一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法及其应用

1.本发明涉及外泌体技术领域，特别是涉及一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法及其应用。


背景技术：

2.牦牛(b.grunniens)分布于青藏高原及其邻近的高寒、亚高山地区，是当地牧民的重要家畜，在高原地区具有不可替代的社会、生态和经济意义。然而，恶劣、缺氧和高海拔的环境特征导致牦牛发情率和繁殖力低。因此，辅助生殖技术在牦牛中的广泛应用和推广将有助于育种策略，以帮助后代保持牦牛群体的健康。
3.卵母细胞作为现代繁殖技术的基础材料，其质量影响着后续胚胎质量。卵母细胞发育成熟指的是细胞核及细胞质的成熟，这两个过程相互联系、相互依赖,共同影响着卵母细胞能否正常受精，以及受精后的胚胎能否良好发育。
4.卵泡液的形成是由于几种血浆成分通过血液-滤泡屏障而渗入，其组成反映了卵巢卵泡的生理状态。卵泡液构成的微环境为卵母细胞提供营养，是卵母细胞成熟的关键。卵泡液外泌体可来源于卵泡中的卵母细胞、卵丘细胞或壁颗粒细胞。卵泡液外泌体填充卵巢卵泡并影响卵母细胞的发育能力。外泌体可以携带和转移调节分子，如编码rna、非编码rna、dna、蛋白质、生长因子和脂质，并将胞浆大分子转移到靶细胞，参与多种生理过程，包括自噬、胚胎着床、胎盘生理、精液调节功能、生殖生物学，以及妊娠。但是，在现有技术中，如何快速制备牦牛高活性卵泡液外泌体，并将其应用于提高卵子发育能力中的相关报道甚少。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该提取方法成功分离的牦牛卵泡液外泌体能够显著提高卵母细胞成熟率，增强卵子发育潜能，为牦牛的辅助繁殖提供新思路。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法，将牦牛卵泡液超速离心后，取沉淀重悬、过滤，获得所述牦牛卵泡液外泌体。
8.进一步地，包括如下步骤：
9.收集牦牛卵泡液，第一次离心后取上清液一；将上清液一第二次离心取上清液二，之后经第一次超速离心得沉淀一，将沉淀一重悬后第二次超速离心得沉淀二，之后重悬、过滤，获得所述牦牛卵泡液外泌体。
10.进一步地，所述第一次离心的条件为：500-800g，4℃离心10-15min；所述第二次离心为10000-12000g，4℃离心15-20min。
11.进一步地，所述第一次超速离心和第二次超速离心的条件均为100000-150000g、4℃超速离心80-90min。
12.进一步地，所述沉淀一用pbs溶液进行重悬，所述pbs溶液包括以下重量组分：8g nacl、0.2g kcl、1.15gna2hpo3和0.2g kh2po3，用水补足至1l。
13.进一步地，所述沉淀二的重悬操作为：利用dmem-f12培养液进行重悬；所述过滤具体为以0.22μm的微孔滤膜滤器过滤。
14.本发明还提供一种所述的提取方法获得的牦牛卵泡液外泌体。
15.本发明还提供一种所述的牦牛卵泡液外泌体在制备提高卵子发育能力的药物中的应用。
16.本发明还提供一种增强卵子发育潜能的药物，包含所述的牦牛卵泡液外泌体。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.(1)本发明首次成功提取牦牛卵泡液外泌体，提供了一种简单且对技术要求不高的卵泡液外泌体提取方法。
19.(2)本发明提取的牦牛卵泡液外泌体形态似杯状，nta粒径分析表明牦牛卵泡液外泌体的大小主要分布在30～150nm之间，蛋白免疫印迹结果表明其能特异性表达外泌体标志性蛋白cd63和tsg101，证明已成功分离牦牛卵泡液外泌体，并经实验证实，分离的牦牛卵泡液外泌体能够提高卵母细胞成熟率，增强卵子发育潜能，为牦牛的辅助繁殖提供新思路。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为实施例1牦牛卵泡液外泌体透射电镜检测结果；左图：200nm，右图：100nm；
22.图2为实施例1牦牛卵泡液外泌体nta粒径分析结果；
23.图3为实施例1牦牛卵泡液外泌体蛋白免疫印迹实验曝光图片；
24.图4为牦牛卵丘卵母细胞复合体对牦牛卵泡液外泌体的摄入情况。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.1.牦牛卵巢的采集
31.在屠宰场收集成年健康雌性牦牛的卵巢，放置于含有青链霉素(双抗)(100万单位)的37℃生理盐水中送至实验室细胞间处理。
