一种用于区分甘蓝品种的InDel引物及其应用

一种用于区分甘蓝品种的indel引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用indel分子标记技术快速区分甘蓝品种的方法。


背景技术：

2.甘蓝为世界广泛种植的主要蔬菜作物之一，其栽培历史悠久，品种资源及其丰富，目前我国结球甘蓝每年种植面积在40万公顷以上，占全国蔬菜种植面积的25％～30％，是东北、西北、华北等地区春、夏、秋季栽培的主要蔬菜，在南方也有大积栽培。近些年来，随着我国甘蓝产量及栽培面积的大幅度扩展，越来越多的优良品种应用于甘蓝生产中。因此，建立甘蓝品种快速可靠的鉴定技术体系对于甘蓝品种遗传资源的研究保护、苗期鉴定、品种区分乃至甘蓝产业的持续发展等具有重要的意义。
3.dna分子标记是随着分子克隆和重组dna等生物技术迅速发展而产生的一类遗传标记，由于其直接建立在分子水平上，而不受外界环境、作物发育阶段、取样部位等因素影响，其检出的多态性位点是无限的，故鉴定结果具有高度的可靠性，且重复性高，鉴别力强。
4.由于目前传统单一的形态学品种鉴定方法已无法满足有效鉴别或区分当今日益增多的品种的要求。分子标记的应用给作物遗传育种研究带来了巨大变化，同时也应用到了品种鉴定的研究中。与传统的dna标记如rapd、issr、srap和aflp等众多分子标记技术不同，indel标记为基于全基因组dna序列开发的新一代分子标记技术，indel多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段序列，属于共显性标记，因其具有较好的稳定性和多态性等优点目前已被普遍应用于指纹图谱构建、种质资源的遗传基础研究、基因的快速定位、高密度基因连锁标记、遗传多样性分析，品种分类研究等方面。
5.现有的利用分子标记技术在进行蔬菜作物品种区分与种质鉴定的研究工作中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱并结合统计学软件聚类分析得出聚类树，但是此聚类分析结果不但无法直观显示出区分品种的引物，无法显示鉴别过程，其操作量大，缺乏实用性。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种用于用于区分甘蓝品种的indel引物。
7.本发明还要解决的技术问题是提供上述引物在区分甘蓝品种中的应用。
8.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
9.一种用于区分甘蓝品种的indel引物，包括如下引物：
10.indel22：f：aacacctgaaaccctcac；r：tttgaaagtcacccgtaa；
11.indel 24：f：actcctcccaacggtctt；r：gaacaggtggcacaagat；
12.indel 5：f：ttttggaaacggtcttgt；r：agcgactgaatggcaccc；
13.indel 3：f：aagcaaatgagcagaatga；r：tttgggctgtttaggtgg；
14.indel 34：f：tgggtcagttgtccaaag；r：tcagtacgcatatcagcac。
15.上述用于区分甘蓝品种的indel引物在区分甘蓝品种中的应用。
16.所述的甘蓝品种包括：
‘
京丰一号’、
‘
庆丰’、
‘
中甘十一号’、
‘
真绿’、
‘
绿球皇冠’、
‘
君川维加斯’、
‘
秋甜2号’、
‘
希望’、
‘
前途’、
‘
中甘21’、
‘
cms京丰一号’、
‘
夏天’、
‘
夏丽’、
‘
春丰’、
‘
春喜’、
‘
北方夏帝’、
‘
优选8132’、
‘
早靓’、
‘
超绿’、
‘
珍绿55’、
‘
邢蔬309’、
‘
苏甘55’、
‘
苏甘65’、
‘
中甘26’、
‘
先甘097’、
‘
美华’、
‘
盛夏王’、
‘
抗热绿甘40’、
‘
抗热绿甘60’、
‘
绿霸505’、
‘
抗热绿甘50’、
‘
金圆宝一号’、
‘
华春’、
‘
探春’、
‘
苏甘125’、
‘
春秋婷美’。
17.利用本发明中的5对引物对甘蓝品种进行鉴别的方法如下：
18.(1)提取甘蓝叶片基因组dna；
19.(2)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，而在280bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在450bp处出现特征性谱带，其品种为qb2，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb28，若在500bp处出现特征性谱带，其品种为qb107；
20.利用indel24引物进行indel扩增时，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp处出现特征性谱带，而在100bp、150bp均没有出现特征性谱带，其品种为qb1，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp、450bp处出现特征性谱带，其品种为qb18，若在300bp、600bp处出现特征性谱带，其品种为qb111；
21.(3)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、350bp处均出现特征性谱带，其品种为qb197；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp出现特征性谱带，其品种为qbq168；若在100bp处无特征性谱带，该品种为qb120；若在400bp、350bp处均出现特征性谱带，该品种为qb90；若在450bp处出现特征性谱带，该品种为qb171；若在100bp、150bp、300bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp、500bp处均出现特征性谱带，其品种为qb43；若在480bp处出现特征性谱带，其品种为qb41；若在300bp、400bp处均出现特征性谱带，其品种为qb13；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处出现特征性谱带，其品种为qb12；若在100bp处无特征性谱带，其品种为qb103；
22.利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引
物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp、450bp、处均出现特征性谱带，其品种为qb179；若在350bp处出现特征性谱带，其品种为qb161；若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、350bp处有特征性谱带，该品种为qb46；若在400bp处出现特征性谱带，该品种为qb30；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在600bp、300bp处均出现特征性谱带，其品种为qb3；若在480bp、500bp处出现特征性谱带，其品种为qb39；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb19；若在400bp处无特征性谱带，其品种为qb121；若在300bp、500bp处均无特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若420bp处出现特征性谱带其品种为qb410；若420bp处未出现特征性谱带其品种为qb142；
23.(4)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处均出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性条带，其品种为qb37；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb10；若在250bp处出现特征性谱带，其品种为qb40；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qbjf；
