof的空腔内部了，与简单的物理混合物不一样。
[0235]
(2)lig@oc-cof空气动力学评价
[0236]
参照2020版《中国药典》有关排空率测定方法测定。取3号hpmc空胶囊壳，精密称定其质量记为w1，然后每粒胶囊装填lig@oc-cof 10mg，分别精密称定装填粉末后的胶囊质量，记为w2，逐粒置于吸入装置进行ngi实验，流速设置为65l/min，测定排空后胶囊和残留药物的总质量，记为w3，计算排空率。公式如下：
[0237][0238]
处方设计中，lig@oc-cof干粉吸入剂的规格为10mg/粒。排空率测定结果表明，lig@oc-cof的排空率为97.73
±
0.66％，符合2015版《中国药典》规定的干粉吸入剂排空率要求(大于90％)。
[0239]
精密称取10mg lig@oc-cof填充于3号hpmc胶囊中，每组10粒胶囊，共3组。实验开始前，先在预分离器中加入15ml甲醇-水(50:50，v/v)，按照要求连接好ngi各部位，将ngi与流量系统相连，调节流量控制阀使通过系统的稳定流量达到q
out
(本实验为64.8ml/min)，在该流量下，控制阀前后的压力比(p3/p2)应小于0.5，确保该条件下的仪器用于评价吸入粉雾剂的空气动力学，关闭真空泵，移除流量系统，连接吸入装置与ngi，打开真空泵，同时在tpk 2000-r上面设置抽气时间3.7s。取一粒装填好样品的胶囊置于吸入装置中，用手指按压装置两侧的按钮，将胶囊刺破，吸入装置通过适配器与ngi的人工喉末端水平连接，按下开始按钮开始吸入试验，10s后取下吸入装置，重复测定10粒胶囊，关闭真空泵。测试结束后，用50％甲醇水溶液依次清洗吸入装置、适配器、人工喉、预分离器及8个收集盘，分别将洗液转移至容量瓶中，加入适量1m naoh溶液使载体oc-cof水解，充分释放药物，再加入等体积的1m hcl，最后定容。取样12000rpm离心，取上清按照“色谱条件”项下测定条件，进样分析，记录峰面积；另取川芎嗪对照品储备液，配制标曲，同法测定。绘制肺部给药体外沉积分布图(图19)，说明lig@oc-cof具有优良的体外肺部沉积效果，并计算微细粒子分数。lig@oc-cof的微细粒子百分数为71.02
±
1.80％，符合干粉吸入剂用于治疗肺部疾病的肺部沉积率的要求。
[0240]
(3)lig@oc-cof的体外抗炎作用
[0241]
将处于对数生长期的mhs细胞，用完全培养基以一定的细胞密度接种在96孔板中，孵育12h，使细胞充分贴壁。然后吸弃上清液，加入160μl 1640培养基，再加入20μl一定浓度用pbs配制稀释的lps溶液，同时加入20μl用pbs配制的不同浓度的lig、oc-cof和lig@oc-cof溶液。设置加lps和培养基的组作为阳性对照组，只加培养基的组作为阴性对照组，所有
组别孔内总体积均为200μl。37℃，5％co2孵育12h，取细胞培养上清液100μl，按照elisa试剂盒的说明操作，最后使用酶标仪检测450nm处的吸光度值，计算各组促炎因子的释放量(各组实验n＝3)。
[0242]
如图20可知，lps刺激能明显使肺泡巨嗜细胞的促炎因子tnf-α、il-6、il-1β的释放增加，而当给予药物lig后，会减少炎症因子的释放，单独的载体oc-cof也能明显减少炎症因子的释放，载药后的粉末作用效果最好，其体外抗炎效果最明显。
[0243]
从图20的lig@oc-cof组(410μg/ml)的tnf-α、il-1β的值显著低于单独使用lig(200μg/ml)和oc-cof(620μg/ml)，这提示lig@oc-cof组中lig和oc-cof产生了协同治疗效果，本发明的oc-cof具有很好的提高药物疗效的作用。
[0244]
(4)lig@oc-cof在肺部细胞模型的吸收评价
[0245]
吸入的药物微粒避免被纤毛清除且防止被巨噬细胞吞噬后，经过肺泡进入肺间质后，可通过上皮细胞进入间质，随后药物转运进入血液循环。支气管上皮细胞calu-3常用于评价药物肺部吸收的特性。本部分首先采用cck8法筛选出转运实验安全的给药浓度范围，然后建立并验证肺部细胞转运模型，最后通过hplc法测定不同时间点lig和lig@oc-cof在calu-3细胞模型的浓度，计算跨膜转运量和表观渗透系数，阐明药物的吸收机制，考察载体oc-cof对lig转运吸收的影响。
[0246]
根据细胞cck-8的实验结果，设置转运实验中lig的低高浓度分别为50、200μg/ml。得到致密的单层细胞膜后，弃去上层及下层室的培养基，以37℃预热的hbss清洗细胞表面，然后在符合转运条件的细胞模型的ap侧加入0.5ml样品溶液，bl侧加入1.5ml的hbss，继续孵育，分别在30、60、90、120min于bl侧吸取200μl溶液，并同时补加相同体积的hbss，hplc法测定不同时间点接收池中lig的含量，每个浓度重复3个孔。计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient,papp)，以取样时间为横坐标，对应时间测定的papp值为纵坐标，绘制曲线。
