一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用的制作方法

一种表达红霉素降解酶erea的布拉迪酵母的构建及应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达红霉素降解酶erea的布拉迪酵母的构建及应用。


背景技术：

2.自1928年alexander fleming发现了第一个抗生素青霉素，抗生素成为人和动物不可替代的医疗产品。一项调查预测，全球抗菌素消费量将增加67.0％，从63151
±
1560吨(2010年)增至105596
±
3605吨(2030年)。我国2020和2021年兽医公报显示在2019和2020年全国大环内酯类抗生素分别消耗3020.05和3266.309吨，占比全年抗生素消费总量的9.77％和9.97％，连续两年位居第四位。其中，红霉素是使用最广泛的大环内酯类抗生素之一，并且由于其在环境中的持久性而成为顽固污染物。红霉素广泛用于牲畜的生长促进剂，红霉素在小肠内代谢吸收，残留的红霉素以原形随粪便排出体外，大约一半的口服红霉素以20mg/kg的剂量排泄到粪便中。因此，动物粪便是环境中抗生素污染的主要来源之一。药物和个人护理产品(pharmaceutical andpersonal care products，ppcps)被定义为一类新兴的环境污染物，因为它们在低剂量下会对人体产生代谢影响的内在危害，故对环境中的红霉素进行消除具有重要意义。
3.现有的抗生素消除方法分为生物消除和非生物消除，两者大多是对环境中的抗生素进行消除，几乎没有源头消除抗生素残留的方法。minrui liu等人[j hazard mater.2020apr15,388:122032]公开了一种以大肠杆菌为宿主菌表达红霉素酯酶以降低动物粪便中抗生素残留的方法。然而，据我们所知，细菌作为表面表达erea的宿主菌具有生物安全风险。并且其筛选阳性转化子的过程中使用抗生素作为选择压力，可以避免由于分离或结构不稳定性而引起的质粒丢失。但使用抗生素抗性作为选择标记需要在整个培养器件供应抗生素，成本较高。
[0004]
酵母作为一种表达重组蛋白的工具，近年来受到越来越多的关注。s.boulardii益生菌产品已在全球范围内获批上市，并且在预防和治疗抗生素相关腹泻、旅行者腹泻、hiv/aids相关腹泻、儿童急性胃肠炎和艰难梭菌的重复感染等疾病中具有良好效果，极少报道菌血症等不良反应。鉴于其优异的益生作用，越来越多的国外公司在膳食补充剂中使用布拉迪酵母。另外，我国2017年国家卫计委新食品原料受理中的食新进申字(2017)第0001号也已经开始受理了s.boulardii作为新食品原料的申报。目前关于利用s.boulardii表达红霉素降解酶erea的研究未见报道。


技术实现要素：

[0005]
针对目前现有技术存在的不足，本发明提供一种能够实现肠道原位降解红霉素的益生菌s.boulardii。本发明主要针对源头进行抗生素消除，以s.boulardii作为表达erea的宿主菌，一方面可以在发挥其自身原有的益生功能同时实现对红霉素残留的源头(肠道)消除，最大限度地避免红霉素流入到周围环境。另一方面可避开以往基因工程菌的缺陷，杜
绝了临床重要耐药基因erea的外泄风险。
[0006]
本发明的首要目的在于提供一种表达红霉素降解酶erea的工程益生菌s.boulardii。
[0007]
本发明的第二个目的在于提供一种表达红霉素降解酶erea的工程益生菌s.boulardii的构建方法。
[0008]
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0009]
一种表达红霉素降解酶erea的工程益生菌s.boulardii，其构建方法包括如下步骤：
[0010]
s1、构建尿嘧啶(uracil)营养缺陷型菌株s.boulardi/ura3-/-；
[0011]
s2、将携带operea基因插入到含ura3基因的质粒pura中，构建并提取阳性转化子质粒；
[0012]
s3、将步骤s2所提取的阳性转化子质粒转化至步骤s1所述尿嘧啶(uracil)营养缺陷型菌株s.boulardi/ura3-/-制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得表达红霉素降解酶erea工程益生菌。
[0013]
在我们的前期实验过程中，发现显示抗性质粒转入酵母中，即使使用抗生素去施加外加压力，但在培养后期随着培养过程中菌体密度增大，以抗生素作为标记的质粒依然会出现容易丢失的情况，这严重影响了阳性转化子的筛选效率。因此，我们选用尿嘧啶(uracil)作为筛选标记，敲除原菌ura3基因，将含ura3基因的质粒转入菌株，这样只要出现丢失质粒的菌都因无法合成尿嘧啶而死亡，存活的菌株均为含有质粒的菌株，提高了活菌中的质粒携带率，可提高表达水平。
[0014]
本发明为了最大程度提高红霉素降解酶erea的表达量，使用了优化过后的密码子序列进行表达，所述operea基因是经序列优化后的erea，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
