一种测定列净类中间体纯度及含量的分析方法与流程

1.本发明涉及一种中间体纯度和含量的分析方法，具体涉及一种测定列净类中间体纯度和含量的分析方法。


背景技术：

2.目前，临床上糖尿病的治疗药物主要为胰岛素和口服降糖药两大类。近年来口服降糖药的迅猛发展使ii型糖尿病的治疗取得了较大进展。其中sglt-2抑制剂因其独特的作用机制、良好的临床疗效以及广阔的市场前景而备受商业界、医药界乃至学术界的关注。
3.美国食品药品管理局(fda)近几年连续批准了三个列净类药物上市，分别是达格列净(dapagliflozin)，卡格列净(canagliflozin)以及恩格列净(empagliflozin)，它们都是钠-葡萄糖协同转运蛋白ii抑制剂(sglt-2)，用于治疗ii型糖尿病。
4.达格列净(dapagliflozin)，化学名称为(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[4-氯-3-(4-乙氧基苄基)苯基]-6-(羟基甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇。达格列净是由美国bristol-myer-squibb公司和瑞典astra zeneca联合开发的一种钠-葡萄糖协同转运蛋白ii抑制剂(sglt-2)，2012年1月在欧盟获批上市，美国食品药品管理局(fda)于2014年1月8日宣布，批准将达格列净用于ii型糖尿病的治疗。其结构如下：
[0005][0006]
卡格列净(canagliflozin)，化学名称为(1s)-1,5-脱氢-1-[3-[[5-(4-氟苯基)-2-噻吩基]甲基]-4-甲基苯基]-d葡萄糖醇，由强生(johnson&johnson)旗下杨森(janssen)制药公司研制，于2013年3月29日获美国食品药品监督管理局(fda)批准用于改善ii型糖尿病成人患者的血糖控制。其结构如下：
[0007][0008]
恩格列净(empagliflozin)，化学名称为(1s)-1,5-脱水-1-[4-氯-3-[[4-[[(3s)-四氢-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-d-葡萄糖醇，由勃林格殷格翰(boering-ingelheim)和-礼来(eli lilly)糖尿病联盟联合开发，于2014年8月获美国食品药品监督管理局(fda)批准，结合饮食及运动用于ii型糖尿病成人患者的治疗，以改善血糖控制。其结构如下：
[0009][0010]
列净类药物结构中均含有糖环，其主流的合成路线为：以葡萄糖酸内酯(1)为起始原料，在n-甲基吗啉催化下，在四氢呋喃中与三甲基氯硅烷反应，得到关键中间体2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯(2)，经后续反应得到目标产品。其合成路线如下：
[0011][0012]
通过该路线获得的2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯为无色至淡黄色油状液体，并且它在存放过程中容易降解，因此生产过程中通常会直接将其投入下一步工序中。为了监控产品质量和准确计算下步工序的投料量，对该中间体中的纯度和含量测定就会显得尤为重要，但2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯具有紫外吸收弱，沸点较高，产品不稳定的特点，目前尚没有相关文献对该中间体的分析检测方法进行公开，所以建立一种操作简单、稳定有效的分析检测方法是非常有必要的。


