用于纯化生物分子的设备和方法与流程

单磷酸的相变成为可能。
10.mcglone t.等的文章“oscillatory flow reactors(ofrs)for continuous manufacturing and crystallization”(organic process research&development，2015，第19卷，1186-1202)在概述操作原理和总结应用之前，提供了ofr技术的简要概述，强调了用于受控连续结晶的用途。
11.eder r.j.p.等的文章“continuously seeded,continuously operated tubular crystallizer for the production of active pharmaceutical ingredients”(crystal growth&design，2010，第10卷，2247-2257)涉及连续操作的管式结晶器系统，其允许在受控条件下活性药物成分(api)的结晶。
12.r.等的文章“process intensification through continuous spherical crystallization using an oscillatory flow baffled crystallizer(ofbc)”(crystal growth&design，2017，17，9，4776-4784)涉及基于在振荡流挡板式结晶器(ofbc)中进行结晶/球形聚结的研究。
13.因此，需要这样一种设备，其可适应多种规模并且使得能够有效地纯化感兴趣的生物分子，同时避免与过饱和有关的问题并且同时保持简单的配置。


技术实现要素：

14.本发明的第一个目的是提供一种用于纯化生物分子的设备，其包括：
[0015]-包括注入通道的注入装置，所述注入通道设置有至少一个用于沉淀剂组合物的入口和注入通道外表面上的多个出口；以及
[0016]-包括混合通道的混合装置，所述通道设置有至少一个用于待纯化的组合物的主入口和至少一个主出口，以及多个副入口；
[0017]
其中，使注入装置和混合装置耦联，使得注入装置的多个出口中的每一个与混合通道的各自副入口连接。
[0018]
根据一些实施方式，注入通道包括2至40个出口，并且优选地2至20个出口。
[0019]
根据一些实施方式，出口基本上线性地分配在注入通道的外表面，并且优选地均匀地隔开。
[0020]
根据一些实施方式，出口被分组为沿着注入通道分配的不同注入区。
[0021]
根据一些实施方式，混合装置被配置为盘旋导管。
[0022]
根据一些实施方式，混合通道由多个相交的线性段形成。
[0023]
根据一些实施方式，设备仅包括一个与注入装置连接的泵。
[0024]
本发明的第二个目的是提供一种套件(set)，其包括以上所述的设备、包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物以及包括至少一种沉淀剂的组合物。
[0025]
根据一些实施方式，生物分子选自蛋白质和核酸，并且优选地是抗体；和/或其中杂质选自双链的dna、宿主细胞蛋白、高分子量杂质、低分子量杂质和抗体片段或聚集物；和/或其中沉淀剂选自辛酸、聚乙二醇、氯化钙、氯化锌、乙醇、异丙醇及其组合。
[0026]
本发明的第三个目的是提供一种使用以上所述的设备的纯化生物分子的方法，其包括：
[0027]-将包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物经主入口注入到混合通道
中；
[0028]-将包括至少一种沉淀剂的组合物从注入装置经注入装置的多个出口注入到混合通道中；以及
[0029]-在混合装置中沉淀至少一种生物分子或至少一种杂质之一。
[0030]
根据一些实施方式，包括生物分子和杂质的组合物的注入和包括沉淀剂的组合物的注入二者是连续的。
[0031]
根据一些实施方式，生物分子选自蛋白质和核酸，并且优选地是抗体；和/或其中杂质选自双链的dna、宿主细胞蛋白、高分子量杂质、低分子量杂质和抗体片段或聚集物。
[0032]
根据一些实施方式，沉淀剂选自辛酸、聚乙二醇、氯化钙、氯化锌、乙醇、异丙醇及其组合。
[0033]
根据一些实施方式，方法进一步包括经混合通道的至少一个另外的入口将增溶剂或缓冲溶液注入到混合通道的步骤。
[0034]
根据一些实施方式，方法进一步包括经另外的注入装置的至少两个出口将包括至少一种另外的沉淀剂的组合物注入到混合通道的步骤。
[0035]
本发明使解决以上表达的需求成为可能。特别地，本发明提供了一种设备，其可适应多种规模且能够高效地纯化感兴趣的生物分子，同时避免与过饱和有关的问题并且同时保持简单的配置。
[0036]
这是通过本发明的设备实现的，并且更特别地通过包括注入通道的注入装置和包括混合通道的混合装置组合实现的，该注入通道设置有至少一个入口和多个出口，该混合通道包括至少一个主入口和至少一个主出口。注入装置的出口位于注入通道的外表面，并且与混合装置的混合通道的各自副入口连接。这使得在混合装置的不同位置分配通过注入装置的入口注入的和经注入装置的出口注入到混合装置的通道中的沉淀剂成为可能。因此，其允许沉淀剂在混合装置中的连续的和受控的分配(其控制和优化感兴趣的生物分子或一种或多种杂质的沉淀)，并且限制与沉淀剂的过饱和有关的问题。此外，可能使用单个泵(而不是多个泵，每个泵连接到注入装置的不同的出口)来控制沉淀剂通过不同的出口注入到混合装置的混合通道中。