[0015]
优选地，为了稳定地表达降解酶，步骤s1所述尿嘧啶(uracil)营养缺陷型s.boulardi菌株的构建方法为：通过构建选自g418抗性(kan)和zeocin抗性(ble)抗性基因的同源臂，将其逐一插入替换到s.boulardi染色体上ura3的等位基因上，再利用loxp/cre重组酶系统，去除抗性基因得到。
[0016]
本发明对步骤s1所述尿嘧啶(uracil)营养缺陷型菌株s.boulardi/ura3-/-构建是否成功进行验证，利用ypd培养基、sd/-ura培养基、5-foa培养基上37℃培养2d验证ura3基因缺失表型；利用g418 ypd培养基、含zeocin ypd培养基、含g418和zeocin培养基上37℃培养2d验证kan、ble基因插入及删除的表型。
[0017]
本发明中s.boulardii/ura3-/-由于ura3基因的缺失不能在缺少uracil的营养缺陷型培养基(sd/-ura培养基)上生长，但是可以在添加了uracil和5-foa的培养基上(5-foa培养基)生长，证明了菌株ura3基因被敲除。s.boulardii/ura3-/-由于缺乏抗性不能在各药板上生长。从基因型和表型两方面验证均证明成功构建尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株s.boulardi/ura3-/-。
[0018]
本发明分别构建了质粒和染色体介导的工程益生菌酵母，比较了红霉素降解酶的表达水平，筛选得到以质粒介导的工程益生菌酵母具有红霉素降解酶erea的高水平表达。
[0019]
本发明的第三个目的在于提供了所述的工程益生菌s.boulardii在表达红霉素降
解酶erea中的应用。
[0020]
本发明的第四个目的在于提供了上述工程益生菌s.boulardi在降解红霉素残留中的应用。
[0021]
优选地，上述工程益生菌s.boulardi可应用于体内肠道原位降解红霉素残留。
[0022]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023]
本发明首次将优化后的erea基因转入到益生菌s.boulardi中，经过比对染色体和质粒介导的工程酵母表达水平筛选得到高水平表达的工程益生菌酵母。通过体外微生物降解实验和体内动物实验可见，构建后的工程酵母s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea具有生物功能，对体内和体外的红霉素均具有高效的降解作用，且工程菌由于是益生菌不会在体内定植，避免破坏肠道原有菌群。另外，s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea的口服使用不会影响红霉素在组织和血浆中的分布，因此对全身治疗作用无影响；同时可避开以往基因工程菌的缺陷，杜绝了临床重要耐药基因erea的外泄风险。
附图说明
[0024]
图1是尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株s.boulardi/ura3-/-的构建示意图。
[0025]
图2是loxp-kan/ble-loxp插入片段的pcr产物凝胶电泳图：m为2000dna marke；1为loxp-kan-loxp插入片段；2为loxp-ble-loxp插入片段；3为阴性对照。
[0026]
图3是s.boulardii wt、s.boulardii#1、s.boulardii#2转化子基因型验证凝胶电泳图：m为2000dna marker；a为s.boulardii/ura3n-f、
△
ura3-r引物对；b为s.boulardii/ura3n-f、
△
kan-r引物对；c为s.boulardii/ura3n-f、
△
ble-r引物对。
[0027]
图4是s.boulardi/ura3-/-转化子基因型验证凝胶电泳图：m为2000dna marker；a为s.boulardii/ura3n-f、
△
ura3-r引物对；b为s.boulardii/ura3n-f、
△
kan-r引物对；c为s.boulardii/ura3n-f、
△
ble-r引物对。
[0028]
图5是s.boulardi/ura3-/-转化子中ppl5071_tef1-cre_ura3质粒的丢失情况：m为2000dna marker；1为连续传代前的s.boulardi/ura3-/-；2为连续传代后的s.boulardi/ura3-/-。
[0029]
图6是s.boulardii wt、s.boulardii#1、s.boulardii#2、s.boulardi/ura3-/-表型验证。
[0030]
图7是质粒和染色体介导表达erea的菌株蛋白免疫印记结果：s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea为质粒介导的菌株，s.boulardii/ura3-/-‑