技术实现要素：

[0013]
发明目的：本发明旨在提供一种能简单快速，准确有效地监控中间体质量水平的测定列净类中间体纯度及含量的分析方法。
[0014]
技术方案：本发明所述的测定列净类中间体2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯纯度和含量的分析方法，包含以下步骤：使用合适的稀释液稀释样品至合适的浓度后，使用带fid检测器的气相色谱仪，用非极性或弱极性毛细管柱，以氮气为载气，恒流模式，直接进样一定体积后，经分流后采取程序升温的方式进行检测。
[0015]
面积归一化法为本领域常规色谱纯度计算方法，故纯度结果采用面积归一化法进行计算；含量结果采用外标法进行计算。
[0016]
进一步的，稀释液为有机溶剂中的一种，优选为甲苯。
[0017]
进一步的，弱极性或非极性毛细管柱为100％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱。
[0018]
进一步的，毛细管柱规格为：长度30m～60m，内径0.25mm～0.53mm，膜厚0.18μm～1.5μm，优选毛细管柱规格为30m
×
0.25mm，1.0μm。
[0019]
进一步的，升温程序为初始温度40℃～180℃，以5～10℃/min升温至220℃～300℃，并保持2～5分钟；优选升温程序为：初始温度120℃，以10℃/min升温至300℃，并保持5分钟。
[0020]
进一步的，分流比为5:1～30:1，优选为10:1。
[0021]
进一步的，恒流模式中设置的流速为1.0ml/min～2.0ml/min，优选为1.0ml/min。
[0022]
进一步的，进样体积为1～10μl，优选为1μl。
[0023]
进一步的，对照品及样品稀释成每1ml稀释液中约含3mg目标物的溶液。
[0024]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：能简单快速，准确有效地监控中间体质量水平，操作简单，稳定性好，准确度高，重现性好。2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯不稳定，存放过程中易降解，且因其紫外吸收弱，沸点较高，难以准确检测其纯度，本发明对色谱方法，色谱柱，稀释液，升温程序等进行筛选，采用气相色谱法测定2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯的纯度，可为列净类产品的制备过程提供有效监测数据，继而减少反应中副产物及杂质的生成，实现产品质量可控。同时该方法可用外标法计算含量，用于后续投料量计算。
附图说明
[0025]
图1为对比例1的hplc色谱图；
[0026]
图2、图3为对比例2的gc色谱图；
[0027]
图4为对比例3的gc色谱图；
[0028]
图5为本发明实施例1的gc色谱图；
[0029]
图6为本发明实施例2的gc色谱图。
具体实施方式
[0030]
以下结合附图对本发明技术方案进行详细说明。
[0031]
对比例1
[0032]
液相色谱仪：agilent 1260液相色谱仪
[0033]
流动相：a：水
[0034]
b：乙腈
[0035]
梯度洗脱程序如表1所示。
[0036]
表1.对比例1的梯度洗脱程序
[0037]
洗脱时间(min)a相(％)b相(％)095510356525010030010030.195535955
[0038]
色谱柱：waters xbridge shield rp 18 4.6
×
150mm，3.5μm
[0039]
检测波长：210nm
[0040]
流速：1.0ml/min
[0041]
柱温：25℃
[0042]
进样量：10μl
[0043]
稀释液：甲醇
[0044]
供试品溶液：取样品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.3mg供试品
的溶液，摇匀，备用。
[0045]
样品测定：分别量取空白溶液、供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。
[0046]
检测结果：通过查看光谱图，2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯为末端吸收，故选择液相低波长检测。其中，主峰保留时间约23.9min，不对称因子为1.42，峰型存在拖尾现象。同时主峰峰高仅60.70mau，在液相色谱仪中灵敏度较低，不利于杂质的检查。详见附图1。
[0047]
对比例2
[0048]
气相色谱仪：agilent 7890b气相色谱仪
[0049]
色谱柱：hp-5 30m
×
0.32mm，0.25μm
[0050]
检测器：氢火焰离子化检测器(fid)
[0051]
升温程序：初始温度40℃，保持3分钟，以10℃/min升温至300℃，并保持5分钟；
[0052]
进样口温度：280℃；
[0053]
检测器温度：300℃；
[0054]
分流比：10:1；
[0055]
流速：1.0ml/min；
[0056]
氢气流速：30ml/min；
[0057]
空气流速：300ml/min；
[0058]
氮气流速：30ml/min；
[0059]
进样体积：1μl；
[0060]
稀释液：甲醇；
[0061]
供试品溶液：取样品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含3mg供试品的溶液，摇匀，备用。
[0062]
样品测定：分别量取空白溶液、供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪。
[0063]
检测结果：系统适用性考察结果中，主峰保留时间约19.4min，不对称因子为0.74，峰型前沿，且主峰与相邻杂质峰的最小分离度为1.10，未能达到基线分离，见附图2。同时在溶液稳定性考察结果中，发现供试品溶液不稳定，30小时内主峰纯度下降18.2％，见附图3。
[0064]
对比例3
[0065]
气相色谱仪：agilent 7890b气相色谱仪
[0066]
色谱柱：db-1701 30m
×
0.53mm，1.0μm
[0067]
检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；
[0068]
升温程序：初始温度100℃，以10℃/min升温至260℃，并保持5分钟；
[0069]
进样口温度：280℃；
[0070]
检测器温度：300℃；
[0071]
分流比：10:1；
[0072]
流速：4.0ml/min；
[0073]
氢气流速：30ml/min；
[0074]
空气流速：300ml/min；
[0075]
氮气流速：30ml/min；
[0076]
进样体积：1μl；
[0077]
稀释液：甲苯；
[0078]
供试品溶液：取样品适量，加甲苯溶解并定量稀释制成每1ml中约含3mg供试品的溶液，摇匀，备用。
[0079]
样品测定：分别量取空白溶液、供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪。
[0080]
检测结果：系统适用性考察结果中，主峰保留时间约15.7min，不对称因子为0.97，峰型明显改善，但主峰与相邻杂质峰的最小分离度为1.19，仍未达到基线分离。见附图4。
[0081]
实施例1
[0082]
气相色谱仪：agilent 7890b气相色谱仪
[0083]
色谱柱：db-1 30m
×
0.25mm，1.0μm
[0084]
检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；
[0085]
升温程序：初始温度120℃，以10℃/min升温至300℃，并保持5分钟；
[0086]
进样口温度：280℃；
[0087]
检测器温度：300℃；
[0088]
分流比：10:1；
[0089]
流速：1.0ml/min；
[0090]
氢气流速：30ml/min；
[0091]
空气流速：300ml/min；
[0092]
氮气流速：30ml/min；
[0093]
进样体积：1μl；
[0094]
稀释液：甲苯；
[0095]
对照品溶液：取对照品适量，加甲苯溶解并定量稀释制成每1ml中约含3mg对照品的溶液，摇匀，备用。
[0096]
供试品溶液：取样品适量，加甲苯溶解并定量稀释制成每1ml中约含3mg供试品的溶液，摇匀，备用。
[0097]
样品测定：分别量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪。
[0098]
检测结果：系统适用性考察结果中，主峰保留时间约14.8min，主峰与相邻杂质峰的分离度为2.48，能达到基线分离，见附图5。同时在含量重复性结果中，对照品溶液进样精密度rsd(n＝6)为0.23％，同一批样品重复测定含量结果的rsd(n＝6)为0.88％，说明本方法重复性良好。
[0099]
实施例1中的纯度方法学验证结果如下表2：
[0100]
表2.纯度方法验证结果及结论
[0101][0102]
由上述表2的数据可知，本发明提供的检测方法专属性强、线性范围宽、灵敏度高、准确度高、数据重现性好，且有良好的溶液稳定性及耐用性，可用于列净类关键中间体2,3,4,6-四-o-三甲基硅基-d-葡萄糖酸内酯纯度和含量的控制。
[0103]
实施例2
[0104]
气相色谱仪：agilent 7890b气相色谱仪。
[0105]
色谱柱：db-1 30m
×
0.25mm，1.0μm
[0106]
检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；
[0107]
升温程序：初始温度120℃，以10℃/min升温至300℃，并保持5分钟；
[0108]
进样口温度：280℃；
[0109]
检测器温度：300℃；
[0110]
分流比：5:1；
[0111]
流速：1.0ml/min；
[0112]
氢气流速：30ml/min；
[0113]
空气流速：300ml/min；
[0114]
氮气流速：30ml/min；
[0115]
进样体积：1μl；
[0116]
稀释液：甲苯；
[0117]
供试品溶液：取样品适量，加甲苯溶解并定量稀释制成每1ml中约含3mg供试品的溶液，摇匀，备用。
[0118]
样品测定：分别量取空白溶液、供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪。
[0119]
检测结果：系统适用性考察结果中，降低分流比后主峰与相邻杂质峰的分离度为2.43，能达到基线分离，见附图6。