24.利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、300bp处出现特征性谱带，其品种为qb100；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb185；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb7；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qb23；若在350bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在250bp、300bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在250处出现特征性谱带其品种为qbysgl；若在250处未出现特征性谱带其品种为qb158。
25.以上步骤中，各编号对应的品种名称如下表所示：
[0026][0027]
步骤(1)中，提取甘蓝叶片基因组dna的方法如下：
[0028]
取甘蓝幼嫩叶片0.1g，经液氮研磨，加入500μl ctab裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇，在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状dna用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后将絮状dna溶于te缓冲液中保存；
[0029]
其中，所述的ctab裂解液的组成如下：体积分数为2％ctab，2mol/l nacl2,，20mmol/l edta，100mmol/l tris-hcl，ph＝8.0，体积分数为0.2％β-巯基乙醇；所述的氯仿/异戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
[0030]
步骤(2)～(5)中，所述的indel扩增，其pcr反应体系为20μl，其中含基因组dna 1μl，上下游引物各1μl，2xeasytaq pcr supermix for page 10μl。
[0031]
步骤(2)～(5)中，所述的indel扩增，其pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃50s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；
[0032]
其中，indel22引物的退火温度为46.7℃，indel24的退火温度为47.1℃，indel5的退火温度为48.4℃，indel3的退火温度为46.5℃；indel34的退火温度为49.1℃。
[0033]
有益效果：
[0034]
本发明的引物提高了indel反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过5次pcr就可轻松的将“qb1”等36个甘蓝品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现甘蓝种苗早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。
附图说明
[0035]
图1本发明品种与编号对照图。
[0036]
图2本发明鉴定树形图。
[0037]
图3本发明鉴定树形图。
[0038]
图4本发明鉴定树形图。
[0039]
图5本发明鉴定树形图。
[0040]
图6本发明鉴定树形图。
[0041]
图7本发明鉴定树形图
[0042]
图8利用indel22引物pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0043]
图9利用indel24引物pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0044]
图10利用indel5引物pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0045]
图11利用indel3引物pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0046]
图12利用indel34引物pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
[0047]
实施例1：甘蓝叶片基因组dna的方法如下：
[0048]
取甘蓝幼嫩叶片0.1g，经液氮研磨，加入500μl ctab裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇，在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状dna用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后将絮状dna溶于te缓冲液中保存；
[0049]
其中，所述的ctab裂解液的组成如下：体积分数为2％ctab，2mol/l nacl2,，20mmol/ledta，100mmol/l tris-hcl，ph＝8.0，体积分数为0.2％β-巯基乙醇；所述的氯仿/异戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
[0050]
步骤(2)～(5)所述的indel扩增，其pcr反应体系为20μl，其中含基因组dna 1μl，上下游引物各1μl，2xeasytaq pcr supermix for page 10μl。
[0051]
步骤(2)～(5)所述的indel扩增，其pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃50s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；
[0052]
其中，indel22引物的退火温度为46.7℃，indel24的退火温度为47.1℃，indel5的退火温度为48.4℃，indel13的退火温度为46.5℃。
[0053]
实施例2：
[0054]
本发明可以区分的甘蓝品种包括：
‘
京丰一号’、
‘
庆丰’、
‘
中甘十一号’、
‘
真绿’、
‘
绿球皇冠’、
‘
君川维加斯’、
‘
秋甜2号’、
‘
希望’、
‘
前途’、
‘
中甘21’、
‘
cms京丰一号’、
‘
夏天’、
‘
夏丽’、
‘
春丰’、
‘
春喜’、
‘
北方夏帝’、
‘
优选8132’、
‘
早靓’、
‘
超绿’、
‘
珍绿55’、
‘
邢蔬309’、
‘
苏甘55’、
‘
苏甘65’、
‘
中甘26’、
‘
先甘097’、
‘
美华’、
‘
盛夏王’、
‘
抗热绿甘40’、
‘
抗热绿甘60’、
‘
绿霸505’、
‘
抗热绿甘50’、
‘
金圆宝一号’、
‘
华春’、
‘
探春’、
‘
苏甘125’、
‘
春秋婷美’。
[0055]
(1)提取甘蓝叶片基因组dna；
[0056]
(2)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，得到的pcr产物
用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，而在280bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在450bp处出现特征性谱带，其品种为qb2，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb28，若在500bp处出现特征性谱带，其品种为qb107；
[0057]
利用indel24引物进行indel扩增时，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp处出现特征性谱带，而在100bp、150bp均没有出现特征性谱带，其品种为qb1，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp、450bp处出现特征性谱带，其品种为qb18，若在300bp、600bp处出现特征性谱带，其品种为qb111；
[0058]
