柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途

1.本发明属于微生物防控制剂领域，具体涉及柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途。


背景技术：

2.溶藻弧菌是常见的水产养殖病原菌，可感染多种海洋生物，具有高传播性、高致病性及高度耐药性等特点。近年来，海水养殖业遭受了由溶藻弧菌引起的重大经济损失。因此，研究溶藻弧菌的致病机制尤为重要，其中生物被膜是溶藻弧菌体内一种重要的毒力因子。现如今，抗生素是防治溶藻弧菌的主要手段，但抗生素滥用造成了严重的环境污染及耐药菌株的出现，因此急需要一种新型无毒无害的天然抑制剂。


技术实现要素：

3.生物被膜是溶藻弧菌重要的毒力因子。本发明的目的在于提供一种柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途。
4.本发明是通过以下技术方案来实现：本发明公开了柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途。
5.优选地，所述的溶藻弧菌为溶藻弧菌epgs，菌种保藏号为 cctcc no. ab209306。
6.优选地，所述抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，以达成削弱溶藻弧菌致毒能力的功效。
7.优选地，由柠檬酸与无菌水配置成500 mg/ml的储备液，于4℃保存备用。
8.优选地，柠檬酸在浓度为1/4 mic~1/2 mic（mic= 1.2mg/ml）范围内，对溶藻弧菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用。
9.与现有抑制剂相比，本发明具有以下有益的抑制效果：本发明为柠檬酸开辟了新的用途，将其用于抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，为抑制溶藻弧菌生物被膜形成提供了新的候选抑制剂，在临床溶藻弧菌耐药性日趋普遍及耐药程度日趋严重的情况下，使抗溶藻弧菌抑制剂恢复对耐药溶藻弧菌的作用，从而为海水养殖业节省经济费用，减少其他抑制剂的毒副作用。
10.本发明通过检测柠檬酸抑制溶藻弧菌生物被膜形成实验，表明柠檬酸对溶藻弧菌生物被膜具有较强的抑制作用，当加入柠檬酸后能明显抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，从而降低溶藻弧菌的致病能力。因此可将柠檬酸用作抗溶藻弧菌制剂。
附图说明
11.图1为柠檬酸对溶藻弧菌生物被膜形成量的影响。
具体实施方式
12.下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释
而不是限定。
实施例
13.1、原料：柠檬酸（cas号为77-92-9，citric acid）：购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无菌水：121℃，20min高温灭菌获得；各试药置于4℃保存。实验前取出，充分混匀后进行检验。
14.2、菌株本研究所用的菌株为溶藻弧菌epgs（菌种保藏号 cctcc no. ab209306），由华东理工大学阿华生物工程研究所提供，溶藻弧菌长期储存于-80℃。
15.菌株保藏信息如下：名称：溶藻弧菌epgs020401 vibrio alginolyticus epgs020401菌种保藏号：cctcc no. ab209306保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏日期：2009年10月24日保藏地址：中国武汉 武汉大学。
16.3、培养基lbs液体培养基：（3%（w/v）nacl，1%（w/v）tryptone，0.5%（w/v）yeast extract）混合于水溶液中，高压灭菌（121℃，20min），于4℃保存备用。
17.4、仪器设备lrh-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；zd-85气浴恒温振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）；sw-cj-ifd单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；5、柠檬酸储备液柠檬酸溶解于无菌水中，配置成浓度为500 mg/ml的储备液，于4℃保存备用。
18.6、菌液制备实验时取菌种1%的接种量接种于lbs培养基，加入0.1%（v/v）的氨苄青霉素，于200 r/min，30℃条件下活化复苏培养12 h，使菌液最终浓度约为108~109cfu/ml备用（4℃保存），本发明中所有检验操作前，溶藻弧菌均作此上活化培养。
19.7、药敏板制备本发明采用二倍稀释法对柠檬酸扰动溶藻弧菌的mic进行测定，具体操作如下：加入不同毫升数的柠檬酸储备液至lbs培养基中，使柠檬酸最终的浓度为ck（以加5ul无菌水作为对照组）、0.075 mg/ml、0.15 mg/ml、0.3 mg/ml、0.6 mg/ml、1.2 mg/ml，2.4mg/ml，再按1%（v/v）接种量接入活化后的溶藻弧菌摇匀，将含有柠檬酸的lbs菌悬液移植24孔板中，同时以不含柠檬酸的菌悬液作为本实验的对照组。将24孔板置于30℃培养箱恒温培养。
20.在30℃恒温培养箱中，溶藻弧菌培养24 h后，观察菌体生长情况。以培养液澄清、肉眼不可见菌体时所加入的柠檬酸最低浓度即为柠檬酸对溶藻弧菌的mic。上述实验均平行操作3次，当mic值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为mic值；当
mic值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。实验结果得出：柠檬酸对溶藻弧菌的mic为1.2 mg/ml。
21.8、亚抑菌浓度柠檬酸对溶藻弧菌形成生物被膜的影响经7所得mic，本发明于低剂量柠檬酸浓度1/4 mic、1/2 mic的实验组及不加柠檬酸ck的对照组下，对溶藻弧菌生物被膜的形成量进行观察。
22.生物被膜是溶藻弧菌主要的毒力因子，其生成量可通过结晶紫染色进行判定。
23.取50μl溶藻弧菌过夜培养物接种于5mllbs培养基中，加入一定量母液浓度的柠檬酸溶液，使其终浓度分别为0、1/4mic、1/2mic，30℃静置培养12h。倒掉菌液，用自来水冲洗3-5次，并加入1ml结晶紫染色五分钟后，倒掉结晶紫用自来水冲洗，观察生物被膜生成量并拍照。
24.结果见图1，从左到右依次为0、1/4mic、1/2mic，经柠檬酸处理的实验组中，生物被膜的生成量有较明显的降低趋势，且降低趋势与柠檬酸的浓度呈负相关性变化。此结果表明：柠檬酸严重抑制了溶藻弧菌生物被膜的形成。
25.本发明通过实验表明，溶藻弧菌在柠檬酸亚抑菌浓度1/4 mic、1/2 mic时，其生物被膜形成量相对对照组显著降低，结果表明柠檬酸对溶藻弧菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用。
26.综上所述，本发明通过实验表明，柠檬酸对溶藻弧菌生物被膜形成有较好的抑制效果，因此柠檬酸可用作防治溶藻弧菌病害的制剂。本发明为柠檬酸开辟了新的用途，可将其用作防治溶藻弧菌病害的抑制剂，为海水养殖业提供新的防治候选抗生素替代物。


