一种快速检测血清视黄醇含量的方法

1.本发明涉及一种快速检测血清视黄醇含量的方法，主要通过酶免疫分析检测血清中视黄醇的含量，属于分子检测技术或医学技术领域。


背景技术：

2.维生素a缺乏是世界范围内一个重要的公共卫生问题。视黄醇作为维生素a的其中一种活性形式，其血清含量与维生素a水平密切相关。视黄醇结合蛋白(rbp)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。研究表明，rbp与全反式视黄醇结合性较高，在血清中与视黄醇呈约1：1摩尔相关，因此被认为可以作为视黄醇的替代标记物。此外，rbp比视黄醇对环境条件更有抗性，可以通过末梢毛细血管采血法收集血斑，可以使用酶联免疫分析法对其进行检测，并且rbp在不同人群中与血清视黄醇有极好的相关性，因此用rbp含量检测计算血清视黄醇含量具有较高的可靠性。
3.高效液相色谱(hplc)分析是定量血清视黄醇的传统检测方法，常用于血清维生素水平的检测。但是，hplc检测法存在包括分析过程较复杂、操作要求高、成本高昂、后处理时间长等限制因素，导致其在大规模人口的快速筛查中可操作性较低，极大限制了维生素a缺乏症的流行病学评估速率。因此，需要探索一种开发快速、经济和可靠的检测方法，用以解决hplc分析存在的局限性。酶联免疫方法是将特异抗原-抗体免疫学反应与酶学催化反应进行结合，根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析，灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强。
4.运用酶联免疫方法测定视黄醇结合蛋白(rbp)与常规的hplc分析法相比，具有以下优点：(1)快速，简便：hplc分析被广泛认为是检测视黄醇含量可靠性和准确度、精确度较高的一种方法。但是常规hplc检测流程复杂且所需仪器昂贵，普适性不高，需要前期具有高度熟练度的技术人员。而酶免疫分析对于操作过程要求较简单，整体实验操作难度较低，尤其适合大规模流行病学筛查时对视黄醇含量的检测。(2)易于运输和保存：hplc分析所需的血液样本须及时的进行血清分离，并置于严格的避光环境中，保存要求较高。酶免疫分析用到的滤纸卡血斑样本和干燥盒无需特殊的保存环境且易于运输。
5.因此，基于以上的检测问题，本领域的研究人员亟需对现有基于酶免疫法的视黄醇结合蛋白检测程序进行优化，从而更加快速，准确的检测血清视黄醇含量。