[0247][0248]
v:接收池的体积(ml)；area:细胞单层膜的面积(cm2)；time:总的转运时间(s)；[drug]acceaptor:接收池中的药物浓度；[drug]initial donor:加入的药物浓度。
[0249]
表观渗透系数(papp)是衡量药物跨膜吸收能力的一个参数，papp值越大，说明药物越容易被机体吸收。如图21，以lig等量浓度计算，高浓度(200μg/ml)和低浓度(50μg/ml)的lig和lig@oc-cof在单层肺泡上皮细胞模型和单层支气管上皮细胞模型上的p app值均大于1
×
10-6
cm/s，说明川芎嗪在肺部吸收为完全吸收，oc-cof不影响川芎嗪被肺部细胞所完全吸收。
[0250]
(5)lig@oc-cof在大鼠copd模型上的药效评价
[0251]
copd大鼠模型的建立：依据“劳则气耗”(《素问
·
举痛论》)，每天将大鼠放入恒温水槽(43
±
1)℃中强迫游泳30min，使其劳累而耗伤肺气；然后置于1m3熏烟箱内，每天香烟熏1h，每次20支去过滤嘴红梅牌香烟。最后将大鼠置于常压低氧装置内(每天5h)，通入氮气，用自动测氧仪调控氧浓度至(10.0
±
0.5)％，co2传感器控制舱内co2始终维持在0.03％。温度传感器及其控制电路可维持舱内温度始终恒定在22℃-24℃。蒸气由变色硅胶吸收(烘干后可反复使用)，装置有一小孔与外界相通，确保舱内的常压状态，舱体由透明有机玻璃
制造，可观察大鼠活动、进食、饮水等情况。造模每周进行6天，第7天暂停，连续4周。
[0252]
copd动物分组及给药：将造模成功的copd大鼠分为模型组，川芎嗪灌胃给药组，oc-cof空白载体dpi组，lig@oc-cof dpi组。按照川芎嗪剂量8.4mg/kg进行给药，根据lig@oc-cof中川芎嗪的载药量为24.68％，故lig@oc-cof dpi给药组剂量为34.04mg/kg。oc-cof空白载体dpi组的剂量与lig@oc-cof dpi给药组中oc-cof的剂量一致，故oc-cof空白载体给药剂量为25.64mg/kg。川穹嗪灌胃组的剂量为42mg/kg，为dpi给药剂量的5倍。造模结束后，dpi组每天气道给药，川芎嗪对照组灌胃给药，copd模型组和健康组每天灌胃给生理盐水，连续给药1周。
[0253]
肺功能检测和肺组织形态学观察：一周给药结束后，以3％的戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，切开颈部气管，与气管正中插入连接有三通开关的气管插管，将大鼠放置于肺功能测定仪配备的密闭体积描计器内，测定并记录大鼠第0.3秒用力呼气量(fev0.3)、用力肺活量(fvc)、(fev0.3/fvc)％等肺功能指标。取各组大鼠左上肺组织，福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。切片5μm、he染色，光镜下观察各组大鼠肺组织形态学变化。如图22，与正常组大鼠相比，模型组大鼠的fev0.3、fvc和fev0.3/fvc的肺功能参数值显著下降，证明copd模型建立成功。与模型组相比，lig@oc-cof dpi组的肺功能参数值有所改善(p《0.001)，川芎嗪灌胃组的肺功能参数也有所改善，但oc-cof dpi组无明显改善作用。如图23，正常组大鼠的肺泡结构正常，无明显代偿性肺气肿形成，肺动脉血管管壁无明显增厚。模型组大鼠的肺血管显著扩张，管壁增厚，周围可见大量淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润；肺泡间隔增宽，肺间质有少量炎细胞浸润；大量肺泡扩张，甚至肺泡壁断裂融合，代偿性肺气肿形成。lig@oc-cof dpi组较模型组相比，肺血管平滑肌细胞增生和肺泡扩张显著改善，少量炎细胞浸润，肺气肿不明显。
[0254]
elisa检测il-8、tnf-α、mda、sod含量测定，western blot检测nf-kb、nrf2的表达：每组大鼠腹主动脉采血后，应用elisa检测大鼠血清中il-8、tnf-α、mda和sod的含量。严格按照各试剂盒的说明书进行操作。取各组大鼠肺组织，提取肺组织蛋白，bca法蛋白定量。经上样、电泳、转膜、封闭后，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，洗膜后，加入化学发光试剂，x线胶片曝光显影记录影像，结果用凝胶成像分析系统分析，分别计算nf-kb、nrf2的相对表达量。
[0255]