[0037]
此外，本发明提供了设备的不同配置，其使得在各种规模下实施纯化方法成为可能。
附图说明
[0038]
图1示意性地表示根据本发明的一个实施方式的注入装置。
[0039]
图2示意性地表示根据本发明的一个实施方式的注入装置。
[0040]
图3示意性地表示根据本发明的一个实施方式的注入装置。
[0041]
图4示意性地表示根据本发明的一个实施方式的注入装置。
[0042]
图5示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置。
[0043]
图6示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0044]
图7示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0045]
图8示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0046]
图9示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0047]
图10示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0048]
图11示意性地表示根据本发明的一个实施方式的混合装置的混合通道。
[0049]
图12a至12g示意性地表示根据本发明的一个实施方式的设备。
[0050]
图13显示沉淀曲线的示例。液相中生物分子的浓度被绘制成添加的沉淀剂的量的函数。生物分子的浓度(g/l)可以在y轴上读取，并且添加的沉淀剂的量(％)可以在x轴上读取。
[0051]
图14显示曲妥珠单抗(trastuzumab)抗体的纯化因子，其取决于注入的类型和时间(a＝单次注入，b＝多次注入，添加时间＝1min，c＝多次注入，添加时间＝2min，d＝多次注入，添加时间＝3min，e＝多次注入，添加时间＝5min)。纯化因子可以在y轴上读取，并且注入的类型或时间(min)可以在x轴上读取。
[0052]
图15显示mab3抗体的纯化因子，其取决于注入的类型和时间(a＝单次注入，b＝多次注入，添加时间＝1min，c＝多次注入，添加时间＝2min，d＝多次注入，添加时间＝3min，e＝多次注入，添加时间＝5min)。纯化因子可以在y轴上读取，并且注入的类型或时间(min)可以在x轴上读取。
具体实施方式
[0053]
现在将在以下描述中更详细地描述本发明，而不受限制。
[0054]
设备
[0055]
本发明的设备允许从包括至少一种感兴趣的生物分子和至少一种杂质的组合物中纯化至少一种感兴趣的生物分子。更特别地，本发明的设备允许沉淀至少一种感兴趣的生物分子或至少一种杂质。在本发明的背景下，术语“沉淀”意味着在液相中形成固相。为了本发明的目的，结晶尤其被认为是沉淀的形式。
[0056]
本发明的设备包括注入装置1，其进行至少一种沉淀剂的注入，和混合装置2，其进行包括至少一种感兴趣的生物分子和至少一种杂质的组合物与至少一种沉淀剂的混合，装置连接在一起。
[0057]
注入装置1可以通过参照图1至4描述。注入装置1包括注入通道7，其设置有至少一个入口3和在注入通道7的外表面上的多个出口si。“通道”是指在注入装置1中形成的管状或柱状的通道，用于流体从入口3流向出口si。
[0058]
根据一些实施方式，注入通道7是基本上线性的(例如，比如在图1至3中所示)。
[0059]
根据其他的实施方式，注入通道7是分支的，如图4中所示。在这种情况下，来自入口3的流体被分配到两个或更多个通道分支，每个分支包括一个或多个出口si。
[0060]
注入通道7可以具有例如矩形或四方形或圆形的横截面(垂直于主要流动方向)。图1示出了矩形的横截面。
[0061]
注入通道7可具有0.2mm至10cm，优选地0.5mm到5cm的内部液压直径。适当的液压直径优选地可以为将穿过注入通道7的流量的函数：例如，用于1至10ml/min的流量，直径刻度是毫米的直径刻度，而1cm的液压直径可适合用于100到1000ml/min的流量。
[0062]
对于非圆形的注入通道7，术语“液压直径”被定义为等于4xa/p的比值，其中a是注入通道7的截面(cross section)，并且p是注入通道7的周长。
[0063]
根据一些优选的实施方式，注入通道7仅包括一个入口3。
[0064]
根据其他实施方式，注入通道7可以包括多于一个的入口3，例如两个或三个入口3。该实施方式特别地适合于许多装置并联的情况，或为了避免在注入通道7中具有气泡。
[0065]
入口3使得将流体(比如包括沉淀剂的组合物)引入注入通道7成为可能。
[0066]
如以上提到的，注入装置1包括位于注入通道7的外表面上的多个出口si。注入装置1可以包括2至40个出口，并且优选地2至20个出口。例如，注入装置1可以包括2至5个出口si；或5至10个出口si；或10至15个出口si；或15至20个出口si；或20至25个出口si；或25至30个出口si；或30至35个出口si；或35至40个出口si。
[0067]