技术实现要素：

6.本发明提供一种快速检测血清视黄醇含量的方法，它是基于酶免疫分析检测血清视黄醇结合蛋白的方法，以解决传统检测过程中存在的部分问题，能够降低血清视黄醇结合蛋白含量检测过程中混杂因素的干扰作用并可以提高反应灵敏度。
7.一种快速检测血清视黄醇含量的方法，它是通过检测血清视黄醇结合蛋白的含量进行代替，其步骤是：
8.步骤一：样本采集，对参与者的第三或第四个手指进行酒精消毒，用无菌的、可伸
缩的刺刀穿刺，流出的血滴自由地落在滤纸卡上预印的圆圈内作为样本，样本滤纸卡被放置在含有干燥剂的不透明的干燥盒中，以加速干燥；用湿度指示卡监测盒子内的湿度，必要时在盒子中添加额外的干燥剂袋，以保持滤纸卡干燥；在干燥盒中干燥一夜后，滤纸卡被单独包装在含有干燥剂和湿度指示卡的低透气性塑料自封袋中，并在4
°
至8℃下保存在电池操作的便携式冰箱中；干燥后的血斑在采集后7至10天内被送到实验室存储在-20℃环境中，直到分析；
9.步骤二：样本前处理，使用scanlisa rbp测定法对rbp进行定量；除去离子水外，所有试剂均作为化验试剂盒的一部分提供；该试验使用纯化的人rbp吸附到微测试条孔中以与血清中发现的天然rbp竞争；为了进行分析，从两个干血斑圆圈的中心取一个1/4英寸冲头，放入微型离心管中，并添加300μl样品稀释液，每1/4英寸为150μl冲头；将样品涡旋20秒，低温中速离心2分钟，并在4℃至8℃下洗脱18至20小时，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；
10.步骤三：样本处理，样品和试剂从冰箱中取出，并在分析前达到室温；首先将640μg/l的标准，用稀释液进行倍比系列稀释成5、10、20、40、80、160、320μg/l共7点标准，各取0.1ml
×
2，再取0.1ml
×
2稀释液作为空白对照；然后将上述标准品和对照品涡旋20秒，低温中速离心2分钟后，分别加入血清视黄醇结合蛋白包被板中；立即加入与辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗rbp抗体；在室温下孵育15分钟，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤后，加入含有明胶或牛血清蛋白(bsa)的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分；加入100μl干血样洗脱液，并在37℃环境下孵育1-2小时；此时酶标板上的抗体与待测样本进行特异性识别结合；再使用磷酸盐缓冲液将未结合的抗原洗掉，反复洗涤4次，拍干；加入血视黄醇结合蛋白酶标记物，然后孵育10分钟，加入中止液盐酸盐溶液以停止反应，最后在450nm处立即在酶联免疫检测仪上读取标准品以及样本的od值，以空白对照管校零；
11.步骤四：数据分析，使用麦哲伦软件根据每个板的最佳拟合校准曲线计算结果，以微克每毫升rbp为单位；利用标准品的od值及其相对应的浓度，以od值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制一条标准曲线，将样本的od值作为x值代入，即可求出y值样本浓度。
12.优选的，步骤二中，测定的批间精密度和批内精密度分别为8.9％和6.7％；定量限为7.7μg/ml rbp，线性度为99.7％。
13.与常规hplc检测视黄醇含量相比，本发明中酶联免疫方法测定视黄醇结合蛋白(rbp)的有益效果在于：
14.(1)血清中视黄醇结合蛋白(rbp)作为一项灵敏的检测指标，与全反式视黄醇结合性较高，在血清中与视黄醇呈约1：1摩尔相关，并且rbp在不同人群中与血清视黄醇有极好的相关性，可作为视黄醇的替代标记物。
15.(2)rbp可以通过末梢毛细血管采血法收集血斑，检测所用的酶免疫分析对于操作过程要求较简单，整体实验操作难度较低，更具快速，简便的优势。
16.(3)rbp比视黄醇对环境条件更有抗性，酶免疫分析中用到的滤纸卡血斑样本和干燥盒无需特殊的保存环境且更易于运输。
附图说明
17.图1是本发明提供的一种检测血清中视黄醇结合蛋白含量的方法的流程图；
18.图2是本发明提供的一种检测血清中视黄醇含量的方法的流程图；
19.图3本发明提供的视黄醇的化学结构式。
具体实施方式
20.下面结合实施例以及对比实施例对本发明作进一步的说明。
21.实施例1
22.如图1所示，一种快速检测血清视黄醇含量的方法，它是通过检测血清视黄醇结合蛋白的含量进行代替，其步骤是：
23.步骤一：样本采集，对参与者的第三或第四个手指进行酒精消毒，用无菌的、可伸缩的刺刀穿刺，流出的血滴自由地落在滤纸卡上预印的圆圈内作为样本，样本滤纸卡被放置在含有干燥剂的不透明的干燥盒中，以加速干燥；用湿度指示卡监测盒子内的湿度，必要时在盒子中添加额外的干燥剂袋，以保持滤纸卡干燥；在干燥盒中干燥一夜后，滤纸卡被单独包装在含有干燥剂和湿度指示卡的低透气性塑料自封袋中，并在4
°
至8℃下保存在电池操作的便携式冰箱中；干燥后的血斑在采集后7至10天内被送到实验室存储在-20℃环境中，直到分析；
24.步骤二：样本前处理，使用scanlisa rbp测定法对rbp进行定量；除去离子水外，所有试剂均作为化验试剂盒的一部分提供；该试验使用纯化的人rbp吸附到微测试条孔中以与血清中发现的天然rbp竞争；为了进行分析，从两个干血斑圆圈的中心取一个1/4英寸冲头，放入微型离心管中，并添加300μl样品稀释液，每1/4英寸为150μl冲头；将样品涡旋20秒，低温中速离心2分钟，并在4℃至8℃下洗脱18至20小时，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；