pzeura-operea为染色体介导表达的菌株。
[0031]
图8是s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea在体外不同介质中对红霉素的降解效果评估。
[0032]
图9是s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea在小鼠体内中对红霉素的降解效果评估。
[0033]
图10是s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea的灌胃对血浆和各组织红霉素浓度分布的影响。
[0034]
图11是s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea的结合转移结果。
dmso，42℃水浴锅热击20min，每10min颠倒混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清。用1ml ypd liquidmedium重新悬浮菌体沉淀，30℃摇床180rpm震荡培养1h。12000rpm离心15s，弃上清。加入1ml无菌去离子水重悬沉淀，吸取100μl转化液涂布到含0.2mg/ml g418的ypd培养基，30℃培养3天。使用引物s.boulardii/ura3n-f、
△
ura3-r、
△
kan-r、
△
ble-r对转化子进行基因筛选。以野生型(s.boulardi wt)和转化子(s.boulardi#1)单菌落为模板，进行三对引物扩增，反应体系和条件如下：
[0054]
s.boulardii/ura3n-f(5
’‑3’
)：aggaagaacgaaggaaggagcac
[0055]
△
ura3-r(5
’‑3’
)：aatctttgtcgctcttcgcaatg
[0056]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水21μl，2
×
mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl。
[0057]
pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
[0058]
s.boulardii/ura3n-f(5
’‑3’
)：aggaagaacgaaggaaggagcac
[0059]
△
kan-r(5
’‑3’
)：acgcgatcgctgttaaaaggac
[0060]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水21μl，2
×
mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl。
[0061]
pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
[0062]
s.boulardii/ura3n-f(5
’‑3’
)：aggaagaacgaaggaaggagcac
[0063]
△
ble-r(5
’‑3’
)：agctgaaccaactcgcgaggggatc
[0064]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水21μl，2
×
mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl。
[0065]
pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
[0066]
pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，野生型只能扩增出666bp的条带，s.boulardi#1转化子分别扩增出666bp、1023bp的条带(见图3)，证明loxp-kan-loxp成功插入到染色体上ura3其中一个等位基因区域。
[0067]
挑取上述s.boulardi#1转化子制备成感受态细胞并以相同方法将loxp-ble-loxp转化至制备好的感受态中，以含0.2mg/ml g418、0.05mg/ml zeocin的ypd培养基进行筛选，对双药板上的s.boulardi#2转化子行基因筛查。
[0068]
pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，s.boulardi#2转化子分别扩增出782bp、1023bp的条带，而扩增不到666bp的条带(见图3)，证明loxp-ble-loxp成功插入到染色体上ura3另一个等位基因区域。
[0069]
(3)loxp-kan/ble-loxp插入片段的消除
[0070]
将s.boulardii#2转化子制备成感受态后，以同样方法将质粒ppl5071_tef1-cre_ura3转化至感受态细胞内，引入cre酶达到对kan/ble抗性去除的目的。化转液在sd/-ura培养基上进行筛选得到转化子s.boulardii/ura3-/-。