如果注入通道7具有矩形或四方形(或其他多边形)的截面，则布置出口si的外表面可以是平坦面(planar surface)。有利地，所有出口si被布置在同一个平坦面上。在其他实施方式中，出口si可以被布置在两个或更多个不同的平坦面上。
[0068]
根据一些实施方式并且如图1中所示的，每个出口si(图1中的s1至s20)是仅仅由注入通道7的壁上的孔简单地形成。
[0069]
根据其他实施方式并且如图2中所示的，每个出口si(图2中的s1至s20)形成为从通道7的外表面分支的侧边导管。
[0070]
每个出口si优选地具有圆形的横截面，尽管其他形状比如四方形或矩形的横截面也是可能的。出口si的内直径可被定义为出口的最大横截面尺寸(垂直于通过出口的流动方向)。
[0071]
在一些实施方式中，不同的出口si可具有不同的内直径。在其他实施方式中，所有出口si具有相同的内直径。
[0072]
有利地，选择这些各自的直径以及注入通道7的长度(沿着主要流动方向)，使得在使用时，当流体流经注入通道7时产生的压降低于当流体经多个出口si离开注入通道7时产生的压降—优选地低至少2倍、更优选地至少3倍并且甚至更优选地至少5倍。这使得通过各个出口si均匀地分配流体成为可能。
[0073]
优选地，通过每个出口si的流量基本上等于通过注入通道7的总流量除以出口si的总数。
[0074]
根据一些实施方式(图1和图2中明显地示出的)，可沿着注入通道7的外表面上的直线布置出口si。此外，出口si可沿着注入通道7有规律地间隔开(相邻出口si之间的距离是恒定的)。这使得以有规律的方式分配来自出口si的流体成为可能。
[0075]
在其他实施方式中，注入装置1可以包括两个或更多个注入区8。每个注入区8包括两个或更多个出口si。这在图3和图4中明显地说明。
[0076]
一个注入区8中的出口定位成比另一个注入区8的出口显著地更靠近于彼此。这可在数学上被定义例如如下。使d
si-sj
为任何两个出口si和sj的几何中心之间的距离。使d
ain max
为所有可能的出口si-sj对的d
si-sj
的最大值，其中si和sj二者属于相同注入区a。使d
aout min
为所有可能的出口si-sj对的d
si-sj
的最小值，其中si属于注入区a，并且sj不属于注入区a。优选地，d
ain max
小于5倍的d
aout min
。更优选地，d
ain max
小于10倍的d
aout min
。甚至更优选地，d
ain max
小于20倍的d
aout min
。优选地，所有注入区8满足该条件。
[0077]
在一些实施方式中，每个出口si是注入区8的一部分(如图3和图4中所示)。在其他实施方式中，一些出口si可以为注入区8的一部分，并且一个或多个其他出口si可以为单独的，即不属于任何注入区8。
[0078]
注入通道7上出口si的不均匀分配，并且尤其如以上定义的注入区8的存在，使得流体以不规则的方式分配到混合装置2中成为可能。例如，如果每个出口si分配总流量(total flow rate)的相等单位部分(总流量除以出口si的总数)，则根据其包含的出口si的数量，每个注入区8分配一定部分的流量。
[0079]
例如，通过参照图3或4，注入通道7包括五个注入区8：包括出口s1至s6的第一注入区8(其可分配流体总流量的30％)，包括出口s7和s8的第二注入区8(其可分配流体总流量的10％)，包括出口s9至s11的第三注入区8(其可分配流体总流量的15％)、包括出口s12至s15的第四注入区8(其可分配流体总流量的20％)和包括出口s16至s20的第五注入区8(其可分配流体总流量的25％)。
[0080]
注入通道7可以包括1至40个注入区8，并且优选地5至20个注入区8。
[0081]
每个注入区8可以包括2至40个出口si。例如，每个注入区8可以包括2至3个；或3至5个；或5至10个；或10至15个；或15至20个；或20至25个；或25至30个；或30至35个；或35至40个出口si。
[0082]
根据一些实施方式(尤其当沉淀剂是聚乙二醇时，如以下将描述的)，注入通道7可以包括三个注入区8和两个单独的出口。例如，从入口3的较近至较远，出口si可分配于：1)包括12个出口si的区域、2)单独的出口si、3)另一单独的出口si、4)包括3个出口si的区域和5)包括14个出口si的区域。优选地，每个区域或单独的出口占沉淀产率的近似20％。
[0083]
根据其他实施方式(尤其当使用不同于聚乙二醇的沉淀剂时)，注入通道7可以包括3至6个出口si，出口si沿着注入通道7有规律地间隔地沿着直线布置。
[0084]
注入装置1可以包括至少一个另外的出口(除出口si外，并且不与混合装置2连接)。该另外的出口可用于例如清洗或洗涤注入装置1，或去除装置中存在的任何气泡。当如以下描述的操作注入装置1时，另外的出口可以有利地关闭，以便流体可流经注入装置1并且从出口si流出。
[0085]
注入装置1还可以包括一个或多个泵，用于将流体通过入口3注入且从出口si出去。有利地，注入装置1包括单个泵，用于分配通过入口3且从出口si出去的流体。这使得简化本发明的设备的配置成为可能。
[0086]
在一些实施方式中，注入装置1可以包括压力控制装置，如液压反向调节器(back regulator)、止回阀或可用于设置出口si上压降的任何类似的装置。该实施方式可特别地适合于大规模的装置。
