sNINJ1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用

sninj1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤检测技术领域，特别是涉及sninj1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用。


背景技术：

2.目前临床常用的肝癌诊断方法包括病理学检查、影像学检查及血清学标志物检查。病理学检查是诊断肝癌的金标准，但创伤大，不利于广泛应用。腹部超声由于灵活、无创和操作简便，被很多国内外指南推荐作为肝癌的筛查手段，但超声检查在早期肝癌诊断中往往受患者皮下脂肪厚薄度以及操作者的经验、手法和细致程度等主观因素的影响。对于超声联合甲胎蛋白(afp)筛查阳性的患者，后续可使用动态增强ct和多模态mri扫描以明确诊断。然而，ct和mri均存在耗时长、检查费用高等缺点，此外，ct还存在造影剂肾毒性和放射线损害。还有技术公开了一种肝癌的诊断方法，其发现ninj1蛋白在肝癌中高表达，与肝癌的发生和转移有关，基于此提出了ninj1基因用于肝癌的诊断，及ninj1激动剂用于肝癌治疗的主张。但是该技术检测靶标物质为基因序列，且检测的是全长ninj1基因。由于蛋白水平受到基因转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平多个层次的调控，组织中基因水平的高表达并不必然导致蛋白成分的增加。因此，通过检测肝脏组织中ninj1基因来诊断肝癌缺乏一定的精准性。同时，该技术是从肝脏组织中检测靶标物质的存在，由于血液中成分受到细胞释放及稳定性影响，组织内容物的水平与血液中的水平不存在必然联系，且相较于血液样品，肝脏组织的取样操作难度更高，检测成本也更高。
3.相较于上述技术手段，血清肿瘤标志物的检测是肿瘤诊断更为常用得方法之一，对于恶性肿瘤的诊断、疗效的观察、病情进展的判断和复发的监测等皆有一定的临床应用价值，并具有简便无创、测定结果定量客观、可重复测定以便动态监测、费用相对低廉等优点。目前临床主要有甲胎蛋白(afp)，甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原、铁蛋白等血清学标志物用于肝癌的诊断和疗效评估。
4.虽然肝癌的血清学诊断发展已较为成熟，但目前临床应用的生物标志物仍具有一定局限性，存在一定的假阳性与假阴性率，无法满足精准诊疗的需求，例如afp作为诊断肝癌的经典标志物，还易受活动性肝病、妊娠、及生殖腺胚胎源性肿瘤和消化道肿瘤的影响，对于早期诊断肝癌具有一定局限性。基于此，若开发一种新的灵敏度高、特异性好、适用于肝癌早期诊断、更适于临床推广与应用的血清标志物，将更有助于提高我国肝癌的诊疗水平。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供sninj1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用，为肝癌诊断、预后与疗效评估提供了一种新的更可靠的技术手段。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供sninj1作为血清标志物在制备用于肝癌诊断、预后与疗效评估的试剂盒中的应用。
7.进一步，sninj1的表达水平与肝癌的严重程度正相关。
8.进一步，sninj1蛋白的表达水平与肝癌的严重程度正相关。
9.进一步，所述试剂盒以血清/血液为检测样品。
10.本发明发现sninj1在肝癌患者血清中存在明显的高表达，可通过检测其在血清的含量，为肝癌的诊断、预后与疗效评估提供新的更可靠的依据。其中，sninj1的多肽序列为：
11.mdsgteeyelngglppgtpgspdasparwgwrhgpinvnhyaskksaaesmldial。
12.进一步，所述试剂盒通过elisa方法测定sninj1的表达水平。
13.进一步，所述试剂盒还包括质谱鉴定试剂，和/或，抗体或其抗原结合片段；所述质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段与sninj检测，和/或，与肝癌诊断、预后与疗效评估相关联。