[0071]
挑取转化子s.boulardii/ura3-/-接种到4ml空白ypd液体培养基30℃，180rpm培养12h，吸取100μl培养液至新的4ml空白ypd液体培养基中，重复上述操作1次。将连续培养后的培养物稀释涂布到空白ypd平板上，30℃恒温培养3d后，挑取单克隆菌株验证ppl5071_tef1-cre_ura3是否丢失。反应体系和条件如下：
[0072]
crey-f(5
’‑3’
)：taacgccagggttttcccagtcac
[0073]
crey-r(5
’‑3’
)：tcgacgacctcccattgatatttg
[0074]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水21μl，2
×
mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl。
[0075]
pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
[0076]
同时使用前述验证转化子的三对引物对双抗性基因(kan、ble)和ura3缺失情况进行确认。
[0077]
pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，四对特异性引物均未扩增出条带，(见图4、图5)表明在s.boulardii/ura3-/-转化子中，工程质粒ppl5071_tef1-cre_ura3在表达cre重组酶将kan、ble基因删除后经连续传代成功丢失。
[0078]
(4)基因敲除菌株表型验证
[0079]
分别挑取单菌落s.boulardii wt、s.boulardii#1、s.boulardii#2、s.boulardii/ura3-/-接种至4ml空白ypd液体培养基，37℃，180rpm过夜培养。吸取1ml过夜培养物5000rpm离心5min后弃上清，菌体沉用1ml 0.01mol/l pbs重悬，5000rpm离心5min，弃上清。使用0.01mol/l pbs调节od600至0.5左右后，吸取100μl混悬液加入到900μl 0.01mol/l pbs中涡旋混匀，依次倍比稀释至10-5
。
[0080]
分别吸取5μl稀释液(10-2
、10-3
、10-4
、10-5
)滴板至ypd培养基、sd/-ura培养基、5-foa培养基上37℃培养2d验证ura3基因缺失表型，同时分别吸取5μl稀释液(10-2
、10-3
、10-4
、10-5
)滴板至含0.2mg/ml g418 ypd培养基、含0.05mg/ml zeocin ypd培养基、含0.2mg/ml g418和0.05mg/ml zeocin培养基上37℃培养2d验证kan、ble基因插入及删除的表型。
[0081]
经验证，所有菌株表型均符合预期(见图6)，s.boulardiiwt、s.boulardii#1、s.boulardii#2、s.boulardii/ura3-/-中的s.boulardii#2、s.boulardii/ura3-/-由于ura3基因的缺失不能在缺少uracil的营养缺陷型培养基(sd/-ura培养基)上生长，但是可以在添加了uracil和5-foa的培养基上(5-foa培养基)生长，证明了菌株ura3基因被敲除。而含有ura3基因的s.boulardii wt、s.boulardii#1由于ura3基因能将培养基中的5-foa成分转化成有毒物质，因而不能在5-foa培养基上生长。另外，s.boulardi wt和s.boulardii/ura3-/-由于缺乏抗性不能在各药板上生长，而s.boulardii#1具有kan基因故能在0.2mg/ml g418单药板上生长，但无法在含有0.05mg/ml zeocin的药板上生长。s.boulardii#2因具有kan和ble基因而获得双抗性能在0.2mg/ml g418和0.05mg/ml zeocin双药板上生长。综上，从基因型和表型两方面验证均证明成功构建尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株s.boulardi/ura3-/-。
[0082]
实施例2高水平表达erea的工程菌株筛选
[0083]
(1)染色体介导的工程菌构建
[0084]
以质粒ppic3.5k-operea(将优化后的operea通过同源重组插入到ppic3.5k的ecor i位点，本领域技术人员通过常规方法可构建)为模板通过pcr扩增优化后的外源基因operea(根据真核生物和原核生物在蛋白质的翻译过程中对密码子的偏好性，为了提高erea在尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株s.boulardi/ura3-/-的表达水平，首先对其原序列进行优化，为方便后续研究，在终止密码子前添加6xhis标签序列，得到优化后的operea核苷酸序列如seq id no.1所示)，反应体系和条件如下：
[0085]
operea-inff(5