(3)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、350bp处均出现特征性谱带，其品种为qb197；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp出现特征性谱带，其品种为qbq168；若在100bp处无特征性谱带，该品种为qb120；若在400bp、350bp处均出现特征性谱带，该品种为qb90；若在450bp处出现特征性谱带，该品种为qb171；若在100bp、150bp、300bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp、500bp处均出现特征性谱带，其品种为qb43；若在480bp处出现特征性谱带，其品种为qb41；若在300bp、400bp处均出现特征性谱带，其品种为qb13；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处出现特征性谱带，其品种为qb12；若在100bp处无特征性谱带，其品种为qb103；
[0059]
利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp、450bp、处均出现特征性谱带，其品种为qb179；若在350bp处出现特征性谱带，其品种为qb161；若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、350bp处有特征性谱带，该品种为qb46；若在400bp处出现特征性谱带，该品种为qb30；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在600bp、300bp处均出现特征性谱带，其品种为qb3；若在480bp、500bp处出现特征性谱带，其品种为qb39；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb19；若在400bp处无特征性谱带，其品种为qb121；若在300bp、500bp处均无特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若420bp处出现特征
性谱带其品种为qb410；若420bp处未出现特征性谱带其品种为qb142；
[0060]
(4)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处均出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性条带，其品种为qb37；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb10；若在250bp处出现特征性谱带，其品种为qb40；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qbjf；
[0061]
利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、300bp处出现特征性谱带，其品种为qb100；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb185；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb7；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qb23；若在350bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在250bp、300bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在250处出现特征性谱带其品种为qbysgl；若在250处未出现特征性谱带其品种为qb158。

技术特征：
1.一种用于区分甘蓝品种的indel引物，其特征在于，包括如下引物：indel22：f：aacacctgaaaccctcac；r：tttgaaagtcacccgtaa；indel 24：f：actcctcccaacggtctt；r：gaacaggtggcacaagat；indel 5：f：ttttggaaacggtcttgt；r：agcgactgaatggcaccc；indel 3：f：aagcaaatgagcagaatga；r：tttgggctgtttaggtgg；indel 34：f：tgggtcagttgtccaaag；r：tcagtacgcatatcagcac。2.权利要求1所述的用于区分甘蓝品种的indel引物在区分甘蓝品种中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的甘蓝品种包括：
‘
京丰一号’、
‘
庆丰’、
‘
中甘十一号’、
‘
真绿’、
‘
绿球皇冠’、
‘
君川维加斯’、
‘
秋甜2号’、
‘
希望’、
‘
前途’、
‘
中甘21’、
‘
cms京丰一号’、
‘
夏天’、
‘
夏丽’、
‘
春丰’、
‘
春喜’、
‘
北方夏帝’、
‘
优选8132’、
‘
早靓’、
‘
超绿’、
‘
珍绿55’、
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邢蔬309’、
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苏甘55’、
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苏甘65’、
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中甘26’、
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先甘097’、
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美华’、
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盛夏王’、
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抗热绿甘40’、
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抗热绿甘60’、
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绿霸505’、
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抗热绿甘50’、
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金圆宝一号’、
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华春’、
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探春’、
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苏甘125’、
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春秋婷美’。4.根据权利要求2所述的应用，其特证在于，包括如下步骤：(1)提取甘蓝叶片基因组dna；(2)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，而在280bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在450bp处出现特征性谱带，其品种为qb2，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb28，若在500bp处出现特征性谱带，其品种为qb107；利用indel24引物进行indel扩增时，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp处出现特征性谱带，而在100bp、150bp均没有出现特征性谱带，其品种为qb1，若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，再利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp、450bp处出现特征性谱带，其品种为qb18，若在300bp、600bp处出现特征性谱带，其品种为qb111；(3)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp、350bp处均出现特征性谱带，其品种为qb197；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp出现特征性谱带，其品种为qbq168；若在100bp处无特征性谱带，该品种为qb120；若在400bp、350bp处均出现特征性谱带，该品种为qb90；若在450bp处出现特征性谱带，该品种为qb171；若在100bp、150bp、300bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp、500bp处均出现特征性谱带，其品种为qb43；若在480bp处出现特征性谱带，其品种为qb41；若在300bp、400bp处均出现特
