一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉及其制备方法

一种富含
β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及食药用菌发酵与代谢技术领域，尤其是涉及一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉及其制备方法。


背景技术：

2.食用菌多糖具有抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫调节和抗肿瘤等功效，被称为生物效应调节剂。食用菌多糖是10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，主要是β-(1
→
3)-d、α-(1
→
3)-d葡聚糖、酸性杂多糖和中性杂多糖等，其中β-葡聚糖是其发挥生物活性的主要原因，已成为医学和保健食品学科的研究热点。
3.猴头菇(hericium erinaceus)属担子菌纲、猴头菌属，是我国著名的传统药食兼用菌。猴头菇富含多糖、萜类、酮类、甾醇、多肽等多种活性代谢产物，味甘性平，有“利五脏、助消化”之功能，具有抗炎、改善胃黏膜损伤的作用，常用作养胃食品。在众多活性代谢产物中，β-葡聚糖是其养胃的主要功效因子，具有较好的修复和防御作用，在胃黏膜修复方面的功效尤为突出。然而β-葡聚糖在猴头菇中的含量有限，提取率低，极大限制了其在医药、功能食品、化妆品等行业中的规模化研发与应用。现有专利cn201811306372.1中涉及的技术主要利用生物发酵提升了猴头菇多糖提取率，但未提及针对β-葡聚糖含量提出相关技术，产率亦较低。针对上述现有技术的不足，提出一种基于益生菌发酵与酶解处理的方法来制备富含β-葡聚糖的猴头菇发酵菌粉是非常必要的。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，本发明制备的猴头菇菌粉中β-葡聚糖含量高。
5.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，包括如下步骤：
6.a)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；
7.b)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；
8.c)将发酵液酶解处理，得到酶解液；
9.d)将酶解液离心，冷冻干燥，即得。
10.优选的，步骤a)所述猴头菇粉末的制备方法具体为：猴头菇子实体粉碎后，过筛，得到猴头菇粉末；所述过筛为过40～200目筛。
11.优选的，步骤a)所述葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末的质量比为10:5:5:(20～100)。
12.优选的，步骤b)所述益生菌为乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌或芽孢杆菌；
13.所述益生菌浓度为1*107cfu/ml以上；
14.所述接种量为1wt％～5wt％。
15.优选的，步骤b)所述益生菌为植物乳杆菌picp-2、唾液乳杆菌ap-32、植物乳杆菌lpl28、鼠李糖乳杆菌f-1中的一种或几种；优选的，所述益生菌为植物乳杆菌lpl28。
16.优选的，步骤b)所述发酵培养具体为：
17.在转速为170r/min,温度为37℃条件下避光发酵培养，发酵周期为24h～72h；
18.所述发酵料液比为1：(10～50)。
19.优选的，步骤c)所述酶解的酶为溶菌酶、果胶酶、纤维素酶中的一种或其组合；
20.所述酶解中的酶的添加量为2g/l-6g/l。
21.优选的，步骤c)所述酶解的温度40～60℃；时间为1～5h；转速为170r/min。
22.优选的，步骤d)所述离心具体为：8000r/min，离心10min；
23.所述冷冻干燥具体为：真空度2pa，冷阱温度-76℃，冷冻干燥48h～96h。
24.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
25.与现有技术相比，本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，包括如下步骤：a)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；b)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；c)将发酵液酶解处理，得到酶解液；d)将酶解液离心，冷冻干燥，即得。本发明通过上述发酵和酶解结合的方法，使得更加精准化的提升β-葡聚糖含量，通过生物转化制备一种富含β-葡聚糖的猴头菇发酵菌粉，直接用做功能食品、保健食品、药品原料。
附图说明
26.图1不同益生菌种类对猴头菇葡聚糖含量的影响；
27.图2不同接菌量对猴头菇葡聚糖含量的影响；
28.图3不同发酵料液比对猴头菇葡聚糖含量的影响；
29.图4不同发酵时间对猴头菇葡聚糖含量的影响；
30.图5不同酶种类对猴头菇葡聚糖含量的影响；
31.图6不同复合酶配比对猴头菇葡聚糖含量的影响；
32.图7为不同酶添加量对猴头菇葡聚糖含量的影响；
33.图8不同酶解温度对猴头菇葡聚糖含量的影响；
34.图9不同酶解时间对猴头菇葡聚糖含量的影响；
35.图10为各因素交互作用对猴头菇β-葡聚糖含量的响应面和等高图。
具体实施方式
36.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