技术特征：
1.柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途。2.根据权利要求1所述的柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途，其特征在于，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌epgs，菌种保藏号为cctcc no. ab209306。3.根据权利要求1所述的柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途，其特征在于，所述柠檬酸通过抑制溶藻弧菌生物被膜形成，以达成削弱溶藻弧菌致毒能力的功效。4.根据权利要求1所述的柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途，其特征在于，所述柠檬酸在使用过程中，与无菌水配置成500 mg/ml的储备液，于4℃保存备用。5.根据权利要求3所述的柠檬酸在抑制溶藻弧菌生物被膜形成中的用途，其特征在于，柠檬酸在浓度为1/4 mic~1/2 mic范围内，对溶藻弧菌生物被膜形成具有显著的抑制作用，mic= 1.2mg/ml。

技术总结
本发明属于微生物防控制剂领域，具体公开了柠檬酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性的用途。本发明通过实验表明，柠檬酸对碱性丝氨酸蛋白酶活性有较好的抑制效果，因此柠檬酸可用作溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶抑制剂。本发明为柠檬酸开辟了新的用途，将其用于溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶抑制剂，为溶藻弧菌治疗提供了新的候选制剂；在临床溶藻弧菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗溶藻弧菌抑制剂恢复对耐药溶藻弧菌的作用，从而为海水养殖业节省经济费用，减少其他抑制剂的毒副作用。作用。作用。


技术研发人员：赵燕妮 余瑞 武若冰 张森虎 周闯 武璇 燕美如 刘欢
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2023.02.10
技术公布日：2023/7/26