25.步骤三：样本处理，样品和试剂从冰箱中取出，并在分析前达到室温；首先将640μg/l的标准，用稀释液进行倍比系列稀释成5、10、20、40、80、160、320μg/l共7点标准，各取0.1ml
×
2，再取0.1ml
×
2稀释液作为空白对照；然后将上述标准品和对照品涡旋20秒，低温中速离心2分钟后，分别加入血清视黄醇结合蛋白包被板中；立即加入与辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗rbp抗体；由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面；在室温下孵育15分钟，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤后，加入含有明胶或牛血清蛋白(bsa)的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分；其目的是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行；加入100μl干血样洗脱液(或用样品稀释剂1:25稀释的血清)，并在37℃环境下孵育1-2小时；此时酶标板上的抗体与待测样本进行特异性识别结合；再使用磷酸盐缓冲液将未结合的抗原洗掉，反复洗涤4次，拍干；加入血视黄醇结合蛋白酶标记物，然后孵育10分钟，加入中止液盐酸盐溶液以停止反应，最后在450nm处立即在酶联免疫检测仪上读取标准品以及样本的od值，以空白对照管校零；
26.步骤四：数据分析，使用麦哲伦软件根据每个板的最佳拟合校准曲线计算结果，以微克每毫升rbp为单位；利用标准品的od值及其相对应的浓度，以od值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制一条标准曲线，将样本的od值作为x值代入，即可求出y值样本浓度。
27.实施例2
28.如图2、图3所示，本实施例是传统的检测血清视黄醇含量的方法，其步骤是：
29.步骤(1)标准储存液a制备：视黄醇标准品溶液(107.1
±
5.4mg/l)，开封后，立即使用。临用前用紫外分光光度计校正。
30.步骤(2)内标储存液b制备：取视黄醇乙酸酯标准品10mg，置于10m l容量瓶，用无水乙醇溶解，并定容至10m l，得到视黄醇乙酸酯母液(1000mg/l)，-80℃保存，避光环境。
31.步骤(3)标准工作液c制备：取适量标准储备液a，用无水乙醇进行稀释，得到含2.0mg/l视黄醇的标准工作液，在-80℃条件下保存。
32.步骤(4)内标工作液d制备：取适量内标储备液b，用无水乙醇进行稀释，得到含视黄醇乙酸酯7.5mg/l的内标工作液，-80℃保存，避光环境。
33.步骤(5)标准溶液e的配制：取90μl标准工作液c和10μl混合内标工作液d分别置于离心管中，以离心速度为2000rpm下离心1min，取上清液可以得到标准溶液。
34.步骤(6)待测样本f制备：
①
取100μl血液，置于1.5m l带盖塑料离心管中，用移液枪移取10μl混合内标工作液，放混匀器上约5秒钟混匀后，加入100μl的纯水作为稀释液，以离心速度为2000rpm下离心5min。
②
加入200μl的无水乙醇作为沉淀蛋白试剂，在2000rpm下离心1min。
③
加入500μl的正乙烷作为萃取剂，在2000rpm下离心7min后，再在10000rpm下离心10min.
④
移取离心后一定量的上清液至干净的1.5m l离心管中，再转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干。
⑤
在1.5m l离心管加入100μl的甲醇作为复溶液，在2000rpm下离心1min后，再在10000rpm下离心5min，移取上清液即为待测样本。
35.步骤(7)：利用高效液相色谱仪，岛津lc-20a。在相同检测条件下，分别检测一定量的待测样本f、标准溶液e和内标工作液d，得到并记录对应的色谱图及色谱峰响应值。
36.步骤(8)数据分析：采用内标法计算公式
37.f＝(as/ms)/(ar/mr)(式-1)
38.mi＝f
×
ai/(as/ms)(式-2)
39.其中，式-1中f为校正因子，as和ar分别为内标工作液d和标准溶液e的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标工作液d和标准溶液e的量。式-2中mi为待测样本含量，ai和as分别为待测样本f和内标工作液d的峰面积或峰高，ms为加入内标工作液d的量。
40.标准液和样品的整个处理过程均应在避光室内进行。
41.检测所用仪器条件：
①
色谱柱：安捷伦公司的poroshell 120sb-c18色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm。
②
流动相：甲醇和纯水。
③
洗脱方式：采用梯度洗脱。
④
荧光检测器波长：视黄醇对应的激发波长为325nm，发射波长为470nm，选用最大吸收波长。
42.上述两个实施例，血清中视黄醇结合蛋白(rbp)作为一项灵敏的检测指标，与全反式视黄醇结合性较高，在血清中与视黄醇呈约1：1摩尔相关，并且rbp在不同人群中与血清视黄醇有极好的相关性，可作为视黄醇的替代标记物。