’‑3’
)：
[0086]
atctaagttttaattacaaggatccatgacctggagaactactagaac
[0087]
operea-infr(5
’‑3’
)：
[0088]
ctatagtgagtcgtattacggatccttagtggtgatgatggtgatgc
[0089]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水10μl，2
×
kod buffer 25μl，dntps 10μl，上游引物1.5μl，下游引物1.5μl，kod酶1μl，模板1μl。
[0090]
pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸30s，共35个循环；68℃终延伸7min；4℃保存，回收pcr产物。
[0091]
提取质粒pzeura(通过市售渠道购买，购买网址https://www.rjmart.cn/#/detail？productid＝200239318436&suppid＝67716&source＝2),利用bamhi限制性内切酶对pzeura进行单酶切，回收酶切产物。
[0092]
吸取上述两种回收产物，按物质的量3:1混匀，在t4连接酶的作用下，16℃孵育过夜。
[0093]
吸取10μl连接产物加入到dh5α感受态中，冰浴30min，42℃热激60s，热激结束后立即冰浴3min。随后加入900μl lb肉汤置于37℃，180rpm复苏1h。
[0094]
5000rpm离心5min，弃掉800μl上清液，用剩余的肉汤重悬菌体沉淀并吸取全部涂布至含amp100的lb药板，37℃培养24h后挑取阳性转化子。提取阳性转化子质粒并使用下述引物进行表达盒的扩增：
[0095]
反应体系和条件如下：
[0096]
rdna-up-f(5
’‑3’
)：ccggaacctctaatcattcg
[0097]
rdna-down-r(5
’‑3’
)：aacgaacgagaccttaacct
[0098]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水10μl，2
×
kod buffer 25μl，dntps 10μl，上游引物1.5μl，下游引物1.5μl，kod酶1μl，模板1μl。
[0099]
pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸3min，共35个循环；68℃终延伸7min；4℃保存，回收pcr产物。
[0100]
将回收的产物按实施例1的方法化转至s.boulardi/ura3-/-中，阳性转化子在sd/-ura培养基上筛选获得s.boulardii/ura3-/-‑
pzeura-operea。
[0101]
(2)质粒介导的工程菌构建
[0102]
以质粒ppic3.5k-operea为模板通过pcr扩增优化后的外源基因operea。反应体系和条件如下：
[0103]
operea-inff(5
’‑3’
)：
[0104]
atctaagttttaattacaaggatccatgacctggagaactactagaac
[0105]
operea-infr(5
’‑3’
)：
[0106]
gcggatcttagctagccgcggtacccttagtggtgatgatggtgatgc
[0107]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水10μl，2
×
kod buffer 25μl，dntps 10μl，上游引物1.5μl，下游引物1.5μl，kod酶1μl，模板1μl。
[0108]
pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸30s，共35个循环；68℃终延伸7min；4℃保存，回收pcr产物。
[0109]
以质粒pura(通过市售购买，购买网址：https://www.rjmart.cn/#/detail？productid＝200239318434&suppid＝67716&source＝2)为模板通过pcr扩增表达质粒的骨
架区域。反应体系和条件如下：
[0110]
tef1-inff1(5
’‑3’
)：ggtaccgcggctagctaagat
[0111]
tef1-infr1(5
’‑3’
)：ggatccttgtaattaaaacttagattagattgc
[0112]
pcr扩增的体系(50μl)为：双纯水10μl，2
×
kod buffer 25μl，dntps 10μl，上游引物1.5μl，下游引物1.5μl，kod酶1μl，模板1μl。
[0113]
pcr扩增的反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸3min，共35个循环；68℃终延伸7min；4℃保存，回收pcr产物。
[0114]