37.本发明针对β-葡聚糖在猴头菇中的含量低的问题，提出一种基于益生菌发酵与酶解处理制备富含β-葡聚糖的猴头菇发酵菌粉的方法。
38.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，包括如下步骤：
39.a)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；
40.b)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；
41.c)将发酵液酶解处理，得到酶解液；
42.d)将酶解液离心，冷冻干燥，即得。
43.本发明提供的富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法首先将葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质。
44.按照本发明，所述猴头菇粉末的制备方法具体为：猴头菇子实体粉碎后，过筛，得到猴头菇粉末；所述过筛为过40～200目筛。
45.在本发明其中一部分优选实施方式中，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末的质量比为10:5:5:(20～100)；
46.在本发明其中一部分优选实施方式中，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末的质量比为10:5:5:(25～95)。
47.本发明对于所述灭菌不进行限定，本领域技术人员熟知的即可，优选为120～125℃灭菌10～20min；更优选为121℃灭菌15min。
48.将益生菌接种于所述培养基质中。本发明所述益生菌为乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌或芽孢杆菌。
49.本发明按照常规方法进行益生菌菌株的活化与扩繁，例如植物乳酸菌采用mrs肉汤培养基，酵母菌采用ypd(酵母浸出粉胨葡萄糖)培养基进行培养，接种量为2％，培养温度、培养时间等条件依据所选的益生菌菌株确定。益生菌培养完成后采用od(光密度)值法进行益生菌菌密度检测。
50.在本发明某些优选实施方式中，所述益生菌为植物乳杆菌picp-2、唾液乳杆菌ap-32、植物乳杆菌lpl28、鼠李糖乳杆菌f-1中的一种或几种；
51.在本发明某些优选实施方式中，所述益生菌为植物乳杆菌lpl28。
52.本发明所述植物乳杆菌picp-2保藏编号为cctcc no：m 20191045。
53.植物乳杆菌lpl28为锦乔生物科技有限公司市售菌株。
54.植物乳杆菌ap-32为锦乔生物科技有限公司市售菌株。
55.鼠李糖乳杆菌f-1为锦乔生物科技有限公司市售菌株。
56.综合考虑，在本发明某些优选实施方式中，所述益生菌为植物乳杆菌lpl28。
57.本发明所述益生菌浓度为1*107cfu/ml以上。
58.按照本发明，所述接种量为1wt％～5wt％；优选为2wt％或4wt％。
59.将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液。
60.具体的，所述发酵培养具体为：在转速为170r/min，温度为37℃条件下避光发酵培养，发酵周期为24h～72h；
61.在本发明某些优选实施方式中，所述发酵培养具体为：在转速为170r/min，温度为37℃条件下避光发酵培养，发酵周期为24h～60h。
62.本发明人发现，发酵时间为36h时β-葡聚糖的含量，略微低于发酵时间为24h时的β-葡聚糖含量，总体上可以说，随着发酵时间的不断增加，β-葡聚糖的含量呈现为先上升后下降的趋势，当发酵时间为48h时，β-葡聚糖的含量最高，为29.23％；当发酵时间为72h时，β-葡聚糖的含量最低，为25.88％。
63.其中，所述发酵料液比为1:(10～50)，可以具体为1:10、1:20、1:30、1:40或1:50；
优选为1:10。
64.本发明发现，发酵料液比为1:10时，β-葡聚糖的含量最高，为27.38％；发酵料液比为1:30时，β-葡聚糖的含量最低，为23.50％。
65.将发酵液酶解处理，得到酶解液。本发明所述酶解的酶为溶菌酶、果胶酶、纤维素酶中的一种或其组合；更优选为溶菌酶。
66.在某些实施方式中，所述酶解的酶为复合酶；所述复合酶为溶菌酶：纤维素酶＝1:1。
67.本发明所述酶解中的酶的添加量为2g/l-6g/l；具体可以为2g/l、3g/l、4g/l、5g/l或6g/l；更优选为3g/l-5g/l。当酶添加量为4g/l时，β-葡聚糖的含量最高，为28.34％。
68.具体的，所述酶解的温度40～60℃；时间为1～5h；转速为170r/min；
69.在本发明某些优选实施方式中，所述酶解的温度40～50℃；时间为1～4h；转速为170r/min；
70.当酶解温度为50℃时，β-葡聚糖的含量最高。当酶解时间为3h时，β-葡聚糖的含量最高，为28.50％。
71.本发明属于整体技术方案，属于功能上彼此互相支持，存在相互作用关系的技术特征。通过益生菌发酵与酶解处理中步骤参数的设置与调整可以协同提高猴头菇发酵菌粉中β-葡聚糖含量，相对于不恰当的制备条件，本发明β-葡聚糖的产率显著提高。
72.将酶解液离心，冷冻干燥，即得猴头菇发酵菌粉。酶解完成后，所得的样品进行离心处理，设置转数为8000r/min，离心10min，弃上清液，然后将样品进行冷冻；将冷冻后的样品放入冷冻干燥机，取出冷干样本进行粉碎过筛后，利用β-葡聚糖检测试剂盒(k-ybgl)测定其β-葡聚糖含量，最终获得富含β-葡聚糖猴头菇发酵菌粉。所述冷冻干燥具体为：真空度2pa，冷阱温度-76℃，冷冻干燥48h～96h；优选的，所述冷冻干燥具体为：真空度2pa，冷阱温度-76℃，冷冻干燥48h～80h。