如图24，与正常组比较，模型组大鼠血清tnf-α、il-8含量显著升高；与模型组比较，lig@oc-cof dpi组il-8、tnf-α水平显著降低(p《0.001)，川芎嗪灌胃组与oc-cof组也有明显降低，但lig@oc-cof组降低最明显。与正常组相比，模型组大鼠sod含量显著下降、mda含量显著升高；与模型组相比，各治疗组的sod含量显著上升，mda含量显著下降，但lig@oc-cof组的治疗效果最好。虽然il-8与mda水平lig组与lig@oc-cof组没有显著性差异，但lig@oc-cof通过干粉吸入的方式给药，oc-cof的协同作用，将lig的药物剂量降低了5倍。western blot检测蛋白表达水平，如图25，与正常组相比，模型组nf-kb表达升高，sod和nrf2表达降低，与模型组比较，各治疗组的nf-kb表达降低、sod和nrf2表达升高，但lig@oc-cof的作用效果最显著。综上，lig@oc-cof dpi用于治疗copd大鼠能显著降低大鼠的炎症因子水平，增强抗氧化能力，这与nf-κb/nrf2信号通路有关。
[0256]
(6)lig@oc-cof在大鼠急性肺损伤模型上的药效评价
[0257]
大鼠急性肺损伤模型的建立：将大鼠采用异氟烷浅麻，呈仰卧位固定于操作板上，
操作台与桌面呈45
°
夹角，利用喉镜照射大鼠喉部，用镊子将大鼠的舌头从嘴角处向外拉出口腔，采用大鼠喉镜打开大鼠的口腔，趁声门打开瞬间迅速将装有溶液的微型喷雾器给药装置插入气管内，立即推动注射器将脂多糖溶液递送至大鼠肺部，脂多糖溶液给药剂量为8mg/kg，随后取出微型喷雾器，将动物置于垂直位置并轻轻旋转30秒以使喷雾均匀分布在整个肺中，诱发大鼠急性肺损伤。正常对照组同法喷入等量的生理盐水溶液。
[0258]
动物分组及给药：将造模成功的急性肺损伤大鼠分为模型组、川芎嗪灌胃组，地塞米松(dex)灌胃组，lig@oc-cof dpi组，oc-cof dpi组。按照川芎嗪剂量8.4mg/kg进行给药，根据lig@oc-cof中川芎嗪的载药量为24.68％，故lig@oc-cof dpi给药组剂量为34.04mg/kg，oc-cof空白载体dpi组的剂量与lig@oc-cof dpi给药组中oc-cof的剂量一致，故oc-cof空白载体给药剂量为25.64mg/kg。川芎嗪灌胃组的剂量为42mg/kg，为dpi给药组的5倍。地塞米松作为临床上常用于治疗急性肺损伤的药物，作为阳性对照组，给药剂量为3mg/kg。诱发大鼠急性肺损伤模型2h后，进行给药。dpi组气道给药，川芎嗪对照组灌胃给药，急性肺损伤模型组和对照组同法打入空气至肺部，给药1次。6h后，大鼠腹主动脉取血后处死大鼠，然后经皮逐层剥开胸腔并小心剥离肺脏。血液样品4000rpm离心10min，吸取上清，将血清储存在-20℃冰箱，用于elisa实验中炎性因子的测定；肺组织样品用于he染色实验，western blot检测蛋白表达水平。
[0259]
大鼠肺切片he染色：如图26，正常大鼠肺组织结构未见明显异常，急性肺损伤模型组大鼠肺组织可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁明显增厚，弥漫性肺间质及肺泡水肿，甚至充血、实变。lig@oc-cof dpi组肺组织病理显示，肺泡及肺间质的炎性细胞浸润、充血、水肿得到了明显的改善。而川芎嗪灌胃组和oc-cof dpi组肺间质充血明显改善，肺泡壁少许增厚，炎性细胞浸润少许改善。
[0260]
大鼠血清中炎症因子测定：通过elisa试剂盒检测血清中的炎性因子，结果如图27，与正常对照组相比，经lps诱导，模型组的炎性因子水平il-6、il-1β、il-8、tnf-α明显升高，表明诱发了促炎细胞因子的释放，大鼠急性肺损伤模型建立成功。与模型组相比，给药组的炎性因子水平il-6、il-1β、il-8、tnf-α均明显减低。其中，lig@oc-cof dpi组的药效最好(p均小于0.001)，表明lig@oc-cof肺部吸入给药能有效减少急性肺损伤大鼠的炎症反应，川芎嗪和oc-cof单独给药也能降低炎症因子的水平，两者协同后效果最好。lig载药进oc-cof后，通过干粉吸入给药，将lig的剂量降低了5倍，且与阳性对照组dex相比也有显著性差异。
[0261]
大鼠血清抗氧化指标：如图28，与对照组相比，模型组大鼠血浆中mda的含量显著升高，sod含量显著降低，说明ali能够使氧化-抗氧化平衡失调，从而引起氧化应激损伤。与模型组相比，各给药组的mda含量降低，sod含量升高，lig@oc-cof dpi组的作用效果最显著，说明lig@oc-cof对ali大鼠氧化应激损伤有一定的缓解作用。对胞内抗氧化蛋白sod检测，如图29，模型组sod蛋白表达降低，经lig@oc-cof治疗后，sod蛋白表达升高。
[0262]
lig@oc-cof对大鼠ali信号通路的研究：如图29，与对照组相比，模型组大鼠肺组织中nrf2的表达降低，nf-κb蛋白表达升高。与模型组相比，各给药组的nf-κb蛋白表达均明显降低，nrf2的表达均明显升高，其中，lig@oc-cof的作用最显著。故oc-cof具有一定的抗炎作用和良好的抗氧化作用，川芎嗪也具有良好的抗炎效果，oc-cof与川芎嗪联用后通过干粉吸入方式直接给到肺部，不仅将川芎嗪的剂量降低了5倍，还能发挥良好的协同抗炎和