征性谱带，其品种为qb13；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处出现特征性谱带，其品种为qb12；若在100bp处无特征性谱带，其品种为qb103；利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp处出现特征性谱带，而在400bp无特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在350bp、450bp、处均出现特征性谱带，其品种为qb179；若在350bp处出现特征性谱带，其品种为qb161；若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、350bp处有特征性谱带，该品种为qb46；若在400bp处出现特征性谱带，该品种为qb30；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，继续利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在600bp、300bp处均出现特征性谱带，其品种为qb3；若在480bp、500bp处出现特征性谱带，其品种为qb39；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb19；若在400bp处无特征性谱带，其品种为qb121；若在300bp、500bp处均无特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若420bp处出现特征性谱带其品种为qb410；若420bp处未出现特征性谱带其品种为qb142；(4)利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处均出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp处出现特征性谱带，而在450bp处无特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在400bp处出现特征性条带，其品种为qb37；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb10；若在250bp处出现特征性谱带，其品种为qb40；若在400bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qbjf；利用indel22引物对步骤(1)得到的基因组dna进行indel扩增，若在280bp、400bp处出现特征性谱带；利用indel24引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在280bp、450bp处均出现特征性谱带；继续利用indel5引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在100bp处无特征性谱带，而在150bp、300bp处出现特征性谱带，其品种为qb100；若在350bp处无特征性谱带，而在400bp处出现特征性谱带，其品种为qb185；若在100bp、150bp、350bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在300bp处出现特征性谱带，其品种为qb7；若在300bp、450bp处均出现特征性谱带，其品种为qb23；若在350bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel3引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若在250bp、300bp、400bp处均出现特征性谱带，利用indel34引物继续进行indel扩增，得到的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若在250处出现特征性谱带其品种为qbysgl；若在250处未出现特征性谱带其品种为qb158；以上步骤中，各编号对应的品种名称如下表所示：
。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)提取甘蓝叶片基因组dna的方法如下：取甘蓝幼嫩叶片0.1g，经液氮研磨，加入500μl ctab裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇，在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状dna用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后将絮状dna溶于te缓冲液中保存；其中，所述的ctab裂解液的组成如下：体积分数为2％ctab，2mol/l nacl2,，20mmol/l edta，100mmol/l tris-hcl，ph＝8.0，体积分数为0.2％β-巯基乙醇；所述的氯仿/异戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)～(5)所述的indel扩增，其pcr反应体系为20μl，其中含基因组dna 1μl，上下游引物各1μl，2xeasytaq pcr supermix for page 10μl。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)～(5)所述的indel扩增，其pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃ 50s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；其中，indel22引物的退火温度为46.7℃，indel24的退火温度为47.1℃，indel5的退火温度为48.4℃，indel3的退火温度为46.5℃；indel34的退火温度为49.1℃。

技术总结
本发明公开了一种用于区分甘蓝品种的InDel引物，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计筛选出的5对InDel引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～5所示，用于扩增未知甘蓝品种的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并建立被区分品种的树形鉴别图。本发明的引物提高了InDel反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过5次PCR就可轻松的将“QB1”等36个甘蓝品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现甘蓝种苗早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。广泛的通用性。广泛的通用性。


技术研发人员：许园园 曾爱松 宋立晓 严继勇
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2023/7/31