73.本发明发现，对猴头菇β-葡聚糖含量的影响主次顺序为酶添加量＞酶解温度＞酶解时间。说明a(酶添加量)和c(酶解时间)的交互作用对β-葡聚糖含量的影响最大。
74.本发明猴头菇最佳酶解工艺：酶添加量3.864g/l、酶解温度50.774℃、酶解时间3.001h。
75.本发明猴头菇最佳酶解工艺为：酶添加量4g/l、酶解温度51℃、酶解时间3h。
76.本发明最优选的制备富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的工艺：发酵料液比为1:10，发酵菌株为乳酸菌植物乳杆菌lpl28，接菌量为2％，发酵时间为48h，采用溶菌酶酶解，酶添加量4g/l，酶解温度51℃，酶解时间3h，酶解后进行离心10min，转数为8000r/min。
77.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
78.本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，包括如下步骤：a)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；b)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；c)将发酵液酶解处理，得到酶解液；d)将酶解液离心，冷冻干燥，即得发酵猴头菇菌粉。本发明通过上述发酵和酶解结合的方法，使得更加精准化的提升β-葡聚糖含量，通过生物转化制备一种富含β-葡聚糖的猴头菇发酵菌粉，直接用做功能食品、保健食品、药品原料。
79.本发明利用megazyme试剂盒(k-ybgl)测定食用菌菌粉的β-葡聚糖含量，β-葡聚糖含量为总葡聚糖与α-葡聚糖差值。
80.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉及其制备方法进行详细描述。
81.实施例1不同益生菌种类对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
82.分别以2％的接菌量(接菌前需要对益生菌菌株进行3次活化，其活化与保存如表1所示)，料液比为1:10，发酵时间为24h，设置4种不同的益生菌菌株，菌株编号分别为picp-2、ap-32、lpl28、f-1(如表2所示)，进行发酵试验，冷冻干燥48h后(真空度2pa，冷阱温度-76℃)研磨获得冻干粉。发酵前对不同益生菌菌株进行菌密度的测定和涂板计数。每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组。测定发酵猴头菇冻干粉葡聚糖含量(后续试验测定的均为冻干粉样本)，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的益生菌菌株。
83.表1益生菌菌株的活化与保存
[0084][0085]
表2益生菌菌种
[0086][0087]
如表3所示，表中不同字母表示p《0.05水平呈差异显著性。发酵后各处理间β-葡聚糖具有显著差异，大多益生菌发酵后β-葡聚糖含量高于ck，其中lpl28、ap-32、picp-2发酵效果最好，显著高于ck，而f-1发酵效果较差，低于对照。图1不同益生菌种类对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0088]
表3猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0089][0090]
实施例2不同接菌量对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0091]
分别以料液比为1:10，发酵时间为24h，设置不同的接菌量，分别为1％、2％、3％、4％、5％，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行发酵试验，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的接菌量。
[0092]
结果如表4和图2所示。接菌量为5％时，总葡聚糖的含量低于ck，其余不同的接菌量均高于ck，其中接菌量为2％时，总葡聚糖和β-葡聚糖含量最高，为29.76％和29.01％。图2不同接菌量对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0093]
表4猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0094][0095]
实施例3不同发酵料液比对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0096]
分别以2％的接菌量，发酵时间为24h，设置不同的发酵料液比，分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行发酵试验，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的发酵料液比。
[0097]
结果如表5和图3所示。发酵料液比为1:10时，总葡聚糖的含量最高，为27.88％，其余不同的发酵料液比总葡聚糖的含量均低于ck。各处理之间β-葡聚糖具有显著性差异，其中发酵料液比为1:10时，β-葡聚糖的含量最高，为27.38％；发酵料液比为1:30时，β-葡聚糖的含量最低，为23.50％，显著低于ck。图3不同发酵料液比对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0098]