[0087]
混合装置2可通过参照图5至11来描述。本发明的混合装置2包括混合通道4，其设置有在混合通道4的第一末端上的至少一个主入口5和在混合通道4的第二末端上的至少一个主出口6。“通道”是指在混合装置2中形成的管状通道。
[0088]
根据一些实施方式，混合通道4设置有单个主入口5和单个主出口6。主入口5使得将流体引入混合通道4成为可能，所述流体是包括至少一种感兴趣的生物分子和至少一种杂质的组合物。主出口6使得能够回收通过混合沉淀剂沉淀后得到的组合物。
[0089]
混合通道4可具有例如矩形或四方形或圆形的横截面(垂直于主要流动方向)。
[0090]
混合通道4可具有0.5mm至50mm、优选地0.8mm至10mm和更优选地0.9mm至2mm的内部液压直径。例如，该直径可以为0.5mm至1mm、或1mm至2mm、或2mm至4mm、或4mm至6mm、或6mm至8mm、或8mm至12mm、或12mm至15mm、或15mm至20mm、或20mm至25mm、或25mm至30mm、或30mm
至35mm、或35mm至40mm、或40mm至45mm；或45mm至50mm。举例来说，可优选0.9mm至1mm的内部液压直径。
[0091]
对于非圆形的混合通道4，“液压直径”被定义为为4xa/p的比值，其中a是混合通道4的横截面，并且p是混合通道4的周长。根据一些实施方式，并且如将在以下详细说明，混合通道4可以为例如内部或管子或导管。管子或导管可由例如钢或聚合物(比如硅基塑料、热塑性弹性体(tpe)、聚丙烯、聚偏氟乙烯(pvdf)、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯)制成。可替选地，混合通道4可例如由多个被组装在一起的板形成。板可例如由钢或聚合物(比如硅基塑料、tpe、聚丙烯、pvdf、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯)制成。
[0092]
根据一些实施方式，混合装置2被配置成围绕中心轴线盘绕的导管。
[0093]
在这种实施方式中，优选的是混合通道4具有圆形的横截面。当需要大规模纯化时，这种实施方式是优选的。
[0094]
盘管(coil)可被配置成例如圆形螺旋状物、锥形螺旋状物或水平螺旋状物。
[0095]
图5说明了这种实施方式的具体示例。在这种情况下，盘管被配置成圆形螺旋状物。如图5中所示，主入口5位于混合装置2的下端，而出口6位于混合装置2的上端。然而，也可能认为主入口5位于混合装置2的上端，而主出口6位于混合装置2的下端。
[0096]
优选地，从主入口5至主出口6的盘状导管的体积可根据设备的规模以及因此盘状导管中的流量来调整。
[0097]
关于盘状导管中的流量，在实验室规模下，流量可以为1ml/min至10ml/min的范围，而对于生产规模，流量可以为100l/小时至500l/小时的范围。因此，可以确定盘状导管的体积，以便确保0.5min至60min的停留时间，例如0.5min至3min、或3min至6min、或6min至9min、或9min至12min、或12min至15min、或15min至25min、或25min至35min、或35min至45min、或45min至60min的停留时间。
[0098]
根据其他实施方式，混合通道4包括多个连续的通道单元。通道单元可以为相同的，在这种情况下，沿着通道多次重复相同的图案。每个通道单元尤其可以包括多个相交的线性段。图6至11说明了这种实施方式。当需要小规模纯化时，它们可以是优选的。
[0099]
混合通道4的相邻线性段可以形成20
°
至150
°
的角度。优选地，该角度可以为30
°
至100
°
，并且更优选地90
°
。图案可以重复2次至10000次，优选地50次至5000次，并且更优选地100次至1500次。所得混合通道4的弯曲度使得以有效的方式混合混合通道4中存在的成分成为可能。更特别地，尤其当混合具有不同粘度的液体时，所述弯曲度使得减少或防止更粘性的液体的积聚成为可能，否则这些液体会倾向于积聚在混合通道4的下部。
[0100]
线性相邻段可以优选地都具有相同的长度(沿着主要流动方向)。可替选地，一些线性相邻段可具有不同的长度。
[0101]
根据一些实施方式，混合通道4可以包括单一的重复图案。
[0102]
根据其他实施方式，混合通道4可以包括多于一个的重复图案。
[0103]
根据一些实施方式，比如图6中所示的实施方式，混合通道4的配置是二维的，即所有段属于相同平面。
[0104]
根据其他实施方式，比如图7和图8中所示的实施方式，混合通道4的配置是三维的，即并非所有的段都属于相同平面。
[0105]
混合通道4也可以包括几个部分，每个部分为如上描述的图案。不同部分可彼此平
行并且连接在一起布置。这可增加结构的容量(compacity)。
[0106]
例如，图9至11分别示出具有与图6至8中所示图案的相同图案的通道，但这次是分配在平行设置并且连接在一起的几个连续部分中。
[0107]
其他可能的结构(图中没有示出的)包括图9至11中所示的两个或更多个配置的叠加，这种结构仍形成单个的混合通道4。
[0108]