32.2.卵泡液收集
33.将采集到的卵巢组织用添加了2倍双抗的生理盐水清洗数次直至无血液流出后，于超净台中用注射器抽取卵巢表面直径》8mm卵泡的卵泡液，汇集到一起后用于后续外泌体提取。
34.实施例1牦牛卵泡液外泌体的提取
35.包括如下步骤：
36.(1)将收集到的牦牛卵泡液，以500g，4℃离心15min，取上清液一；
37.(2)将上清液一12000g、4℃条件下离心15min，取上清液二；
38.(3)上清液二在100000g、4℃条件下超速离心90min后去除上清液三；
39.(4)沉淀用无菌pbs重悬后移入新的超速离心管中100000g、4℃条件下超速离心90min，去除上清液四；
40.pbs的配制：8g nacl+0.2g kcl+1.15g na2hpo3+0.2g kh2po3溶于1l去离子水中，ph值调至7.2；
41.(5)dmem-f12培养液重悬底部沉淀，以0.22μm的微孔滤膜滤器过滤，获得牦牛卵泡液外泌体分装成nml/支，n≥1后置于-80℃冰箱保存；
42.dmem/f-12的配制：在尽可能接近最终体积的混合容器中，加入950ml蒸馏水，将15.6g dmem/f-12粉末加入水中并冲洗包装内部，加入3.024g nahco3，用蒸馏水调节最终体积为1l，轻轻搅拌至溶解。调节ph值至7.2-7.4，用0.2μm过滤器进行膜过滤，立即将培养液处理到无菌容器中。
43.实施例2牦牛卵泡液外泌体的提取
44.包括如下步骤：
45.(1)将收集到的牦牛卵泡液，以600g，4℃离心12min，取上清液一；
46.(2)将上清液一10000g、4℃条件下离心20min，取上清液二；
47.(3)上清液二在120000g、4℃条件下超速离心85min后去除上清液三；
48.(4)沉淀用无菌pbs重悬后移入新的超速离心管中120000g、4℃条件下超速离心85min，去除上清液四；
49.pbs的配制：8g nacl+0.2g kcl+1.15g na2hpo3+0.2g kh2po3溶于1l去离子水中，ph值调至7.4；
50.(5)dmem-f12培养液重悬底部沉淀，以0.22μm的微孔滤膜滤器过滤，获得牦牛卵泡液外泌体分装成nml/支，n≥1后置于-80℃冰箱保存；
51.dmem/f-12的配制同实施例1。
52.实施例3牦牛卵泡液外泌体的提取
53.包括如下步骤：
54.(1)将收集到的牦牛卵泡液，以800g，4℃离心10min，取上清液一；
55.(2)将上清液一10000g、4℃条件下离心20min，取上清液二；
56.(3)上清液二在150000g、4℃条件下超速离心80min后去除上清液三；
57.(4)沉淀用无菌pbs重悬后移入新的超速离心管中150000g、4℃条件下超速离心80min，去除上清液四；
58.pbs的配制：8g nacl+0.2g kcl+1.15g na2hpo3+0.2g kh2po3溶于1l去离子水中，ph值调至7.5；
59.(5)dmem-f12培养液重悬底部沉淀，以0.22μm的微孔滤膜滤器过滤，获得牦牛卵泡液外泌体分装成nml/支，n≥1后置于-80℃冰箱保存；
60.dmem/f-12的配制同实施例1。
61.效果验证
62.将实施例1提取的牦牛卵泡液外泌体进行下述检测：
63.1.牦牛卵泡液外泌体的表征
64.1.1透射电子显微镜
65.用透射电子显微镜(tem,ht-7800,hitachi ltd.,tokyo,japan)观察牦牛卵泡液外泌体的形态。取20μl悬液，呈水滴状滴至电镜铜网状栅中，使滴液在铜网上保留片刻(》1min)，磷钨酸溶液负染固定1-10min，滤纸吸干后室温自然晾干，在生物透射电子显微镜下观察并拍照。
66.结果如图1所示，牦牛卵泡液外泌体形态似杯状。
67.1.2纳米颗粒跟踪分析
68.采用动态光散射方法检测，对外泌体粒径分布进行研究，将收集的外泌体用pbs稀释成颗粒浓度为7.7
×
107的密度，0.22μm微孔滤膜过滤后，用纳米颗粒跟踪分析仪zetaview进行分析(nanofcm co.,ltd.,nottingham,uk)。nta粒径分析表明，牦牛卵泡液外泌体的大小主要分布在30～150nm之间(图2)。
69.1.3蛋白免疫印迹检测卵泡液外泌体内富集蛋白
70.通过超速离心得到的外泌体沉淀，用ripa裂解缓冲液在冰上裂解30min，10000
×
g离心5min，收集上清，加入1/3体积4
×
loading buffer于100℃金属浴15min，使蛋白充分变性。