抗氧化作用，lig@oc-cof降低ali大鼠体内炎症和氧化应激水平可能与调控nf-κb/nrf2信号通路有关。与正常对照组相比，模型组的nf-κb蛋白表达升高，差异有统计学意义。与模型组相比，川芎嗪灌胃组，lig@oc-cof dpi组和地塞米松组的nf-κb蛋白表达均明显降低，oc-cof dpi组的nf-κb蛋白表达也降低了，但无显著性差异。提示，oc-cof具有一定的抗炎作用，川芎嗪具有良好的抗炎效果，oc-cof与川芎嗪联用后能发挥良好的协同抗炎作用，表明lig@oc-cof降低肺组织中炎性细胞因子的浓度与抑制nf-κb的表达有关。
[0263]
实施例7
[0264]
(1)具有活性氧敏感性共价环糊精骨架(bcof)的制备
[0265]
cd-mof的制备：γ-cd:koh反应为摩尔比为1:6，分别称取相应量的γ-cd(6.48g)和koh(2.24g)溶解于200ml纯水中超声至完全溶解，然后用0.8μm水系滤膜抽滤后得母液。取100ml母液加入1.28mg的peg 20000，溶液体系变浑浊，充分震荡，混合均匀，将反应液置于水浴加热(60℃)，待沉淀重新全部溶解，体系澄清后，室温静置，使晶体充分析出沉淀，离心，去上清，沉淀分别用二倍体积的乙醇和甲醇各洗涤2次以除去杂质，得cd-mof。
[0266]
brap的制备：反应底物为4-羟甲基苯硼酸和1,1,1-三羟甲基乙烷，按照1:1摩尔比称取一定量的反应物(4-羟甲基苯硼酸为2.28g)，分散在30ml的无水四氢呋喃中，氮气保护，500rpm，室温搅拌反应24h后，加入600mg的无水硫酸钠，继续搅拌过夜。反应结束后，用0.45μm的有机滤膜过滤，100rpm，50℃旋蒸除去溶剂，氮气吹干，30℃真空干燥2h，得白色粉末brap。
[0267]
bcof的制备：按照cd-mof：brap：dpc摩尔比＝1:6:7的比例，称取一定量的反应底物(cd-mof为361mg)，分散在5ml的无水n,n-二甲基甲酰胺中，加入225μl的三乙胺，在80℃，500rpm的条件下搅拌反应24h。反应结束后，体系静置至室温，加入适量95％乙醇终止反应，搅拌均匀，4000rpm离心5min，去上清，沉淀分别用无水乙醇和纯水各洗涤3次，同时搅拌超声分散。洗涤结束后，将沉淀分散在纯水中，置于-80℃冰箱预冻大于4h，最后通过冷冻干燥(-50℃，10mtorr，12h)得固体粉末bcof。5mg/ml的bcof在纯水介质中室温放置24h后水解率仍低于5％，而在100mm h2o2介质中超声10min即可完全水解，初步说明bcof形成并具有h2o2敏感性。
[0268]
(2)bcof的表征
[0269]
采用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，sem)表征样品外观形态。利用马尔文粘度-粒径分析仪采用动态光散射法表征样品的粒径分布和表面荷电性。结果如图30所示：dls测定得bcof粒径在纳米级别(269.0
±
19.2nm)，表面带负电(-27.3
±
9.92mv)且在水溶液中的分散系数为0.110。在sem下，bcof粒子呈现出粒径均一，约100nm，近立方体型颗粒。
[0270]
采用bruker avance neo 600型核磁共振氢谱仪对brap和bcof的合成进行验证。1h-nmr图谱表明(图31.a,b)，bcof在过氧化氢中的水解产物核磁图谱中既含有brap裂解产物hba的特征峰(δ＝6.8～7.2ppm；δ＝4.5ppm)，也保留了环糊精质子在δ＝5.0ppm特征峰。
[0271]
使用thermo nicolet is 5红外光谱仪测定样品在波数4000-400cm-1
范围内的红外吸收光谱。ftir结果表明(图31.c)，bcof在1750cm-1
处的峰代表-c＝o基团，在1263cm-1
和1029cm-1
处的峰代表酯键中的-c-o-，以及在1680-1580cm-1
处出现brap分子中苯环的特征峰，结合核磁共振氢谱结果，进一步证明已经成功合成了bcof。
[0272]
采用bruker d8 advance型粉末x-射线衍射仪对bcof进行晶型表征。pxrd图谱表明(图31.d)，cd-mof的晶体峰明显，体现了其特定的晶型，而合成所得的bcof呈现无定型态，可能原因是交联过程中除去了配位的k
+
，破坏了cd-mof的结晶度。
[0273]
(3)bcof的过氧化氢敏感性评价和体外稳定性评价
[0274]