此外，参考根据本发明的所有可能的混合装置2，其他可能的结构(图中没有示出)包括串联布置至少两个混合通道4(例如根据图5的至少两个混合通道4，或根据图6至8的至少两个混合通道4)。在这种情况下，每个混合通道4可以连接到不同的注入装置1，使得将不同的沉淀剂注入到每个混合通道4中成为可能。
[0109]
混合装置2还可以包括至少一个泵。泵使得在混合通道4内移动混合物成为可能。
[0110]
此外，当混合装置2被配置成盘状导管时，设备可以包括与混合装置2组合的静态混合器。
[0111]
如以上提到的，注入装置1与混合装置2连接。更特别地，注入装置1的多个出口si与混合通道4的各自副入口连接。这使得直接将沉淀剂注入到混合通道4中成为可能，并且优选地通过使用单个泵。此外，注入装置1包括多个出口si的事实使得将在不同的位置中的沉淀剂连续注入到混合通道4中成为可能。
[0112]
注入装置1的出口si可与混合通道4的副入口直接地连接。“直接地”是指没有中间的管子或导管。例如，图2中示出的注入装置是这种情况，其中每个出口si形成侧向导管，其可以通向混合通道4内部。可替选地，混合通道的副入口可以以侧向导管的形式。可替选地，注入装置1的出口si可与混合通道4间接地连接(通过例如中间的管子或导管)。例如，图1中示出的注入装置是这种情况，其中每个出口si是简单的孔。仍可替选地，注入通道7的出口si和混合通道4的副入口二者可以为相互接触设置的简单的孔。
[0113]
假如混合装置2包括盘状导管(例如图5中所示)，注入装置1的每个出口si可与混合装置2的通道4的不同盘管连接。例如，图1或图2的注入装置1可用于将沉淀剂注入到图5的混合装置2中。在这种情况下，由于在注入装置1的表面上出口si的线性配置，使得通过图1或图2的注入装置1的出口si将沉淀剂注入到图5的混合装置2的不同盘管中成为可能。可替选地，多于一个的出口si可与混合装置2的通道4的每个盘管连接。例如，图3的注入装置1可用于将沉淀剂注入到图5的混合装置2中。在这种情况下，不同量的沉淀剂可被注入到不同的盘管中，该量取决于连接至每个盘管的出口si的数量。
[0114]
根据一些实施方式，尤其是假如混合通道4由多个相交的线性段组成，则设备可以由多个包括切口的板组成，板被紧固并且组装在一起。图12a至12g说明了这种配置，其中图12a至12g的板以从图12a的板至图12g的板的顺序组装。更特别地，图12b至12d的板包括切口，所述切口在组装时形成混合通道4；图12e的板包括对应于注入装置1的出口si的侧边导管的切口；图12f的板包括注入通道7的切口；并且图12g的板包括注入通道7的入口3和另外的出口9(除出口si外)的切口，另外的出口9通常是封闭的，但必要时也可用于排空空气(更不用说，入口3和副出口9的位置可以在板上颠倒)。因此，设备包括混合通道4，其设置有图12e的板的上部上的主入口5，用于引入流体(例如，包括至少一种感兴趣的生物分子和至少一种杂质的混合物)，和图12e的板的下部上的主出口6，用于收回最终溶液(沉淀后)。更不用说，主入口5和主出口6的位置可以在板上颠倒。
[0115]
图12b至12d中说明的混合通道4包括重复的图案(如以上详细描述的)。在该具体配置中，混合通道4包括多个平行连接的部分。此外，图12e示出了与混合通道4的不同位置连接的多个出口si(属于图12f中示出的注入通道7)。
[0116]
在一些实施方式中，混合通道4可以还包括另外的入口，优选地单个另外的入口。另外的入口可与除注入装置1之外的源和待纯化的混合物源连接。这种另外的入口可使得将另外的成分引入混合通道4(比如增溶剂或缓冲溶液)成为可能。另外的入口可优选地位于主入口5的下游，并且更优选地比主入口5更靠近混合通道4的主出口6(沿着流动方向)。在一些实施方式中，另外的入口位于两个副入口之间。
[0117]
在一些实施方式中，混合通道4可以包括一个或多个另外的入口，用于将部分沉淀剂引入混合通道4。另外的入口与除注入装置1以外的源连接。它们尤其可以位于注入装置1的出口si的上游和/或下游。在这种情况下，沉淀剂部分通过注入装置1的出口si形成的注入点，并且部分通过另外的入口注入到混合通道4中。
[0118]
方法
[0119]
如以上提到的，本发明涉及一种从包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物中纯化至少一种生物分子的方法。优选地，该方法是用以上描述的设备进行的。
[0120]
根据本发明的方法包括将包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物经混合装置2的主入口5注入到混合通道4中的第一步骤。该组合物优选地是水性组合物。
[0121]
生物分子可以为蛋白质、核酸或抗体。
[0122]
根据优选的实施方式，生物分子是抗体。抗体例如可以为单克隆或多克隆抗体。
[0123]
杂质可选自双链dna (dsdna)、宿主细胞蛋白(hcp)、高分子量杂质(hmwi)、低分子量杂质(lmwi)和抗体片段或聚集物。
[0124]
因此，待注入到混合装置2的混合通道4中的组合物可以来自细胞培养，或来自发酵过程(例如，来自发酵或澄清的液体培养基(broth))，或来自天然流体的样品，例如比如血液样品。
[0125]
沉淀剂的流量与注入到混合通道4中的组合物的流量的比值可以为1至60％。该比值可以尤其为1％至3％，或3％至6％，或6％至9％，或9％至12％，或12％至15％，或15％至20％，或20％至30％，或30％至40％，或40％至50％，或50％至60％。
