一种敲入荧光的小鼠模型及其构建方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种敲入荧光的小鼠模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.淋巴结是产生免疫应答的重要器官之一。高内皮细胞微静脉(high endothelial venule,hev)是淋巴细胞自血液循环重新回到淋巴器官和淋巴组织需要通过的一种特殊的毛细血管后微静脉，是淋巴组织中的特殊的毛细血管后微静脉，是淋巴细胞自血液进入淋巴组织的通道。
3.因此在生理和病理情况下对hev进行科学研究十分重要，而其中的技术难点之一就是对其进行活体成像。目前的研究主要采用荧光标记的抗体pnad尾静脉注射到小鼠血液中，pnad能够特异性地识别并结合hev细胞，通过检测荧光的分布情况间接地识别hev细胞在体内的分布情况。这种方法尚存在一些缺陷。首先是抗体可能会存在非特异结合，导致非hev细胞也被标记到荧光。第二是pnad抗体的结合不稳定，会不断的衰落。第三是荧光抗体的发光较弱，特别是在检测的过程中，受到激光的刺激后，很快就会淬灭。最后是荧光抗体标记法是一种间接标记，并不能充分和精确地描绘出hev细胞地形态。综上所述目前的荧光抗体标记法不能够特异和稳定地在体内标记hev细胞，对淋巴结的研究工作造成了困难。
4.crispr-cas9是细菌用于对抗入侵的病毒及外源dna一种适应性免疫防御机制，可用于基因编辑。cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna两条单链。crispr-cas9在被应用于敲入时，需要提供一端每个末端都存在同源臂的dna；同源臂的长度和序列直接影响编辑的成功率。同时，sgrna的设计很重要。
5.目前，并未报道将tdtomato荧光定点敲入至chst4基因的小鼠模型构建的报道。


技术实现要素：

6.(一)要解决的技术问题
7.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种chst4基因特异性敲入tdtomato荧光的小鼠模型；
8.相应地，本发明还提供一种上述小鼠模型的构建方法和应用。
9.(二)技术方案
10.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
11.第一方面，本发明提供一种敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：在小鼠的chst4基因的起始密码子处定点敲入tdtomato荧光蛋白dna。
12.本发明获得的小鼠模型，通过chst4基因敲入tdtomato荧光蛋白基因，由于chst4可特异性表达于hev中，使tdtomato荧光蛋白可特异性和稳定的表达于hev中，解决了现有的hev荧光抗体标记法不够特异和稳定的缺陷，可用于活体成像，有利于小鼠的研究；
13.本发明敲入的tdtomato荧光蛋白dna优选为全序列，其核苷酸序列如seq id no.6
所示。
14.可选地，chst4基因中作为被核酸酶切割的靶序列如seq id.no1所示。
15.可选地，其使用crispr-cas9技术敲入tdtomato荧光蛋白dna，其步骤包括：
16.s1设计针对chst4基因的grna的转录dna序列并在体外转录获得grna；所述grna的转录dna序列为seq id.no2或seq id.no3所示；
17.s2获得cas9 mrna；
18.s3设计包含tdtomato荧光蛋白dna的同源重组载体；
19.s4将cas9 mrna、grna和同源重组载体进行受精卵注射，获得f0代小鼠；
20.s5将f0代小鼠与wt小鼠繁殖，获得阳性f1代杂合子小鼠，完成可稳定传代小鼠模型的构建。
21.本发明通过所设计的grna具有优异的特异性，脱靶率较低。
22.可选地，所述同源重组载体包含：2.9kb5’同源臂、kozak-creert2-p2a-tdtomato-wpre-pa和2.9kb3’同源臂。
23.为了降低脱靶率，提高插入的成功率，设计上述同源重组载体；
24.其中，
25.kozak为翻译起始位点；
26.creert2为人突变雌激素受体(estrogen receptor，简称er)的配体结合区(lbd)与cre重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白(cre-er2)。只有在雌激素诱导后，融合的cre蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白hsp90上解离下来，进入细胞核，识别loxp位点并发生重组。这样就通过控制雌激素的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控；