技术特征：
1.一种测定列净类中间体纯度及含量的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）溶液制备，使用稀释液稀释对照品及样品至合适的浓度；（2）色谱条件，使用带fid检测器的气相色谱仪，用非极性或弱极性毛细管柱，以氮气为载气，恒流模式，直接进样后，经分流后采取程序升温的方式进行检测；（3）结果计算方法，纯度结果采用面积归一化法进行计算，含量结果采用外标法进行计算。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（1）所述的稀释液为甲苯。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）所述的非极性或弱极性毛细管柱为100%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）所述的毛细管柱规格为：长度30m~60m，内径0.25mm~0.53mm，膜厚0.18μm~1.5μm。5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）所述的升温程序为初始温度40℃~180℃，以5~10℃/min升温至220℃~300℃，并保持2~5分钟。6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分流比为5:1~30:1。7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）所述的进样体积为1~10μl。8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述恒流模式中设置的流速为1.0~2.0ml/min。9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述对照品及样品稀释成每1ml稀释液中约含3mg目标物的溶液。

技术总结
本发明公开了一种测定列净类中间体纯度和含量的分析方法，该方法在使用合适的稀释液稀释样品至合适的浓度后，使用带FID检测器的气相色谱仪，用非极性或弱极性毛细管柱，以氮气为载气，直接进样一定体积后，采取程序升温的方式进行检测。由于列净类关键中间体2,3,4,6-四-O-三甲基硅基-D-葡萄糖酸内酯易降解，生产过程中需控制其杂质和含量，本发明可为列净类产品的制备过程提供有效监测数据，继而减少反应中副产物及杂质的生成，实现产品质量可控，且操作简单，稳定性好，准确度高，重现性好。重现性好。重现性好。


技术研发人员：梁燕娜 邓瑜 李安排
受保护的技术使用者：苏州正济医药研究有限公司
技术研发日：2023.01.18
技术公布日：2023/7/26