14.本发明还提供sninj1作为血清标志物联合其他肝癌生物标志物在制备用于肝癌诊断、预后与疗效评估的试剂盒中的应用。
15.进一步，所述其他肝癌生物标志物选自afp、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原、铁蛋白中的至少一种。
16.本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒用于肝癌诊断、预后与疗效评估，所述试剂盒包括用于检测血清标志物sninj1的试剂。
17.进一步，所述试剂盒包括用于检测血清标志物sninj1蛋白的试剂。
18.进一步，所述试剂盒还包括用于检测其他肝癌生物标志物的试剂。
19.本发明还提供sninj1在制备和/或筛选肝癌靶向药物中的应用，所述肝癌靶向药物以sninj1及其相关通路为靶点。
20.进一步，所述肝癌靶向药物以sninj1蛋白及其相关通路为靶点。
21.本发明还提供一种肝癌靶向药物，所述肝癌靶向药物以sninj1及其相关通路为靶点。
22.如上所述，本发明的sninj1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用，具有以下有益效果：
23.本发明为肝癌的诊疗提供了一种新的血清标志物sninj1，可以作为肝癌诊断试剂的检测目标分子，应用于肝癌患者的早期诊断、疗效观察及预后评估中，且相较于现有技术更适于临床推广与应用，有望提高我国肝癌的诊疗水平。同时，本发明还提出可以sninj1及其相关通路为靶点研发一种新的肝癌靶向药物，为肝癌的治疗提供新的思路。
附图说明
24.图1显示为本技术实施例中不同疾病与正常对照者血清中sninj1的含量的表达差异示意图；
25.图2显示为本技术实施例中在肝癌患者血清中sninj1与afp、异常凝血酶原(pivkaii)、ldh、5’nt及vegf等的相关性分析示意图；
26.图3显示为本技术实施例中肝癌患者治疗前后血清中sninj1表达差异示意图；
27.图4显示为本技术实施例中肿瘤体积大的患者和肿瘤体积小的患者血清中sninj1
表达差异示意图；
28.图5显示为本技术实施例中发生转移的肝癌患者和未发生转移的肝癌患者血清中sninj1表达差异示意图；
29.图6显示为本技术实施例中不同cnlc分期的肝癌患者血清中sninj1表达差异示意图；
30.图7显示为本技术实施例中血清sninj1和afp对肝癌患者单独诊断及联合诊断的roc曲线图；
31.图8显示为本技术实施例中通过gepia数据库分析的ninj1在肝癌和正常组织中的表达示意图。
32.图9显示为本技术实施例中通过gepia数据库分析的肝癌总体生存率在ninj1高表达组与低表达组中的差异示意图。
具体实施方式
33.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
34.为克服上述现有技术存在的不足，本发明提供了一种更有利于肝癌诊断、预后与疗效评估的血清标志物-可溶性神经损伤诱导蛋白1(sninj1)。
35.神经损伤诱导蛋白1(ninj1)是一种广泛表达的新型粘附分子，除了在受损的周围神经系统中表达外，还存在于身体的各种组织中，包括胚胎和成人的上皮组织，如肝脏、肾脏、胸腺、淋巴、白细胞、血管内皮细胞表面，在组织发生及神经修复过程中起重要作用，ninj1蛋白有两个疏水跨膜结构域和一个细胞外nh2末端(ent)结构域；其胞外nh2端区域可被基质金属蛋白酶9(mmp9)切割而释放入血液循环中，形成可溶性ninj1(sninj1)。sninj1在体外可通过同源性结合介导细胞与细胞之间的粘附。
36.本发明通过分析发现，非肝癌患者血清样本中sninj1含量低，但在肝癌患者血清中sninj1含量显著升高，因此，检测血清样本中的sninj1含量水平可以用于肝癌的诊断、预后与疗效评估。
37.进一步地，本发明利用sninj1在肝癌患者血清中高表达的特点，后续根据sninj1具体表达水平，探究了sninj1与患者肝癌分期、是否转移、预后生存之间的关系，通过结合具体临床资料、随访、建立数学模型等方法，构建基于sninj1的肝癌预后模型，为肝癌患者治疗、预后评估提供新的方向。
38.需要注意的是，本发明检测的靶标物质为sninj1蛋白，其多肽序列为：