采用高效液相色谱法定量分析bcof的在不同浓度h2o2介质中的水解率。精密称取5mg bcof粉末，分散于5ml不同ph(ph＝1.2、6.8和7.4)和不同浓度h2o2(ph＝7.4的0、1和10mm h2o2)的pbs水溶液介质中。在37℃，转速为100rpm的恒温震荡培养箱中孵育，分别于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h取样100μl，同时回补相同体积的相应介质。样品于12000rpm下离心5min，取50μl上清进高效液相色谱测定hba的含量，根据hba的标准曲线计算其累计释放百分率，并以时间t(h)为横坐标，累计释放量为纵坐标，绘制水解百分率曲线，每组平行实验测定3次。结果表明(图32.a)，在24h时bcof在0mm、1mm以及10mm的h2o2介质中，bcof水解率依次分别为0.53％、35.83％和89.45％，再次证明bcof具有良好的浓度依赖性和时间依赖性h2o2敏感裂解能力。此外，图32.b结果表明，在ph＝1.2、6.8和7.4介质中，24h时bcof的水解率均低于5％，表明bcof在3种介质中具有良好的稳定性，可应用于口服递药系统。
[0275]
(4)bcof的细胞毒性评价
[0276]
选择对数生长期的raw264.7细胞进行实验，将处于对数生长期的raw264.7细胞以一定密度接种于96孔板，每孔终体积200μl，培养24h。去掉培养液，加入200μl的bcof的系列浓度样品，浓度设置为400、200、100和50μg/ml，同时设置空白组(仅含培养液)和对照组(细胞和培养液)。在培养箱中继续培养24h后，每孔加cck-8溶液15μl，37℃继续孵育1.5h。终止培养，酶标仪检测450nm处的吸光度(a)值，使用如下公式计算细胞存活率(n＝6)。caco-2细胞毒性评价操作同raw264.7细胞。结果表明(图33.a)：bcof在0～400μg/ml范围内，两种细胞存活率均在90％以上，表明在此范围内bcof具有良好的生物安全性。
[0277][0278]
选择对数生长期的raw264.7细胞进行实验，将处于对数生长期的raw264.7细胞以一定密度接种于96孔板，每孔终体积200μl，培养24h。去掉培养液，加入100μl用dmem稀释的h2o2，孔板内h2o2终浓度为1mm，然后再加入100μl的bcof和hba的序列浓度样品，浓度设置为0.33、0.16、0.08和0μm，同时设置空白组(仅含培养液)和对照组(细胞和培养液)。在培养箱中继续培养24h后，每孔加cck-8溶液15μl，37℃继续孵育1.5h。终止培养，酶标仪检测450nm处的吸光度(a)值，使用公式)计算细胞存活率(n＝6)。
[0279]
结果表明(图33.b)：raw264.7细胞与1mm h2o2共孵育24h，细胞存活率低至79.45％，当加入0.08、0.16和0.33μm的bcof时，细胞存活率可分别提高至91.39％、96.97％和99.66％，均使得raw264.7细胞的存活率得到有效改善(p《0.5)；然而，当加入0.16和0.33μm的hba时，细胞存活率仅可分别提高至82.54％和85.52％，这与阴性对照组(只有h2o2和细胞共孵育组)细胞存活率无显著性差异。这一结果表明，在h2o2环境中，bcof比同等剂量的hba具有更强的细胞保护作用，可显著提高细胞存活率。原因可能是由于bcof可以在h2o2刺激下敏感裂解生成hba，即清除h2o2和产物hba发挥协同作用产生强抗炎抗氧化作用，从而可以显著提高细胞存活率，这为验证bcof体内治疗结肠炎发挥抗炎效果奠定了基础。
[0280]
(5)bcof的生物组织分布和结肠组织靶向性评价
[0281]
建立急性溃疡性结肠炎模型：采用6～8周龄雄性spf级balb/c小鼠，适应性喂养一周，实验前小鼠禁食不禁水12h饲养，而后造模小鼠以3.5％(w/v)dss水溶液替代普通饮用水7天，造模过程中，保证小鼠昼夜节律，饲养室温湿度恒定，定时更换垫料，正常喂食，且每两天更换一次新鲜dss饮用水，以防变质。从第0天开始，每天由同一实验员在同一时间称量并记录小鼠体重并观察小鼠状态和粪便情况，根据小鼠体重、便血和粪便形态对其疾病指数(disease activity index,dai)评分。dai是表征结肠炎疾病程度的重要评价标准。最终评分为各项累计相加，dai评分值越高，表示结肠炎性症状越严重。在dss处理结束后，选择体重和dai降低幅度相同的小鼠作为实验使用的模型鼠。
[0282][0283]
连续7天造模组小鼠自由饮用3.5％dss水溶液，并每天仔细观察记录小鼠的体重、粪便症状和精神状态，结果显示(图34a-c)：造模过程中，健康组小鼠体重在7天内几乎不变，精神状态活跃，粪便指数几乎不变；而模型组小鼠从第4天起体重逐步下降，且在第5天到第7天模型组小鼠体重急剧下降，说明uc疾病在发生发展中后期病情急剧恶化，在第7天模型组体重显著降低至74.93％，毛色稀疏无光泽，精神状态萎靡，出现深红色血便和粘液样稀便，dai评分显著升高至10，肛口有血痂状粪便等现象；解剖健康组和模型组小鼠并测量其结肠，结果显示健康组结肠平均长度为9.36cm，而uc模型组小鼠结肠平均长度仅为5.46cm，长度明显缩短至58.3％，以上指标均表明模型建立成功。
[0284]