[0126]
方法进一步包括将包括至少一种沉淀剂的组合物注入到混合通道4中的步骤。该组合物优选地是水性组合物。
[0127]
优选地，两种注入是连续地进行的。可替选地，尤其在清洁或启动程序的情况下，停止注入沉淀剂或注入待纯化的组合物可能是感兴趣的。
[0128]
因此，当注入包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物并且因此在混合通道4中流动时，包括至少一种沉淀剂的组合物以连续方式注入到混合通道4的不同位置，并且因此在这些不同位置处连续地与包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物接触。
[0129]“沉淀剂”是指能够使以上描述的混合物中包括的生物分子或杂质之一沉淀(在液体混合物中形成固相)的化合物。沉淀剂可选自带电聚合物、阳离子洗涤剂、短链脂肪酸、无机盐及其组合。例如，沉淀剂可选自脂肪酸，尤其是辛酸(例如以1-4％w/v的浓度)、不同分子量的聚乙二醇(peg)(例如100至50000或300至20000，例如近似300，或近似600，或近似1500，或近似4000，或近似6000，或近似20000)、氯化钙(例如，具有100mm至500mm的浓度)、
氯化锌、醇类(比如乙醇和异丙醇)，以及它们的组合。
[0130]
根据一些实施方式，上述组合物包括单一的沉淀剂。
[0131]
根据其他实施方式，上述组合物包括不同沉淀剂的混合物。例如，盐(比如氯化钙)可与脂肪酸(比如辛酸)组合。
[0132]
根据其他实施方式，沉淀剂的添加是在用缓冲液，比如磷酸盐缓冲液(例如2mm及以上)ph调整后进行的。
[0133]
结果，将沉淀剂与包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物混合导致一种化合物在混合装置2中的沉淀。根据一些实施方式，该化合物可以为包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物中包括的生物分子。在这种情况下，处于固体状态的生物分子可以从混合装置2的下游与杂质隔离和分离。根据其他实施方式，该化合物可以为包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物包括的杂质。在这种情况下，杂质处于固体状态，其可以被去除，并且包括生物分子的液相可以从混合装置2的下游回收并且分离。在这两种情况下，分离可以通过例如过滤和/或离心进行。
[0134]
然后，包括沉淀剂的组合物可以经注入通道7的表面上存在的出口si注入到混合通道4中。这使得在不同的位置(地点)处的包括沉淀剂的组合物连续地分配到混合通道4中成为可能。注入通道7上的注入区8的数量和位置，以及每个注入区8的出口si的数量，使得控制生物分子或杂质的分配并且因此沉淀成为可能。
[0135]
例如，参考图13，其示出了在添加peg 6000作为沉淀剂期间抗体的溶解度曲线，可以区分三个区域(a、b、c)。第一区域(a)对应于其中尽管注入沉淀剂，但抗体的沉淀还没有开始的区域。第二区域(b)对应于其中添加沉淀剂后快速沉淀的区域。最后，第三区域(c)对应于其中抗体的沉淀几乎已经结束，并且注入沉淀剂将仅沉淀出少量的抗体的区域。优选的是沉淀剂的注入应适合于图13中示出的溶解度曲线。例如，当在包括图3中示出的注入装置1和图5中示出的混合装置2的设备中进行纯化并且参照图13时，第一量的沉淀剂可以通过出口s1至s6(这对应于图13的区域a)注入，然后可通过将沉淀剂通过出口s7、s8，然后出口s9至s11，然后出口s12至s15(这对应于图13的区域b，其中沉淀剂应以较低的速度添加，以避免过度饱和)注入而缓慢地继续沉淀，并且最后，通过将沉淀剂通过通道s16至s20(这对应于图13的区域c)注入而终止沉淀。
[0136]
根据一些实施方式，根据本发明的方法可以包括注入包括第一沉淀剂的组合物的步骤，并且然后注入包括第二沉淀剂的组合物的步骤。两次注入优选地是连续的。这可以当两个注入装置1与混合装置2连接时进行。因此，第一沉淀剂可以通过第一注入装置1的出口si注入，而第二沉淀剂可以通过第二注入装置1的出口si注入。不言而喻，可以以同样的方式注入超过两种的沉淀剂。可替选地，这可以当两个混合装置2串联连接时进行，每个混合装置与不同的注入装置1相连(和每个注入装置1注入不同的沉淀剂)。这使得通过使用第一种沉淀剂首先沉淀第一杂质，并且然后通过使用第二沉淀剂沉淀第二杂质成为可能。可替选地，可能首先用第一沉淀剂沉淀杂质，然后用第二沉淀剂沉淀感兴趣的生物分子。
[0137]
根据一些优选的实施方式，包括至少一种沉淀剂的组合物进入混合通道4的添加时间可以为1至10min，优选地1至5min，更优选地2至3min。“添加时间”是指流经混合通道4的组合物在组合物的流动方向上在沉淀剂的第一注入点和沉淀剂的最后注入点之间行进所花费的时间(基于总流量)。这些注入点二者可以是为如以上描述的si出口。可替选地，这
些注入点中的一个或两个可以为如以上描述的的另外的入口。
[0138]