39.mdsgteeyelngglppgtpgspdasparwgwrhgpinvnhyaskksaaesmldial。
40.现有技术中虽然公开了ninj1基因在肝癌组织中高表达，但需要注意的是，sninj1为ninj1的可溶性形式，是ninj1被细胞内酶切之后产生的截短型物质，可以释放至血液中，而ninj1本身并不释放至血液。因此，对于血液中sninj1蛋白的检测与组织中ninj1基因的检测具有本质的差异。
41.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对
本发明作进一步说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.实施例1
44.一、检测方法
45.本实施例通过elisa检测肝癌患者和正常健康者血清中sninj1的含量。
46.1、本实施例的临床样本是外周血(102例初诊的原发性肝癌患者，41例初诊的肺癌患者，40例初诊的结直肠癌患者，33例系统性红斑狼疮患者，28例类风湿性关节炎患者及67例健康体检者)，应在临床上进行相关样本的收集，其中外周血样本的收集程序如下：
47.研究对象空腹静脉血2.5-3.5ml于促凝管中，室温垂直静置25-35min后，常温下2500-3500r/min离心5min，吸取上层液体至标记好的ep管中，-80℃保存备用。
48.2、elisa检测步骤
49.从室温平衡10分钟后的elisa试剂盒中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；分别将样品或不同浓度标准品按照100ul每孔加入相应孔中，空白孔加入100ul通用稀释液，盖上封板膜后37℃温育1小时；取出酶标板，弃去液体，不用洗涤，每孔直接加入生物素化抗体工作液100ul，盖上封板膜后37℃温育1小时；弃去液体，每孔加入300ul 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次；每孔加入酶结合物工作液100ul，盖上封板膜后37℃温育30分钟；弃去液体按步骤4洗涤方法，洗板5次；每孔加入底物(tmb)90ul，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟；取出酶标板，每孔直接加入终止液50ul，立即在450nm波长处测定各孔的od值，根据标准曲线计算各组血清中sninj1的浓度。
50.3、血清sninj1检测结果的统计学分析
51.不同疾病患者与正常健康者血清sninj1含量比较，sninj1与临床相关指标进行相关性分析，并绘制sninj1的roc曲线图，将不同肿瘤面积的肝癌患者血清sninj1进行比较分析。
52.4、数据库的生物信息学分析
53.采用gepia数据库分析肝癌组织样本与正常组织样本中ninj1的表达情况，并分析ninj1高表达组与低表达组与肝癌总体生存率的关系。
54.二、实验结果与分析
55.由上述检测和数据分析方法得到实验结果如图1～9所示。基于图1～9，可以得出结论：
56.1、图1显示为不同疾病与正常对照者血清中sninj1的含量的表达差异示意图。由图1可知，血清sninj1在肝癌患者中的表达水平显著高于健康对照者；血清sninj1在肝癌(hcc)患者中处于高表达状态，其表达水平比肺癌(lca)患者、结直肠癌(crca)患者、系统性红斑狼疮(sle)患者、类风湿性关节炎(ra)患者均高。
57.2、图2显示为在肝癌患者血清中sninj1与afp、异常凝血酶原(pivkaii)、ldh、5’nt及vegf等的相关性分析示意图。由图2可知，肝癌患者血清sninj1水平与甲胎蛋白、异常凝血酶原(pivkaii)、ldh、5’nt及vegf等具有显著相关性。
58.3、图3显示为肝癌患者治疗前后血清中sninj1表达差异示意图。由图3可知，肝癌患者tace术后(左图)及肝部分切除术后血清sninj1水平较术前明显降低。
59.4、图4显示为肿瘤体积大的患者和肿瘤体积小的患者血清中sninj1表达差异示意图。由图4可知，肿瘤面积大的肝癌患者血清sninj1水平显著高于肿瘤面积小的肝癌患者。
60.5、图5显示为发生转移的肝癌患者和未发生转移的肝癌患者血清中sninj1表达差异示意图。由图5可知，发生转移的肝癌患者血清sninj1水平显著高于未发生转移的肝癌患者。