吸取上述两种回收产物，按物质的量3：1混匀，在同源重组酶的作用下，50℃孵育30min。吸取10μl重组产物加入到dh5α感受态中，冰浴30min，42℃热激60s，热激结束后立即冰浴3min。随后加入900μl lb肉汤置于37℃，180rpm复苏1h。5000rpm离心5min，弃掉800μl上清液，用剩余的肉汤重悬菌体沉淀并吸取全部涂布至含amp100的lb药板，37℃培养24h后挑取阳性转化子。提取阳性转化子质粒，按实施例1的方法化转至s.boulardi/ura3-/-中，阳性转化子在sd/-ura培养基上筛选获得s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea。
[0115]
(3)高表达菌株筛选
[0116]
将上述获得染色体和质粒介导的erea表达酵母分别接种至200ml sd/-ura培养基中，30℃220rpm连续培养72h。吸取2ml培养液15000rpm离心5min，弃上清，超纯水洗涤一遍菌体，随后调整od600至0.5。分别吸取上述调整后的菌液1ml，15000rpm离心5min弃上清。加入500μl 0.3m naoh混匀后静置孵育5min，15000rpm离心5min弃上清。加入500μl超纯水，涡旋混匀，15000rpm离心5min弃上清。加入300μl裂解液，混匀后沸水煮沸10min，15000rpm离心5min吸取200μl，上清即为提取的胞内蛋白。使用鼠源his一抗和hrp标记的羊抗鼠二抗对提取的蛋白进行蛋白免疫印迹反应。经化学发光成像后使用imagej对灰度值进行半定量。实验结果表明相同的菌量前提下质粒介导的erea表达量远远高于染色体(图7)，质粒为瞬时表达，虽然在基因稳定性上较染色体介导的差，但在表达水平上瞬时表达高于染色体介导的稳定表达。
[0117]
实施例3s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株体外降解效果验证
[0118]
接种s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株至200ml sd/-ura培养基中，30℃220rpm连续培养72h。5000rpm离心5min，弃上清，菌体重悬于40ml pbs中洗涤一次。5000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀加入适量pbs重悬后分装至2ml离心管中。将离心管5000rpm离心5min，将菌体沉淀分别加入5ml pbs，5ml含粪便的pbs悬液和5ml含盲肠内容物的pbs悬液中，试管均含有4μg/ml红霉素，以仅含红霉素药物作为空白组，含空载质粒的菌为对照组。将上述混悬液至于37℃孵育12h后，12000rpm离心5min，吸取20μl上清滴加至涂布有atcc795的mh琼脂板上，60℃正置培养5h后测量抑菌圈直径，直径大小与药物降解效果成反比。结果表明仅含有s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株的组出现抑菌圈缩小的现象(图8)，证实s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株在体外可以实现不同介质中红霉素的降解。
[0119]
实施例4s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株体内降解效果验证
[0120]
将24只6周龄雌性km小鼠随机分成4笼，每笼6只，分别编号abcd组。
[0121]
a组饲喂不含红霉素的纯水，bcd组饲喂含25mg/l红霉素的纯水。各组小鼠均自由饮水和采食，c组小鼠0天起每天灌胃108cfu的空载菌，d组小鼠0天起每天灌胃108cfu的
s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌。第6天采集小鼠粪便用lc-ms/ms检测粪便中的红霉素残留情况。实验结果如图9，饮用纯水的小鼠粪便中未检测到红霉素残留，仅饮用含红霉素纯水的小鼠及自由饮用含红霉素纯水同时灌胃空载菌的小鼠粪便中检测到高水平红霉素残留且无显著差异。而自由饮用含红霉素纯水同时灌胃s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌的小鼠粪便检测到较低水平的红霉素残留，与只饮用红霉素纯水的小鼠相比有显著差异。结果证实了s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌株在体内可以实现肠道红霉素的原位降解，红霉素降解率为1563.7μg/kg粪便，远高于以往报道。
[0122]