技术特征：
1.一种快速检测血清视黄醇含量的方法，其特征是：它是通过检测血清视黄醇结合蛋白的含量进行代替。2.根据权利要求1所述的检测血清视黄醇结合蛋白的含量，其步骤是：步骤一：样本采集，对参与者的第三或第四个手指进行酒精消毒，用无菌的、可伸缩的刺刀穿刺，流出的血滴自由地落在滤纸卡上预印的圆圈内作为样本，样本滤纸卡被放置在含有干燥剂的不透明的干燥盒中，以加速干燥；用湿度指示卡监测盒子内的湿度，必要时在盒子中添加额外的干燥剂袋，以保持滤纸卡干燥；在干燥盒中干燥一夜后，滤纸卡被单独包装在含有干燥剂和湿度指示卡的低透气性塑料自封袋中，并在4
°
至8℃下保存在电池操作的便携式冰箱中；干燥后的血斑在采集后7至10天内被送到实验室存储在-20℃环境中，直到分析；步骤二：样本前处理，使用scanlisa rbp测定法对rbp进行定量；除去离子水外，所有试剂均作为化验试剂盒的一部分提供；该试验使用纯化的人rbp吸附到微测试条孔中以与血清中发现的天然rbp竞争；为了进行分析，从两个干血斑圆圈的中心取一个1/4英寸冲头，放入微型离心管中，并添加300μl样品稀释液，每1/4英寸为150μl冲头；将样品涡旋20秒，低温中速离心2分钟，并在4℃至8℃下洗脱18至20小时，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；步骤三：样本处理，样品和试剂从冰箱中取出，并在分析前达到室温；首先将640μg/l的标准，用稀释液进行倍比系列稀释成5、10、20、40、80、160、320μg/l共7点标准，各取0.1ml
×
2，再取0.1ml
×
2稀释液作为空白对照；然后将上述标准品和对照品涡旋20秒，低温中速离心2分钟后，分别加入血清视黄醇结合蛋白包被板中；立即加入与辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗rbp抗体；在室温下孵育15分钟，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤后，加入含有明胶或牛血清蛋白(bsa)的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分；加入100μl干血样洗脱液，并在37℃环境下孵育1-2小时；此时酶标板上的抗体与待测样本进行特异性识别结合；再使用磷酸盐缓冲液将未结合的抗原洗掉，反复洗涤4次，拍干；加入血视黄醇结合蛋白酶标记物，然后孵育10分钟，加入中止液盐酸盐溶液以停止反应，最后在450nm处立即在酶联免疫检测仪上读取标准品以及样本的od值，以空白对照管校零；步骤四：数据分析，使用麦哲伦软件根据每个板的最佳拟合校准曲线计算结果，以微克每毫升rbp为单位；利用标准品的od值及其相对应的浓度，以od值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制一条标准曲线，将样本的od值作为x值代入，即可求出y值样本浓度。3.根据权利要求2所述的检测血清视黄醇结合蛋白的含量，其特征是：步骤二中，测定的批间精密度和批内精密度分别为8.9％和6.7％；定量限为7.7μg/ml rbp，线性度为99.7％。

技术总结
本发明公开了一种快速检测血清视黄醇含量的方法，它是通过检测血清视黄醇结合蛋白的含量进行代替，其步骤是：样本采集，样本前处理，使用SCANLISA RBP测定法对RBP进行定量；样本处理，步骤四：数据分析，使用麦哲伦软件根据每个板的最佳拟合校准曲线计算结果。本发明血清中视黄醇结合蛋白(RBP)作为一项灵敏的检测指标，与全反式视黄醇结合性较高，在血清中与视黄醇呈约1：1摩尔相关，并且RBP在不同人群中与血清视黄醇有极好的相关性，可作为视黄醇的替代标记物。替代标记物。替代标记物。


技术研发人员：余增丽 高攀攀 张欢欢 薄亚聪 寇广宁 刘智勇 张亚欣 刘小转 高湛 米阳 陈瑶
受保护的技术使用者：郑州大学第五附属医院
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/8/1