表5猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0099][0100][0101]
实施例4不同发酵时间对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0102]
分别以2％的接菌量，料液比为1:10，设置不同的发酵时间，分别为12h、24h、36h、48h、60h、72h，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行发酵试验，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的发酵时间。
[0103]
结果如表6和图4所示。发酵后各处理间总葡聚糖和β-葡聚糖含量具有显著差异，发酵后β-葡聚糖含量均高于ck。发酵时间为36h时β-葡聚糖的含量，略微低于发酵时间为24h时的β-葡聚糖含量,总体上可以说，随着发酵时间的不断增加，β-葡聚糖的含量呈现为先上升后下降的趋势，当发酵时间为48h时，β-葡聚糖的含量最高，为29.23％，当发酵时间为72h时，β-葡聚糖的含量最低，为25.88％。图4不同发酵时间对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0104]
表6猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0105][0106]
实施例5不同酶种类对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0107]
利用乳酸菌进行发酵后，进行酶解处理，酶添加量为4g/l，酶解温度为50℃，酶解时间为1h，添加不同的酶种类，分别为溶菌酶、果胶酶、纤维素酶，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行酶解试验，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的酶种类。
[0108]
结果如表7和图5所示。各处理间总葡聚糖具有显著差异，其中益生菌lpl28添加溶
菌酶时，总葡聚糖的含量最高，为31.84％。各处理组β-葡聚糖的含量均高于ck，其中益生菌lpl28添加溶菌酶时酶解效果最好，β-葡聚糖的含量为29.22％；当益生菌lpl28添加果胶酶时，β-葡聚糖的含量最低，为24.58％。图5不同酶种类对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0109]
表7猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0110][0111]
实施例6不同复合酶配比对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0112]
酶添加量为4g/l，酶解温度为50℃，酶解时间为1h，添加不同的复合酶，分别为溶菌酶：果胶酶＝1:1、溶菌酶：纤维素酶＝1:1、果胶酶：纤维素酶＝1:1、溶菌酶：果胶酶：纤维素酶＝1:1:1，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行酶解试验，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的复合酶配比。
[0113]
结果如表8和图6所示。当益生菌lpl28添加的溶菌酶：纤维素酶＝1:1时，β-葡聚糖含量最高，为31.77％；当益生菌lpl28添加的果胶酶：纤维素酶＝1:1时，β-葡聚糖含量最低，为28.88％。复合酶酶解后，与单酶相比，总体上总葡聚糖和β-葡聚糖含量有略微提升，但提升幅度较小，考虑到酶的成本以及酶解处理难度，选用单酶溶菌酶进行后续工艺优化。图6不同复合酶配比对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0114]
表8猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0115][0116]
实施例7不同酶添加量对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0117]
酶解温度为50℃、酶解时间为1h，使用筛选到的溶菌酶，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行酶解试验，设置不同的酶添加量，分别为2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的酶添加量。
[0118]
结果如表9和图7所示。酶解后各处理间总葡聚糖和β-葡聚糖含量具有显著差异，酶解后总葡聚糖和β-葡聚糖含量均高于ck。随着酶添加量的不断增加，总葡聚糖和β-葡聚糖的含量呈现为先上升后下降的趋势，当酶添加量为4g/l时，β-葡聚糖的含量最高，为
28.34％，当酶添加量为6g/l时，β-葡聚糖的含量最低，为26.11％。图7为不同酶添加量对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0119]
表9猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0120][0121]