61.6、图6显示为不同cnlc分期的肝癌患者血清中sninj1表达差异示意图。由图6可知，cnlc分期为ⅲ期和iv期的肝癌患者血清sninj1水平显著高于cnlc分期为i期和ii期的肝癌患者。
62.7、图7显示为血清sninj1和afp对肝癌患者单独诊断及联合诊断的roc曲线图。由图7可知，血清sninj1对肝癌有较强的诊断效能，与afp联合能进一步增强肝癌的诊断。
63.8、图8显示为通过gepia数据库分析的ninj1在肝癌和正常组织中的表达示意图，图9显示为通过gepia数据库分析的肝癌总体生存率在ninj1高表达组与低表达组中的差异示意图。由图8和图9可知，血清sninj1表达水平越高，肝癌患者的总体生存率越低。
64.因此，血清sninj1作为诊断肝癌、肝癌预后与疗效评估的新标志物，具有灵敏度和特异性；同时，血清sninj1与现有生物标志物联合检测，能进一步提高肝癌诊断的灵敏度和特异度，并且可以评估肝癌患者的治疗效果及临床预后。进一步地，针对sninj1靶点及相关通路，或许也可以成为肝癌靶向药物的制备提供新的思路。
65.综上所述，本发明提供了一种新的肝癌肿瘤血清标志物——sninj1，能够实现更加简便准确快速地诊断肝癌，以及肝癌患者的预后及治疗效果评估，将其在临床上推广应用，有望我国肝癌的诊疗水平。
66.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.sninj1作为血清标志物在制备用于肝癌诊断、预后与疗效评估的试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：sninj1的表达水平与肝癌的严重程度正相关。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：sninj1蛋白的表达水平与肝癌的严重程度正相关。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒以血清/血液为检测样品；和/或，所述试剂盒通过elisa方法测定sninj1的表达水平。和/或，所述试剂盒还包括质谱鉴定试剂，和/或，抗体或其抗原结合片段；所述质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段与sninj检测，和/或，与肝癌诊断、预后与疗效评估相关联。5.sninj1作为血清标志物联合其他肝癌生物标志物在制备用于肝癌诊断、预后与疗效评估的试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述其他肝癌生物标志物选自afp、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原、铁蛋白中的至少一种。7.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于肝癌诊断、预后与疗效评估，所述试剂盒包括用于检测血清标志物sninj1的试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测其他肝癌生物标志物的试剂。9.sninj1在制备和/或筛选肝癌靶向药物中的应用，所述肝癌靶向药物以sninj1及其相关通路为靶点。10.一种肝癌靶向药物，其特征在于：所述肝癌靶向药物以sninj1及其相关通路为靶点。

技术总结
本发明属于肿瘤检测技术领域，具体公开了sNINJ1作为血清标志物在肝癌诊断、预后与疗效评估、治疗中的应用。本发明发现sNINJ1在肝癌患者血清中存在明显的高表达，基于此提出了sNINJ1作为血清标志物在制备用于肝癌诊断、预后与疗效评估的试剂盒中的应用。本发明为肝癌的诊断、预后与疗效评估提供新的灵敏度和特异性高的生物标志物，更适于临床推广与应用。同时，本发明还提出可以以sNINJ1及其相关通路为靶点研发一种新的肝癌靶向药物，为肝癌的治疗提供新的思路。提供新的思路。提供新的思路。


技术研发人员：陈维贤 燕玲 胡琴 王黎
受保护的技术使用者：重庆医科大学附属第二医院
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/26