27.p2a为2a自裂解肽，分开cre-er2和tdtomato蛋白；
28.wpre为土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)，是一种dna序列，当转录时，会产生一个增强表达的三级结构，用来增加基因表达；
29.pa为polya尾巴，维持mrna作为翻译模板的活性并增加其mrna本身的稳定性。
30.进一步地，为了降低脱靶效应，优选grna∶cas9复合物的比例为2：1，分别为40ng/μl和20ng/μl。
31.直接通过显微镜注射直接递送cas9系统的方式，具体来讲，使用固定针固定胚胎，在注射针中吸取注射组分，调整焦距、注射压力和时间等参数后，将注射针扎入胚胎，完成注射，然后将胚胎移植到受体雌鼠体内。
32.可选地，通过pcr的办法对获得的f0代小鼠进行基因型鉴定；pcr中，所用正向引物的核苷酸序列为seq id no.4所示；所用反向引物的核苷酸序列为seq id no.5所示。
33.第二方面，本发明还提供上述任一方案中，所述构建方法所得敲入荧光的小鼠模型。
34.可选地，其用于hev细胞和其它细胞的相互作用的研究；所述其它细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞等；其它细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞等。
35.(三)有益效果
36.本发明获得的杂合子小鼠，通过chst4基因敲入tdtomato荧光蛋白基因，由于chst4可特异性表达于hev中，使tdtomato荧光蛋白可特异性和稳定的表达于hev中，解决了现有的荧光抗体标记法不够特异和稳定的缺陷，可用于活体成像，有利于在小鼠体内对hev
的研究；
37.其中，本发明小鼠体内的hev细胞荧光亮度强，由于具有较低的自发荧光，使得更容易和背景区分；荧光具有较低的光毒性。红色荧光的激发态更高，不容易被可见光光子激发，因此不容易对细胞产生损伤；
38.其中，荧光较强的组织穿透性，长波光穿透动物组织最远，组织吸收和光散射的综合效应最小。
39.其中，本发明设计的grna具有优异的特异性，脱靶率较低。
附图说明
40.图1为靶向chst4基因特异性敲入tdtomato序列的示意图；
41.图2实施例1所得到的f1代小鼠进行基因型鉴定电泳图；
42.图3为实施例1所获得的f1代杂合子小鼠在多光子显微镜体内成像下的hev细胞特异表达tdtomato荧光图；
43.图4为荧光标记的抗体pnad尾静脉注射到小鼠血液中多光子显微镜体内成像图。
具体实施方式
44.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
45.实施例1
46.本实施例提供一种小鼠荧光模型的构建方法，如图1所示，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在chst4基因起始密码子位点定点敲入kozak-creert2-p2a-tdtomato-wpre-pa表达框；
47.本实施例中，
48.chst4基因中作为被核酸酶切割的靶序列如seq id.no1所示：ccgcaggatgatgctgttgaagaaagg；
49.grna的转录dna序列为seq id.no2所示：aggatgatgctgttgaagaaagg；
50.或
51.为seq id.no3所示：tcttcaacagcatcatcctgcgg；
52.pcr中，所用正向引物的核苷酸序列为seq id no.4所示：5
’‑
cccattcctttgaatatgtctggtg-3’；
53.所用反向引物的核苷酸序列为seq id no.5所示：5
’‑
ctgaattaatatgggcacaagcctc-3’。
54.其步骤为：
55.s1针对如seq id.no1所示的靶序列，设计grna和cas9 mrna序列，并且在体外转录获得grna和cas9 mrna，grna的序列为seqid.no2所示；
56.s2设计并通过in-fusion cloning的方法，构建包含tdtomato荧光蛋白dna的同源重组载体：同源重组载体包含：2.9kb5’同源臂、kozak-creert2-p2a-tdtomato-wpre-pa和2.9kb3’同源臂；
57.s3将所得cas9 mrna、grna和同源重组载体在显微镜下进行受精卵注射，获得f0代