实施例8不同酶解温度对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0122]
酶添加量为4g/l，酶解时间为1h，使用筛选到的溶菌酶，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行酶解试验，设置不同的酶解温度，分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的酶解温度。
[0123]
结果如表10和图8所示。酶解后总葡聚糖和β-葡聚糖含量均高于ck。随着酶解温度的不断增加，总葡聚糖和β-葡聚糖的含量呈现为先上升后下降的趋势，当酶解温度为50℃时，β-葡聚糖的含量最高，为28.33％，当酶解温度为60℃时，β-葡聚糖的含量最低，为24.89％。图8不同酶解温度对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0124]
表10猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0125][0126]
实施例9不同酶解时间对猴头菇β-葡聚糖含量的影响
[0127]
酶添加量为4g/l，使用筛选到的溶菌酶，对筛选到的优异菌株植物乳杆菌lpl28进行酶解试验，设置不同的酶解时间，分别为1h、2h、3h、4h、5h，每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量，确定最优的酶解时间。
[0128]
结果如表11所示。酶解后各处理间总葡聚糖含量具有显著差异，总葡聚糖含量大部分都高于ck，β-葡聚糖含量均高于ck。随着酶解时间的不断增加，总葡聚糖和β-葡聚糖的含量呈现为先上升后下降的趋势，当酶解时间为3h时，β-葡聚糖的含量最高，为28.50％，当酶解时间为5h时，β-葡聚糖的含量最低，为23.50％。图9不同酶解时间对猴头菇葡聚糖含量的影响。
[0129]
表11猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
[0130][0131]
实施例10
[0132]
10.1响应面优化设计
[0133]
在单因素实验基础上，选择a(酶添加量)、b(酶解时间)、c(酶解温度)为自变量，以猴头菇β-葡聚糖含量为响应值，依据box-behnken实验设计原理，进行3因素3水平的响应面优化实验，如表12所示。
[0134]
表12响应面设计因素及水平
[0135][0136]
10.2响应面设计结果
[0137]
以单因素试验结果为依据，设计猴头菇酶解部分的响应面优化试验，试验结果如表13所示。
[0138]
表13响应面试验设计结果
[0139][0140][0141]
利用designexpert10软件对响应面试验进行设计，设计方案及结果见表14，对表13中的数据进行拟合回归，得到自变量(a酶添加量、b酶解温度、c酶解时间)与响应值猴头菇β-葡聚糖含量(y)的二次回归方程：
[0142]
y＝+30.17-0.21a+0.055b+0.047c-0.26ab+0.54ac-0.13bc-1.72a
2-0.47b
2-[0143]
2.45c2[0144]
表14为回归模型的方差分析结果，回归方程模型的f值为9.91，p＜0.05，表明该二次回归模型显著。失拟项p＝0.8015＞0.05，差异不显著；相关系数r2＝0.9272＞0.9，说明该方程模型对猴头菇β-葡聚糖含量的实验值与预测值拟合较好。模型的r2adj＝0.8336，表明83.36％的y值分布与a、b、c这3个因素有关。比较单因素f值可知，对猴头菇β-葡聚糖含量的影响主次顺序为a＞b＞c，即酶添加量＞酶解温度＞酶解时间。比较二次项ab、ac、bc的p值，ac＜ab＜bc，说明a(酶添加量)和c(酶解时间)的交互作用对β-葡聚糖含量的影响最大；a2、c2均达到显著影响。
[0145]
表14方差分析表
[0146]
[0147][0148]
注：p＜0.05差异显著，p＜0.0001差异极显著。
[0149]
10.3各因素交互作用对猴头菇β-葡聚糖含量的响应面分析
[0150]
由表14方差分析可知，a、b、c之间不是简单的线性关系，而是具有一定的交互作用。依据上述回归方程，绘制3个因素交互作用下的响应面图及等高线图，如图10所示，图10为各因素交互作用对猴头菇β-葡聚糖含量的响应面和等高图；由图10可知，沿着a因素(酶添加量)移动的等高线密度高于b因素(酶解温度)方向。从3d曲面图也可看出，沿着a因素方向的曲面较b因素陡峭。酶添加量对猴头菇β-葡聚糖含量的影响大于酶解温度。沿着a因素(酶添加量)移动的等高线密度高于c因素(酶解时间)方向。从3d曲面图也可以看出沿着a因素方向的曲面较c因素陡峭。酶解温度对猴头菇β-葡聚糖含量的影响大于酶解时间。同理，b因素(酶解温度)对子实体粉多糖溶出量的影响大于c因素(酶解时间)。综合以上分析可知酶解的3个因素对猴头菌子实体粉多糖溶出效果的影响主次顺序为：酶添加量＞酶解温度＞酶解时间，与方差分析结果一致。
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响应面试验模型和结果分析表明，猴头菇最佳酶解工艺：酶添加量3.864g/l、酶解温度50.774℃、酶解时间3.001h，此条件下酶解后的猴头菇β-葡聚糖含量为30.18％。根据实际操作可行性，将最佳工艺条件调整为酶添加量4g/l、酶解温度51℃、酶解时间3h，为验证该最佳工艺参数，进行3次重复实验，得到酶解后的猴头菇β-葡聚糖含量为30.44％，与模型预测值相对误差小于1％，表明模型优化参数可行。