为了更好了解s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea的服用是否会影响红霉素在血浆及各组织中的浓度分布。将18只6周龄雌性km小鼠随机分成3笼，每笼6只，分别编号efg组。e组灌胃不含红霉素的纯水，fg组按50mg/kg的剂量灌胃红霉素溶液，每天灌胃1次连续灌胃3天。其中d组在灌胃红霉素后再灌胃108cfu的s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌，在第三天灌胃结束后的1h将各组小鼠处死，采集血浆，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏。所有样本使用乙腈提取红霉素，提取液过0.22μl滤膜后注入lc-ms/ms进行红霉素含量测定。实验结果显示s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea菌的使用对血浆及所有组织中的红霉素浓度分布均无显著差异(图10)，表明s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea的口服不影响红霉素在体内的分布，因此对红霉素的全身治疗作用无影响。
[0123]
实施例5工程酵母生物安全评估
[0124]
以含有pgen：：bler的标准菌株atcc700603、atcc14028、atcc25922为受体菌，以工程酵母s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea为供体菌进行下述实验，首先分别培养上述菌，随后按受体菌：供体菌＝3：1的比例进行混合，混合物滴至lb培养基中的0.22μm上，37℃培养18h。随后刮取菌体至pbs中混匀，倍比稀释至10-6
，吸取各稀释液100μl涂布至含有8μg/ml红霉素以及200μg/ml博来霉素的lb琼脂上进行筛选。
[0125]
实验结果表明，工程酵母s.boulardii/ura3-/-‑
pura-operea因为物种隔离无法将耐药基因传代至标准菌株，该降解策略相对更安全(图11)。
[0126]
显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种表达红霉素降解酶erea的工程益生菌s.boulardii的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、构建尿嘧啶营养缺陷型菌株s.boulardi/ura3-/-；s2、质粒的构建：将携带operea基因插入到含ura3基因的质粒pura中，构建并提取阳性转化子质粒；s3、将步骤s2所提取阳性转化子质粒转化至步骤s1所述尿嘧啶营养缺陷型菌株s.boulardi/ura3-/-制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得表达红霉素降解酶erea工程益生菌；所述operea基因是经序列优化后的erea，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1所述尿嘧啶营养缺陷型s.boulardi菌株的构建具体步骤为，通过构建选自g418抗性kan和zeocin抗性ble抗性基因的同源臂，将其逐一插入替换到s.boulardi染色体上ura3的等位基因上，再利用loxp/cre重组酶系统，去除抗性基因得到。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2所述质粒构建的具体步骤为：以ppic3.5k-operea为模板通过pcr扩增优化后的基因operea，以质粒pura为模板通过pcr扩增表达质粒的骨架区域，两种pcr产物进行同源重组，重组产物加入到dh5α感受态，提取阳性转化子质粒。4.一种表达红霉素降解酶erea的工程益生菌s.boulardii，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述方法构建得到的。5.权利要求4所述的工程益生菌s.boulardii在表达红霉素降解酶erea中的应用。6.权利要求4所述的工程益生菌s.boulardii在降解红霉素残留中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为在体内肠道原位降解红霉素残留。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用。本发明首先构建尿嘧啶营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3-/-，将携带优化的opereA基因插入到含URA3基因的质粒pURA中，提取阳性转化子质粒转至S.boulardi/URA3-/-感受态，经过比对染色体和质粒介导的工程酵母表达水平筛选得到高水平表达的工程益生菌酵母。该工程酵母可高效表达红霉素降解酶EreA，具有生物功能，对体内和体外的红霉素均具有高效的降解作用。该工程酵母的使用不会影响红霉素在组织和血浆中的分布，对全身治疗作用无影响，且杜绝了临床重要耐药基因ereA的外泄。了临床重要耐药基因ereA的外泄。了临床重要耐药基因ereA的外泄。


技术研发人员：孙坚 贺骞 林卓宇 张晓净 廖晓萍 刘雅红
受保护的技术使用者：岭南现代农业科学与技术广东省实验室
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/26