71.冷却后以10μl上样量在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,sds-page)，以分离出目的蛋白，后将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,pvdf)膜上。用5％脱脂牛奶在室温下封闭3小时，一抗tsg101(1:2000,abcam,ab225877)和cd63(1:2000,abcam,ab193349)4℃过夜，pbst清洗5min
×
8次，二抗室温孵育50min，pbst清洗10min
×
4次，电化学发光(ecl)试剂盒进行曝光1～2min，待蛋白条带清晰时拍照分析。利用image pro plus软件测得蛋白条带的iod值，根据iod值分析蛋白的相对表达量(蛋白表达量＝目的iod/内参iod)。
72.蛋白免疫印迹结果如图3所示，表明其能特异性表达外泌体标志性蛋白cd63和
tsg101，证明已成功分离牦牛卵泡液外泌体。
73.2.牦牛卵泡液外泌体提高卵子发育潜能
74.将实施例1制备的牦牛卵泡液外泌体用pkh26标记后应用在牦牛卵母细胞体外培养中，实验方法具体为：对照组不添加外泌体，实验组将牦牛卵泡液外泌体(1.15
×
107particles/ml)添加至培养液中与cocs共培养(1.15
×
107particles/ml，m199+10％fbs+50μg/ml lh+100μg/ml fsh+100μg/ml e2+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，培养条件为湿度饱和、38.5℃和5％co2，24h后在光学显微镜下观察牦牛卵丘卵母细胞复合体对卵泡液外泌体的摄入情况(图4)，并对成熟卵母细胞进行统计，统计结果见表1。
75.表1外泌体对牦牛卵母细胞的成熟率影响
[0076][0077]
数据以四个独立实验的平均值
±
标准误表示，同一列中的不同字母(a、b)上标表示差异显著(p《0.05)。
[0078]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法，其特征在于，将牦牛卵泡液超速离心后，取沉淀重悬、过滤，获得所述牦牛卵泡液外泌体。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：收集牦牛卵泡液，第一次离心后取上清液一；将上清液一第二次离心取上清液二，之后经第一次超速离心得沉淀一，将沉淀一重悬后第二次超速离心得沉淀二，之后重悬、过滤，获得所述牦牛卵泡液外泌体。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述第一次离心的条件为：500-800g，4℃离心10-15min；所述第二次离心为10000-12000g，4℃离心15-20min。4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述第一次超速离心和第二次超速离心的条件均为100000-150000g、4℃超速离心80-90min。5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述沉淀一用pbs溶液进行重悬，所述pbs溶液包括以下重量组分：8gnacl、0.2gkcl、1.15gna2hpo3和0.2gkh2po3，用水补足至1l。6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述沉淀二的重悬操作为：利用dmem-f12培养液进行重悬；所述过滤具体为以0.22μm的微孔滤膜滤器过滤。7.一种如权利要求1-6任一项所述的提取方法获得的牦牛卵泡液外泌体。8.一种如权利要求7所述的牦牛卵泡液外泌体在制备提高卵子发育能力的药物中的应用。9.一种增强卵子发育潜能的药物，其特征在于，包含权利要求7所述的牦牛卵泡液外泌体。

技术总结
本发明公开了一种牦牛卵泡液外泌体的提取方法及其应用，属于外泌体技术领域。该提取方法将收集的牦牛卵泡液，第一次离心后取上清液一；将上清液一第二次离心取上清液二，之后经第一次超速离心得沉淀一，将沉淀一重悬后第二次超速离心得沉淀二，之后重悬、过滤，获得所述牦牛卵泡液外泌体。本发明提供了一种简单且对技术要求不高的卵泡液外泌体提取方法，并经实验证实该提取方法成功分离牦牛卵泡液外泌体，且得到的外泌体能够提高牦牛卵母细胞成熟率，增强卵子发育潜能，为牦牛的辅助繁殖提供新思路。新思路。新思路。


技术研发人员：潘阳阳 许瑞华 王靖雷 余四九 崔燕 刘斌 王萌 王立斌
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/1