假如两个或更多个混合通道4串联连接，则“添加时间”是指流经混合通道4的组合物在组合物的流动方向上在沉淀剂的第一注入点和沉淀剂的最后注入点之间行进花费的时间。
[0139]
根据一些优选的实施方式，包括至少一种沉淀剂的组合物进入混合通道4的90％注入时间可以为1至10分钟、优选地1至5分钟并且更优选地2至3分钟。“90％注入时间”是指将90wt.％的沉淀剂组合物注入混合通道4(通过所有注入点)所花费的时间。
[0140]
在1分钟和10分钟之间的添加时间和/或在1分钟和10分钟之间的90％注入时间使得提高纯化的生物分子的纯度成为可能。
[0141]
根据一些实施方式，根据本发明的方法可以进一步包括将增溶剂注入到混合通道4中的步骤。该注入优选地是连续的。注入增溶剂的目的可能是在基于生长现象而不是成核现象重新沉淀更多量的杂质或生物分子之前增溶小颗粒。增溶剂可选自当前的(state-of-the-art)缓冲剂，比如水、超纯水、磷酸盐缓冲液(pbs)或甘氨酸。这种试剂的注入可以在相对接近于沉淀结束时进行；例如，它可以恰好在最后注入区的上游进行，或在倒数第二注入区的上游进行。
[0142]
根据一些实施方式，根据本发明的方法可以进一步包括将缓冲溶液注入到通道4中的步骤。该注入优选地是连续的。注入这种缓冲溶液的目的可能是为了在沉淀过程中改变ph值，以便避免对感兴趣的生物分子的损害。
[0143]
实施例
[0144]
以下实施例说明了本发明，但没有对其进行限制。
[0145]
实施例1
[0146]
作为比较实施例，用包括与混合通道结合的注入装置的设备进行单次注入实验，其中注入装置具有单个出口，将40wt.％的peg6000溶液引入混合通道。
[0147]
用根据本发明的包括与混合通道结合的注入装置的几个设备进行了多次注入实验。注入装置包括通道和分组在五个注入区中的多个出口(第一区包括12个出口、第二区包括1个出口、第三区包括1个出口、第四区包括3个出口、第五区包括14个出口
‑‑
共31个出口)，沉淀剂组合物的总体积的近似38％、3％、3％、9％和47％分别通过五个注入区注入，时间近似相当于在混合通道中组合物流动的总停留时间的五分之一。换句话说，peg6000溶液是在这些不同的位置添加的。各种设备被设计具有不同体积的混合通道4，以便获得具有不同添加时间(1、2、3和5分钟)的peg6000溶液的注入，以1ml/min的流量。以允许在混合通道出口处达到20wt.％peg6000的体积比添加40wt.％的peg6000溶液。
[0148]
在这两种情况下(单次和多次注入)，在混合通道中流动的是包括抗体的组合物。
[0149]
然后用20wt.％的peg6000洗涤获得的沉淀溶液。用磷酸盐缓冲盐水溶液(ph 3.5)再溶解固体。对所得样品进行纯度和产率分析，以确定纯化因子。
[0150]
实验是用cacl2和辛酸预先处理的曲妥珠单抗抗体(为了沉淀不同的杂质)和没有经历预先处理的mab3抗体进行的。mab的水平包括在1g/l和1.4g/l之间。
[0151]
每个样品的纯化因子是通过尺寸排除色谱法测量的，详情如下：
[0152]
使用g3000swxl hplc色谱柱(5μm，7.8
×
300mm)结合tskgelswxl保护柱(7μm，6.0
×
40mm；tosoh，tokyo，日本)，以确定样品的纯度。使用配备有二极管阵列检测器
的dionex ulti-mate 3000hplc系统(thermo fisher scientific)。
[0153]
吸光度在280nm处测量。
[0154]
基于280nm的信号，抗体纯度被计算为抗体峰面积与所有峰面积之和的比值。运行缓冲液是具有150mm nacl的50mm磷酸二氢钾(potassium phosphate)缓冲液，ph7.0(merck kgaa)，其通过0.22μm过滤器(merck kgaa)过滤并且脱气。
[0155]
将20μl的过滤样品注入到tskgel柱中。用chromeleon tm软件(thermofisher scientific)评估数据。
[0156]
基于280nm的信号，抗体纯度被计算为单体峰面积与所有峰面积之和的比值。
[0157][0158]
对所有样品进行mab和曲妥珠单抗浓度和纯度的分析，以计算纯化因子。纯化因子被计算为抗体峰面积和杂质峰面积的比值，并且与初始样品进行比较。
[0159][0160]
使用亲和柱poros a 20μm柱(2.1
×
30mm，0.1ml，thermo scientific)测定抗体浓度。使用配备有二极管阵列检测器的dionex ultimate 3000hplc系统(thermo fisher scientific)。在280nm处测量吸光度，并且使用校准标准对蛋白质进行定量。流动相a是50mm磷酸盐缓冲液(ph 7.0)，并且流动相b是100mm甘氨酸缓冲液(ph 2.5)。所有缓冲液通过0.22μm的过滤器(merck kgaa)过滤并且脱气。系统以2.5ml/min的流量运行。
[0161]
将20μl的样品注入到poros a柱中。用10柱体积的流动相a平衡柱，用20柱体积的100％流动相b以梯度洗脱样品，并且用30柱体积的流动相a重新平衡。用chromeleon tm软件(thermofisher scientific)评估数据。
[0162]
杂质中的浓度是基于抗体浓度和抗体的纯度来确定的。这使得能够最终计算出纯化因子。