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实施例11
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根据响应面的优化试验，可得猴头菇最佳酶解工艺为：酶添加量4g/l、酶解温度51℃、酶解时间3h。为此根据其最佳酶解工艺，分别以2％的接菌量，料液比为1：10，发酵时间为48h，酶添加量为4g/l，酶解温度为51℃，酶解时间为3h，添加菌，具体为lpl28：2％进行发酵、酶解试验，发酵酶解后的样品进行离心处理，转数为8000r/min，离心10min。每组实验设置3个平行组，并设置空白对照组，通过对比β-葡聚糖含量的多少，确定最优的复合菌配比。
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结果如表15所示。与前面试验比较，本次试验进行了离心处理，结果表明离心处理后，β-葡聚糖的含量得到了显著提升。发酵、酶解后各处理间总葡聚糖和β-葡聚糖含量均显著高于ck。
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表15猴头菇葡聚糖含量的显著性差异
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本发明建立了优化的工艺参数：发酵料液比为1：10，发酵菌株为乳酸菌lpl28，接菌量为2％，发酵时间为48h，采用溶菌酶酶解，酶添加量4g/l，酶解温度51℃，酶解时间3h，
酶解后进行离心10min，转数为8000r/min。此条件下，猴头菇发酵粉β-葡聚糖含量可达到42.61％，比对照提升了90.6％。根据最优工艺设计，获得猴头菇发酵菌粉的产率为73.1％。与现有专利cn201811306372.1中涉及的技术相比，β-葡聚糖以及产率均有显著提升。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；b)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；c)将发酵液酶解处理，得到酶解液；d)将酶解液离心，冷冻干燥，即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述猴头菇粉末的制备方法具体为：猴头菇子实体粉碎后，过筛，得到猴头菇粉末；所述过筛为过40～200目筛。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末的质量比为10:5:5:(20～100)。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述益生菌包括但不限于乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌或芽孢杆菌；所述益生菌浓度为1*107cfu/ml以上；所述接种量为1wt％～5wt％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述益生菌为植物乳杆菌picp-2、唾液乳杆菌ap-32、植物乳杆菌lpl28或鼠李糖乳杆菌f-1中的一种或几种；优选的，所述益生菌为lpl28。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述发酵培养具体为：在转速为170r/min,温度为37℃条件下避光发酵培养，发酵周期为24h～72h；所述发酵料液比为1：(10～50)。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)所述酶解的酶为溶菌酶、果胶酶、纤维素酶中的一种或几种组合；所述酶解中的酶的添加量为2g/l-6g/l。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)所述酶解的温度40～60℃；时间为1～5h；摇床转速为170r/min；步骤d)所述离心具体为：8000r/min，离心10min；所述冷冻干燥具体为：真空度2pa，冷阱温度-76℃，冷冻干燥48h～96h。9.一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉，其特征在于，由权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到。10.根据权利要求9所述的富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉，其特征在于，所述发酵猴头菇菌粉中β葡聚糖含量为40％以上。

技术总结
本发明提供了一种富含β-葡聚糖的发酵猴头菇菌粉的制备方法，包括如下步骤：A)葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物和猴头菇粉末混合灭菌，制备得到培养基质；B)将益生菌接种于所述培养基质中，发酵培养，得到发酵液；C)将发酵液酶解处理，得到酶解液；D)将酶解液离心，冷冻干燥，即得发酵猴头菇菌粉。本发明通过上述发酵和酶解结合的方法，使得更加精准化的提升β-葡聚糖含量，通过生物转化高产率的制备一种富含β-葡聚糖的猴头菇发酵菌粉，直接用做功能食品、保健食品、药品原料。药品原料。


技术研发人员：朱迪凡 赵阿丹 龚文兵 彭源德 谢纯良 戴智勇 周映君 欧阳海玉 支海美 李威
受保护的技术使用者：中国农业科学院麻类研究所
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/27