bcof的生物组织分布评价：用小动物活体荧光成像系统(ivis)考察bcof在急性溃疡性结肠炎小鼠的体内组织分布：急性溃疡性结肠炎(uc)小鼠模型构建成功后，禁食不禁水12h，称重，uc小鼠灌胃给予适量cy5标记的bcof，于给药2h、6h、12h和24h后，处死小鼠，取出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃、小肠和结肠组织，用小鼠成像系统ivis进行成像分析纳米颗粒在各脏器组织中的富集含量(n＝3)。
[0285]
结果显示(图35)：bcof主要分布在急性溃疡性结肠炎小鼠的胃肠道组织，而在心、肝、脾、肺和肾脏器分布很少，且在24h时bcof在心、肝、脾、肺和肾脏器中几乎没有分布，说明bcof在主要脏器中没有蓄积，这也从侧面证实了bcof对心、肝、脾、肺、肾脏器生物安全性良好，此外在结肠组织中6h时bcof的含量分布达到最高，约占总含量的70.2％。
[0286]
bcof的结肠组织靶向性评价：急性溃疡性结肠炎小鼠模型构建成功后，随机分组(n＝3)，禁食不禁水12h，称重，灌胃给予健康组和uc组适量同等剂量cy5标记的bcof，于给药6h后，处死小鼠，取出结肠组织，用小鼠成像系统ivis进行成像分析粒子在结肠组织中的富集含量，从而评价不同bcof载体对于溃疡性结肠炎治疗的潜能。(参数设置：激发波长/发射波长＝646/660nm；像素：8，f/stop：1)。结果显示(图35)，在6h时，bcof在结肠炎小鼠结肠组织中的分布含量约为健康组小鼠结肠组织的5倍，这表明bcof具有一定的结肠炎症部位
靶向性。
[0287]
bcof的药效学评价：采用小鼠自由饮水3％dss水溶液法造模uc，并在造模同时灌胃给予适当剂量的bcof体，而后主要通过测定小鼠体重下降、疾病指数、结肠形态、结肠病理切片以及炎症因子表达水平等指标对药效进行初步评价。实验分组及给药情况：空白对照组：健康组小鼠灌胃给予生理盐水；模型组：uc模型组小鼠灌胃给予生理盐水；bcof组：uc模型组小鼠灌胃给予载体bcof，剂量为150mg/kg。给药方案：模型组小鼠从第0天开始自由饮用3％dss水溶液，空白对照组小鼠自由饮用蒸馏水。所有小鼠从第0天开始分别按实验分组给药，每天一次，连续7天。从第0天开始，每天记录小鼠的体重和饮水情况，对粪便进行观察，记录粪便形态及便血情况，并对其疾病指数dai评分。结肠长度：处死小鼠后，剪取盲肠-结肠交汇处至肛门部分，取出小鼠结肠，至于洁净白纸板上，观察其形态并用量尺测定长度。结肠组织病理学分析：取距小鼠肛门1cm处结肠组织长度约0.5cm，4℃冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，用4％多聚甲醛组织固定液进行固定，用于后续的he染色，制得病理切片，置于显微镜下观察。剩下结肠段放入-80℃冰箱中以备进行mpo和tnf-a等炎症指标检测。
[0288]
结果表明(图36)：相较于健康组小鼠，uc模型组小鼠在第7天时平均体重显著下降至79.01％(p《0.001)，平均dai评分显著升高至9.17(p《0.001)，平均结肠长度明显缩短至5.46cm(p《0.001)；而相较于uc模型组小鼠，连续灌胃给药bcof粒子7天后，小鼠的uc病情有所改善，在第7天时bcof组小鼠平均体重下降至86.70％(p《0.05)，平均dai评分升高至5.60(p《0.05)，平均结肠长度为6.30cm(p《0.05)。由结肠组织he切片结果表明(图37)：健康组小鼠结肠表现出正常的结肠粘膜结构，存在大量杯状细胞，没有炎性细胞浸润情况；uc模型组小鼠结肠显示出大量炎性细胞浸润且杯状细胞减少的病理现象；而相较于uc模型组小鼠结肠，bcof组小鼠结肠显示出炎性细胞轻度浸润，杯状细胞有所增加，bcof可使uc小鼠结肠组织病变区域约有效减少7.5％，这表明其结肠炎症情况有所改善，与体重、dai评分和结肠长度指标变化情况相呼应。此外，从小鼠的各脏器组织he切片结果来看(图38)，相较于健康组小鼠，bcof组小鼠的各脏器未表现出明显的炎症和坏死等病理情况，这表明bcof具有良好的生物安全性。
[0289]
实施例8
[0290]
按照实施例7制备cd-mof和brap。
[0291]
按照cd-mof：brap：dpc一定的摩尔比，称取一定量的反应底物(cd-mof为361mg)，分散在5ml的无水n,n-二甲基甲酰胺中，加入225μl催化剂，在一定反应温度，500rpm的条件下搅拌进行一定反应时间(表2)。反应结束后，体系静置至室温，加入适量95％乙醇终止反应，搅拌均匀，4000rpm离心5min，去上清，沉淀分别用无水乙醇和纯水各洗涤3次，同时搅拌超声分散。洗涤结束后，将沉淀分散在纯水中，置于-80℃冰箱预冻大于4h，最后通过冷冻干燥(-50℃，10mtorr，12h)得固体粉末bcof。5mg/ml的bcof在纯水介质中室温放置24h后水解率仍低于5％，而在100mm h2o2介质中超声10min即可完全水解，初步说明bcof形成并具有h2o2敏感性。
[0292]
表2 bcof的制备参数