[0163]
图14中示出曲妥珠单抗的结果。
[0164]
图15中示出mab3的结果。
[0165]
两幅图都说明，当添加时间是1min(b)时或当通过一个单个出口(a)注入peg溶液时，抗体具有较低的纯化因子。相反，当以3(d)分钟(对于曲妥珠单抗)和2(c)、3(d)或5(e)分钟(对于mab3)注入peg时，纯化因子显著地增加。因此，这些结果显示了连续添加对于获得产物的纯度的重要性(尤其是特定添加时间的重要性)。

技术特征：
1.一种用于纯化生物分子的设备，其包括：-包括注入通道(7)的注入装置(1)，所述注入通道(7)设置有至少一个用于沉淀剂组合物的入口(3)和在所述注入通道(7)外表面上的多个出口(si)；以及-包括混合通道(4)的混合装置(2)，所述混合通道(4)设置有至少一个用于待纯化的组合物的主入口(5)和至少一个主出口(6)，以及多个副入口；其中，使所述注入装置(1)和所述混合装置(2)耦联，使得所述注入装置(1)的多个出口(si)中的每一个与所述混合通道(4)的各自副入口连接。2.根据权利要求1所述的设备，其中所述注入通道(7)包括2至40个出口(si)，优选地2至20个出口(si)。3.根据权利要求1或2中任一项所述的设备，其中所述出口(si)在所述注入通道(7)的外表面上基本上线性地分布并且优选地是均匀地隔开的。4.根据权利要求1或2中任一项所述的设备，其中所述出口(si)被分组成沿着所述注入通道(7)分布的不同的注入区(8)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的设备，其中所述混合装置(2)被配置为盘状导管。6.根据权利要求1至4中任一项所述的设备，其中所述混合通道(4)由多个相交的线性段形成。7.根据权利要求1至6中任一项所述的设备，其包括仅一个连接至所述注入装置(1)的泵。8.一种套件，其包括根据权利要求1至7中任一项所述的设备、包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物和包括至少一种沉淀剂的组合物。9.根据权利要求8所述的套件，其中所述生物分子选自蛋白质和核酸，并且优选地是抗体；和/或其中所述杂质选自双链dna、宿主细胞蛋白、高分子量杂质、低分子量杂质和抗体片段或聚集物；和/或其中，所述沉淀剂选自辛酸、聚乙二醇、氯化钙、氯化锌、乙醇、异丙醇及其组合。10.一种使用权利要求1至7中任一项所述的设备纯化生物分子的方法，其包括：-将包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物经所述主入口(5)注入到所述混合通道(4)中；-将来自所述注入装置(1)的包括至少一种沉淀剂的组合物经所述注入装置(1)的多个出口(si)注入到所述混合通道(4)中；以及-将所述至少一种生物分子或所述至少一种杂质之一沉淀到所述混合装置(2)中。11.根据权利要求10所述的方法，其中包括所述生物分子和所述杂质的组合物的注入和包括所述沉淀剂的组合物的注入二者是连续的。12.根据权利要求10或11中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自蛋白质和核酸，并且优选地是抗体；和/或其中所述杂质选自双链dna、宿主细胞蛋白、高分子量杂质、低分子量同种型和抗体片段或聚集物。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述沉淀剂选自辛酸、聚乙二醇、氯化钙、氯化锌、乙醇、异丙醇及其组合。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，进一步包括将增溶剂或缓冲液溶液经由所述混合通道(4)的至少一个另外的入口注入到所述混合通道(4)中的步骤。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，进一步包括将包括至少一种另外的沉淀剂的组合物经由另外的注入装置(1)的至少两个出口(si)注入到所述混合通道(4)中的步骤。16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中包括至少一种沉淀剂的组合物进入所述混合通道(4)的添加时间是1分钟至10分钟、优选地1分钟至5分钟，更优选地2分钟至3分钟。

技术总结
本发明涉及一种用于纯化生物分子的设备，其包括：注入装置(1)，其包括注入通道(7)，注入通道设置有至少一个用于沉淀剂组合物的入口(3)和注入通道外表面上的多个出口(Si)；和混合装置(2)，其包括混合通道(4)，混合通道设置有至少一个用于待纯化的组合物的主入口(5)和至少一个主出口(6)，以及多个副入口；其中，注入装置(1)和混合装置(2)耦联，使得注入装置(1)的多个出口(Si)中的每个与混合通道(4)的各自副入口连接。本发明进一步涉及套件，其包括所述设备、包括至少一种生物分子和至少一种杂质的组合物和包括至少一种沉淀剂的组合物，并且涉及使用所述设备纯化生物分子的方法。并且涉及使用所述设备纯化生物分子的方法。并且涉及使用所述设备纯化生物分子的方法。


技术研发人员：埃里克
受保护的技术使用者：赛多利斯层析设备
技术研发日：2021.06.15
技术公布日：2023/7/21