小鼠；其中，注射液中cas9-sgrna：cas9复合物的用量分别为40ng/μl和20ng/μl。通过pcr的办法对获得的f0代小鼠进行基因型鉴定；pcr中，所用正向引物的核苷酸序列为seq id no.4所示；所用反向引物的核苷酸序列为seq id no.5所示。
58.s4将pcr鉴定合格的f0代小鼠与wt小鼠繁殖，获得阳性f1代杂合子小鼠，完成可稳定传代小鼠模型的构建。
59.图2为对本实施例所获得的的f1代小鼠进行基因型鉴定电泳图。其中，wt为野生型小鼠基因组，h20为阴性水对照，marker为100bp dna marker from transgen(bm311)。
60.图3为本实施例所获得的f1代杂合子小鼠淋巴结在多光子显微镜体内成像下的hev细胞特异表达tdtomato荧光。其方法为，首先使用2％异氟醚吸入麻醉小鼠，然后将小鼠放置在37℃保温垫上，使用多光子激光共聚焦显微镜(fvmpe-rs)在25倍水镜下进行拍摄；从图3中可知，本实施例可成功获得一种靶向chst4基因特异性敲入tdtomato荧光的小鼠模型，可用于小鼠的活体研究，在体内成像效果非常好，荧光强度高，几乎无背景，hev形状典型突出，易于辨认和识别。作为对照，使用荧光标记的抗体pnad尾静脉注射到小鼠血液中成像，在同样的拍摄条件下，得到的结果为图4，可以明显看到其成像效果远不如tdtomato荧光小鼠模型，荧光标记成像法明显亮度很弱，不容易检测到，背景噪点非常多，hev成像不明显，存在非特异结合。综上所述，tdtomato荧光小鼠模型相较于pnad荧光标记法，用于体内成像时优势明显，成像效果的敏感性和特异性得到了明显的提高，非常有利于利用此模型进一步研究hev的功能及其和其他细胞的相互作用。
61.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：在小鼠的chst4基因的起始密码子处定点敲入tdtomato荧光蛋白dna。2.如权利要求1所述敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其特征在于：chst4基因中作为被核酸酶切割的靶序列如seq id.no1所示。3.如权利要求1所述敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其特征在于：其使用crispr-cas9技术敲入tdtomato荧光蛋白dna，其步骤包括：s1设计针对chst4基因的grna的转录dna序列并在体外转录获得grna；所述grna的转录dna序列为seq id.no2或seq id.no3所示；s2获得cas9 mrna；s3设计包含tdtomato荧光蛋白dna的同源重组载体；s4将cas9 mrna、grna和同源重组载体进行受精卵注射，获得f0代小鼠；s5将f0代小鼠与wt小鼠繁殖，获得阳性f1代杂合子小鼠，完成可稳定传代小鼠模型的构建。4.如权利要求3所述敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述同源重组载体包含：2.9kb5’同源臂、kozak-creert2-p2a-tdtomato-wpre-pa和2.9kb3’同源臂。5.如权利要求3所述敲入荧光的小鼠模型的构建方法，其特征在于：通过pcr的办法对获得的f0代小鼠进行基因型鉴定；pcr中，所用正向引物的核苷酸序列为seq id no.4所示；所用反向引物的核苷酸序列为seq id no.5所示。6.一种如权利要求1-5任一项所述构建方法所得敲入荧光的小鼠模型。7.如权利要求6所述敲入荧光的小鼠模型，其特征在于：其用于hev细胞和其它细胞的相互作用的研究；所述其它细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞等。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种敲入荧光的小鼠模型及其构建方法和应用。其包括以下步骤：在小鼠的Chst4基因的起始密码子处定点敲入tdTomato荧光蛋白DNA。Chst4基因中作为被核酸酶切割的靶序列如SEQ ID.NO1所示。本发明获得的杂合子小鼠，通过Chst4基因启动子下敲入tdTomato荧光蛋白基因，由于Chst4可特异性表达于HEV细胞中，使tdTomato荧光蛋白可特异性和稳定地表达于HEV细胞中，解决了现有的荧光抗体标记法不够特异和稳定的缺陷，可用于活体成像，有利于在小鼠体内对HEV的研究。有利于在小鼠体内对HEV的研究。有利于在小鼠体内对HEV的研究。


技术研发人员：苏士成 夏起东 潘嘉瑶
受保护的技术使用者：中山大学孙逸仙纪念医院
技术研发日：2023.02.02
技术公布日：2023/7/26