[0293]
cd-mof：brap：dpc催化剂反应温度反应时间1:4:7三乙胺60℃24h1:8:7三乙胺60℃24h
1:12:7三乙胺60℃24h1:6:7三乙胺80℃24h1:6:7吡啶60℃24h1:6:7三乙胺60℃12h
[0294]
实施例9
[0295]
(1)bcof负载小檗碱组合物的制备
[0296]
称取0.02g的小檗碱(ber)，用纯水溶解并定容至6ml，配制得ber饱和溶液。称取200mg的bcof分散在6ml的饱和ber溶液中，在37℃，500rpm的条件下恒温搅拌6h。终止搅拌后，4000rpm离心5min，去上清，沉淀用10ml纯水洗涤3次，将沉淀分散在纯水中，置于-80℃冰箱预冻大于4h，最后通过冷冻干燥(-50℃，10mtorr，12h)得固体粉末ber@bcof。通过高效液相色谱法测得其载药量为8.03％。
[0297]
(2)载药体系在不同浓度h2o2和不同ph介质中的释药行为
[0298]
以ph＝7.4的pbs缓冲盐溶液作为药物释放介质，精密称取5mg的ber@bcof，分散于5ml不同ph(ph＝1.2、6.8和7.4)和不同浓度h2o2(ph＝7.4的0、1和10mm h2o2)的pbs水溶液介质中，在37℃，转速为100rpm的恒温震荡培养箱中进行实验，分别于15min、0.5h、1h、2h、4h和8h取样100μl，同时回补相同体积的相应介质。样品于12000rpm下离心5min，取80μl上清进高效液相色谱测定ber的含量，根据ber的标准曲线计算其累计释放百分率，并以时间t(h)为横坐标，累计释放量为纵坐标，绘制药物释放曲线，每组平行实验测定3次。
[0299]
结果表明(图39.a)：随着h2o2浓度的升高以及时间的延长，ber@bcof的释药率也逐渐增高，在8h时ber@bcof在0mm、1mm以及10mm的h2o2介质中，ber释放量依次分别为24.98％、62.26％和74.70％，证明ber@bcof具有良好的浓度依赖性和时间依赖性h2o2敏感释药能力，这为炎症部位高浓度h2o2环境响应性释药奠定了基础。此外，图40.b结果表明：在8h时ber@bcof在ph 1.2和ph 6.8的介质中，ber释放量分别为42.50％和17.95％，由于ber在酸性介质中的溶解度高于中性介质，这使得ber@bcof载药体系中的ber更容易脱离与载体的相互作用而游离到ph 1.2的酸性介质中；尽管如此，ber@bcof在ph 1.2介质中的释放量仍远小于在1mm h2o2和10mm h2o2介质中的释药量，表明ber@bcof可以应用于口服递药系统，且在高浓度h2o2炎性环境中敏感释药。
[0300]
实施例10
[0301]
(1)bcof负载泼尼松龙组合物的制备
[0302]
称取1.5g的泼尼松龙(pd)，用纯水溶解并定容至50ml，配制得pd饱和溶液。称取700mg的bcof分散在25ml的饱和pd溶液中，在37℃，500rpm的条件下恒温搅拌12h。终止搅拌后，4000rpm离心5min，去上清，沉淀用10ml纯水洗涤3次，将沉淀分散在纯水中，置于-80℃冰箱预冻大于4h，最后通过冷冻干燥(-50℃，10mtorr，12h)得固体粉末pd@bcof。通过高效液相色谱法测得其载药量为12.93％。
[0303]
(2)pd@bcof的药效学评价
[0304]
采用小鼠自由饮水3.5％dss水溶液法造模uc，并在造模第4天灌胃给予pd@bcof，而后主要通过测定小鼠体重下降、疾病指数和结肠长度指标对药效进行初步评价。实验分组及给药情况：normal组：健康组小鼠灌胃给予生理盐水；uc组：uc模型组小鼠灌胃给予生理盐水；pd组：uc模型组小鼠灌胃给予游离药物，pd剂量为1mg/kg；pd@bcof组：uc模型组小
鼠灌胃给予pd@bcof(pd@bcof粉体以生理盐水为介质分散成0.2ml的混悬液)，pd剂量为1mg/kg。给药方案：模型组小鼠从第0天至第6天自由饮用3.5％dss水溶液，空白对照组小鼠自由饮用蒸馏水。所有小鼠从第4天开始分别按实验分组给药，每天灌胃给予一次。从第0天开始，连续7天记录小鼠的体重和饮水情况，对粪便进行观察，记录粪便形态及便血情况，并对其疾病指数dai评分。结肠长度：第7天处死小鼠后，剪取盲肠-结肠交汇处至肛门部分，取出小鼠结肠，至于洁净白纸板上，观察形态并用量尺测定长度。
[0305]
从体重变化百分率和dai评分指标来初步评价pd@bcof的对结肠炎的治疗效果，结果表明(图40)：相较于健康组小鼠，uc模型组小鼠在第7天时平均体重显著下降至79.06％，平均dai评分显著升高至9.33，表明模型组小鼠均出现明显的结肠炎症状；而相较于uc模型组小鼠，当从第4天开始灌胃给药pd和pd@bcof粒子后，在第7天时pd组小鼠平均体重下降至83.90％，平均dai评分升高至6.80，这与uc组小鼠均无显著性差异，表明1mg/kg的游离pd没有对结肠炎症状起到治疗效果。然而，pd@bcof组小鼠在第7天的平均体重仅下降至88.49％(p《0.05)，平均dai评分仅升高至5.50(p《0.01)，与uc模型组小鼠相比表现出明显疗效。以上结果表明，当pd给药剂量仅为1mg/kg时，相较于游离pd，pd@bcof对uc则表现出2倍的治疗效果，因为bcof载体具有良好的结肠炎症部位靶向性，可以将pd富集在结肠发炎部位，从而使低剂量的pd表现出对uc良好的疗效，即bcof载体可以降低pd的给药剂量和毒副作用，实现增效减毒的效果。
[0306]
实施例11
[0307]
bcof负载白藜芦醇组合物的制备：称取6.5g的白藜芦醇(res)，用无水乙醇溶解并定容至100ml，配制得res饱和溶液。称取300mg的bcof分散在8ml的饱和pd溶液中，在37℃，500rpm的条件下恒温搅拌12h。终止搅拌后，4000rpm离心5min，去上清，沉淀用10ml纯水洗涤3次，将沉淀分散在纯水中，置于-80℃冰箱预冻大于4h，最后通过冷冻干燥(-50℃，10mtorr，12h)得固体粉末res@bcof。通过高效液相色谱法测得其载药量为10.30％。
[0308]
讨论
[0309]
本发明实施例利用环糊精金属有机骨架(cd-mof)作为模板，用草酰氯与cd-mof中的羟基反应，合成由过氧草酸酯基连接的共价环糊精骨架(oc-cof)。用brap与cd-mof中的羟基反应得bcof。通过控制cd-mof的粒径，可以合成不同粒径大小的oc-cof和bcof，以满足多种递药需求。
[0310]
鉴于炎症部位持续释放(高浓度、高水平的)ros，本发明设计过氧化氢敏感的共价环糊精骨架材料作为药物载体，不仅通过与过氧化氢反应显著消耗病灶部位的ros浓度，还能将药物高效靶向递送到炎症部位，与药物发挥协同抗炎和抗氧化作用。oc-cof中的过氧草酸酯键和bcof中的苯-硼键能与ros反应，oc-cof/bcof到达炎症部位后能降低ros水平，进而发挥抗炎作用，缓解炎症性疾病的进展，与药物协同发挥治疗效果。也就是说，通过本发明的cof作为药物载体，可以减少药物用量，提高治疗效果，降低药物副作用。
[0311]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种过氧化氢敏感的共价环糊精骨架(cof)，其特征在于，所述共价环糊精骨架为具有一个或多个下述特征的环糊精-金属有机骨架(cd-mof)：具有共价连接的过氧草酸酯基(-o-c(＝o)-c(＝o)-o-)；和/或通过苯硼酸酯类交联剂共价修饰。2.如权利要求1所述的共价环糊精骨架，其特征在于，所述苯硼酸酯类交联剂为3.如权利要求1所述的共价环糊精骨架，其特征在于，所述过氧草酸酯基为通过草酰类交联剂与环糊精-金属有机骨架反应产生的。4.如权利要求3所述的共价环糊精骨架，其特征在于，所述草酰类交联剂为草酰氯5.一种如权利要求1所述的共价环糊精骨架在制备药物组合物中的用途。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述共价环糊精骨架在所述药物组合物中作为药物载体和/或ros清除剂和/或抗炎活性成分。7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：(a)如权利要求1所述的共价环糊精骨架；和(b)负载在所述的共价环糊精骨架上的第一活性成分。8.一种权利要求7所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供所述第一活性成分的溶液；(ii)加入所述共价环糊精骨架并分散，搅拌孵育，过滤并干燥，从而将所述第一活性成分负载在共价环糊精骨架上。9.一种如权利要求1所述的过氧化氢敏感的共价环糊精骨架的制备方法，包括步骤：(1)提供cd-mof；和(2)在惰性溶剂中，碱性催化剂存在下，使草酰类交联剂与cd-mof反应，从而得到具有过氧草酸酯基的共价环糊精骨架。10.一种如权利要求1所述的活性氧敏感的共价环糊精骨架的制备方法，包括步骤：(1)提供cd-mof；和(2)在有机溶剂中，催化剂和连接剂存在下，使苯硼酸酯类交联剂与cd-mof反应，从而得到苯硼酸酯基交联剂修饰的共价环糊精骨架。

技术总结
本发明涉及过氧化氢(H2O2)敏感的共价环糊精骨架及其制备方法和应用。具体地，所述共价环糊精骨架为具有共价连接的过氧草酸酯基和/或通过苯硼酸酯类交联剂共价修饰的环糊精-金属有机骨架。本发明的共价环糊精骨架具有过氧化氢敏感性，能够降低过氧化氢的水平，在体内外均表现出良好的抗氧化、抗炎能力，还可与药物分子发挥协同治疗作用。本发明的共价环糊精骨架还具有适宜的生物可降解性、良好的生物安全性，还具有巨大的比表面积可用于负载药物，是一种性能优异的药物载体。是一种性能优异的药物载体。


技术研发人员：张继稳 何思钰 黄晨夕 伍丽 任小红 王彩芬 郭涛 郭玉华 李洁 张莹
受保护的技术使用者：中国科学院上海药物研究所
技术研发日：2022.01.14
技术公布日：2023/7/26